Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ ВЕРХНЕЙ ЧЕЛЮСТИ: ФРОНТОНАЗАЛЬНАЯ ЭКТОДЕРМАЛЬНАЯ ЗОНА

Роль клеток нервного гребня

Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation
Diane Hu, Ralph S. Marcucio
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 4, pages 732–740, April 2012

Background: Multiple fibroblast growth factor (Fgf) ligands are expressed in the forebrain and facial ectoderm, and vascular endothelial growth factor (VEGF) is expressed in the facial ectoderm. Both pathways activate the MAP kinase cascade and can be suppressed by SU5402. We placed a bead soaked in SU5402 into the brain after emigration of neural crest cells was complete. Results: Within 24 hr we observed reduced pMEK and pERK staining that persisted for at least 48 hr. This was accompanied by significant apoptosis in the face. By day 15, the upper beaks were truncated. Molecular changes in the FNP were also apparent. Normally, Shh is expressed in the frontonasal ectodermal zone and controls patterned growth of the upper jaw. In treated embryos, Shh expression was reduced. Both the structural and molecular deficits were mitigated after transplantation of FNP-derived mesenchymal cells. Conclusions: Thus, mesenchymal cells actively participate in signaling interactions of the face, and the absence of neural crest cells in neurocristopathies may not be merely structural. Developmental Dynamics 241:732–740, 2012. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.


Рисунки к статье

Передача молекулярных сигналов между тканями регулирует сложный процесс эмбриогенеза позвоночных. Во время развития верхней челюсти, переднего мозга мезенхимы нервного гребня и лицевой эктодермы контролируется клеточным поведением, которое формирует паттерн скелета. Передача сигналов SHH в переднем мозге помогает устанавливать frontonasal ectodermal zone (FEZ) iв поверхностной цефалической эктодерме (Marcucio et al.,2005). Этот сигнальный центр регулирует проксимо-дистальное расширение и дорсо-вентральную полярность верхней челюсти (Hu et al.,2003; Depew and Simpson,2006; Depew and Compagnucci,2008; Hu and Marcucio,2009a), частично путем регуляции паттерна экспрессии генов и контроля скорости и расположения пролиферации клеток в мезенхиме (Hu and Marcucio,2009b). Наши предыдущие работы были сфокусированы на рол SHH в обеспечении передачи сигналов от головного мозга. Здесь мы расширили наше понимание этих взаимодействий путем блокирования передачи сигналов посредством рецепторов, которые активируют путь MAP kinase после эмиграции клеток нервного гребня из нервной трубки.
Передача сигналов FGF необходима для нормального развития челюстей (Crossley and Martin,1995; Tucker et al.,1999; Mina et al.,2002,2007). Множественные FGF рецепторы и лиганды экспрессируются в ходе всего развития лица (Matovinovic and Richman,1997; Wilke et al.,1997; Bachler and Neubuser,2001; Hu et al.,2003). В регионе развивающейся верхней челюсти Fgf8 первоначально экспрессируется в непрерывном домене, который простирается в передний нейральный эпителий и поверхностную цефалическую эктодерму, которая должна покрывать фронто-назальный отросток (FNP). После закрытия переднего нейропора этот домен подразделяется на самостоятельные телэнцефалические и эктодермальные домены. Когда клетки нервного гребня прибывают в FNP примерно на Hamburger Hamilton стадии 20 (HH20) (Hamburger and Hamilton,1951), индуцируется экспрессия Shh в цефалической эктодерме и формирует границу с Fgf8-экспрессирующими клетками (Hu et al.,2003; Hu and Marcucio,2009b). Вскоре после начала экспрессии Shh, транскрипты Fgf8 подавляются по срединной линии и оказываются ограниченными носовыми ямками, где он экспрессируется совместно с Fgf9, Fgf10, и Fgf18 (Karabagli et al., 2002; Havens et al., 2006). Однако нарушение продукции одиночного лиганд, Fgf8, вызывает тяжелые лицевые уродства у мышей, подтверждая, что это главный фактор, вносящий вклад в контроль лицевого морфогенеза (e.g., Storm et al.,2003,2006). Fgf рецепторы присутствуют в мезенхимных клетках, включая клетки нервного гребня из FNP, начиная, по крайней мере, с HH10 и сохраняясь в течение всего роста FNP (Wilke et al.,1997), а передача сигналов FGF регулирует экспрессию разнообразных генов в мезенхиме FNP (Firnberg and Neubuser,2002; Szabo-Rogers et al.,2008; Higashihori et al.,2010).
Измененная передача сигналов FGF вызывает уродства во время развития лица. Блокирование передачи сигналов FGF в лицевой мезенхиме во время периода роста ведет к гипоплазии производных верхнечелюстных отростков (Szabo-Rogers et al.,2008,2009; Hu and Marcucio,2009a). Сходным образом у мышей систематическое снижение передачи сигналов Fgf8 коррелирует с жизнеспособностью клеток и градированными дефектами в переднем мозге (Storm et al.,2003,2006). Мутации в FGF лигандах и рецепторах ассоциируют с расщеплением губы и нёба у людей (Riley and Murray,2007). Наконец, эти данные в комбинации с важностью передачи сигналов FGF в развитии, привели к идее, что мутации или нарушения передачи сигналов FGF могут вносить вклад в нейрокристопатии (Etchevers et al.,2006).
Нашей целью было блокирование активации передачи сигналов Fgf, используя низкомолекулярный ингибитор, SU5402. Помимо блокирования передачи сигналов Fgf SU5402 блокирует также активацию VEGF (Flk) рецепторов (Sun et al.,1999) и оба пути активируют каскад MAP kinase (Takahashi et al.,1999; Ribisi et al.,2000). В то время как передача сигналов Fgf хорошо изучена, менее известно о роли передачи сигналов vascular endothelial growth factor (VEGF) во время лицевого развития. Недавнее сообщение показало, что VEGF экспрессируется в поверхностной цефалической эктодерме и передает сигналы соседним мезенхимным клеткам посредством рецептора Neuropilin-1, чтобы регулировать миграцию клеток нервного гребня в лицевые выпячивания (McLennan et al.,2009). Далее, передача сигналов VEGF необходима для формирования сосудистой системы посредством рецепторов Flt и Flk у мышей (Gerber et al., 1999).
В данной работе мы нарушали передачу сигналов Fgf и VEGF и исследовали эффекты на развитие фронто-назального отростка (FNP) и его производные, помещая кусочек, смоченный SU5402 в головной мозг и затем исследуя эффекты на миграцию нервного гребня в FNP, развитие сосудистой сети, лицевую морфологию и ассоциированные молекулярные изменения. Затем мы оценивали способность экзогенных мезенхимных клеток, происходящих из FNP, устранять молекулярные и морфологические дефекты. Наши результаты показали, что уменьшение мезенхимных клеток является лишь единственным компонентом генерации уродств и что вытекающие молекулярные изменения могут лежать в основе болезненного фенотипа в голове.

DISCUSSION


Введение кусочков, смоченных SU5402, в головной мозг во время ранних стадий развития лица создает уродства верхней челюсти. Наше воздействие, скорее всего, блокировало передачу сигналов Fgf и VEGF как из нейральной, так и поверхностной эктодермы в FNP. В данном эксперименте клетки нервного гребня, мигрирующие в FNP, подвергались массовому апоптозу. Кроме того, сосудистая сеть была тяжело нарушена у обработанных эмбрионов, это, скорее всего, создает локальные регионы ишемии в голове. В самом деле, у наших химерных эмбрионов мы наблюдали огромный вклад донорских клеток перепела в сосудистую сеть головы, подтверждая тем самым, что восстановление кровотока может играть роль в восстановлении обработанных эмбрионов. Однако это не было исследовано детально в данной работе.
Морфологические изменения возникающие в результате воздействия SU5402 обнаруживались, начиная с первых 24 ч воздействия. Однако апоптоз не полностью элиминировал популяцию клеток нервного гребня из FNP. Спустя 96 ч после воздействия (~HH22), рост FNP становится очевидным, т.к. выживающие или регенерировавшие клетки нервного гребня заполняли эту область. Несмотря на это, верхняя челюсть была сильно укорочена и скелет полностью отсутствовал на 15 день, это показало нам, что уродства не просто результат уменьшения количества клеток предшественников. В самом деле, FEZ образуется неправильно у обработанных эмбрионов; экспрессия Shh была изменена и комбинация пониженного количества клеток и аномальной FEZ зоны создает тяжелые уродства верзней челюсти у этих эмбрионов.

Effect of FGF and VEGF Signaling During Jaw Development


Передача сигналов FGF и VEGF необходима в нервном гребне во время миграции в FNP и фарингеальных дугах. Снижение передачи сигналов FGF у эмбрионов мышей ведет к обширному апоптозу переднего мозга и соседних клеток нервного гребня (Storm et al.,2003). Роль передачи сигналов FGF нечто большее, чем фактор жизнеспособности; FGF8 участвует в регуляции миграции клеток нервного гребня в FNP. Воздействие FGF-смоченных кусочков на эмбрионы после устранения предшественников нервного гребня устраняет дефицит,вызываемый у эмбрионов за счет стимуляции регенерации и миграции клеток нервного гребня в FNP (Creuzet et al.,2004). Передача сигналов FGFs также регулирует пролиферацию и дифференцировку мезенхимы нервного гребня. Передача сигналов FGF от носовых ямок контролирует жизнеспособность и пролиферацию мезенхимы нервного гребня, которая должна формировать латеральные аспекты верхней челюсти (Song et al.,2004; Szabo-Rogers et al.,2008,2009). Недавнее сообщение иллюстрирует роль, которую играет VEGF во время лицевого развития. Воздействие эктопического VEGF на лицевую часть эмбрионов действует как хемоаттрактант для клеток нервного гребня, мигрирующих из нервной трубки (McLennan et al.,2009). В наших экспериментах, мы не смогли отличить роль FGF и VEGF по отдельности, поскольку оба пути блокируются при нашем воздействии. Однако наблюдаемые фенотипы, по-видимому, появляются в результате массивного апоптоза, а не изменённой миграции, подтверждая, что передача сигналов Fgf была существенно нарушена в этих экспериментах.

Autonomous Versus Induced Molecular Properties of the FEZ


Мы первоначально определили зону FEZ , исходя из накладывающихся доменов экспрессии Shh и Fgf8 (Hu et al.,2003). Однако существует серия сигнальных молекул, которые, скорее всего, обеспечивают функцию этой ткани, включая: Bmp2, Bmp4, Bmp7 и Wnt9b среди прочих (Wall and Hogan,1995; Barlow and Francis-West,1997; Ashique et al.,2002; Lan et al.,2006; Foppiano et al.,2007; Merrill et al.,2008). Экспрессия этих молекул и Fgf8, по-видимому, автономна в цефалической эктодерме (e.g., Shigetani et al.,2000). Мы не выявили крупных изменений в паттернах экспрессии этих молекул после обработки эмбрионов SU5402, хотя Fgf8 сохранялся в течение более длительных периодов времени в FEZ у SU5402-обработанных эмбрионов, возможно из-за отсутствия противодействующего сигнала от SHH. Сходным образом, экспрессия этих молекул оказывалась неизменной после блокирования или активирования передачи сигналов SHH внутри головного мозга (Marcucio et al.,2005; Hu and Marcucio,2009a). Эти данные иллюстрируют, что имеется базовая программа (blueprint) которая внутренне присуща поверхностной эктодерме лица.
Напротив, экспрессия Shh нуждается в сигналах от многих источников во время развития верхней челюсти. Передача сигналов SHH от головного мозга к эктодерме до прибытия клеток нервного гребня внутри FNP необходима для экспрессии Shh в FEZ (Marcucio et al.,2005; Eberhart et al.,2006; Chong et al., 2012).Предыдущая работа подтвердила, что дополнительный сигнал добавляется клетками нервного гребня (Eames and Schneider,2005; Marcucio et al.,2005; Eberhart et al.,2008). В нашей конкурентной работе два набора данных подтверждают это утверждение. Bo-первых, экспрессия Shh наблюдается только в эктодерме, которая расположена по соседству с клетками нервного гребня у эмбрионов, обработанных SU5402. Во-вторых, трансплантация клеток нервного гребня от необработанных эмбрионов стимулирует экспрессию Shh в FEZ и устраняет нарушения верхней челюсти. Эти данные предоставляют неотразимые доказательства, что клетки нервного гребня участвуют в индукции экспрессии Shh в FEZ.
Понимание прирожденных и не клеточно автономных свойств эктодермы довольно несложно. Однако, определение роли каждой молекулы во время развития верхней челюсти более затруднительно. Наша работа (Foppiano et al.,2007; Hu and Marcucio,2009a,b) и работы др. (Jeong et al.,2004; Welsh and O'Brien,2009) подтвердили, что передача сигналов SHH от эктодермы является ключевым регуляторным фактором, который контролирует рост м морфогенез верхней челюсти. Во время развития вторичного нёба паттерны экспрессии Shh соответствуют длине верхней челюсти. В этой работе авт. продемонстрировали, что ruggae покрывающие нёбные половинки, действуют как сигнальные центры, а Shh, экспрессируемый в ruggae является ключевым сигналом, которые регулирует удлинение в проксимо-дистальном направлении (Welsh and O'Brien,2009). Эти данные согласуются с нашей предыдущей работой. После блокирования передачи сигналов SHH в головном мозге, мы наблюдали значительные морфологические отклонения в верхней челюсти (Marcucio et al.,2005). Однако, только достоверные молекулярные изменения, которые мы наблюдали, это было отсутствие экспрессии Shh в FEZ. Далее, блокирование способности клеток нервного гребня отвечать на SHH сигналы вызывает сходные нарушения (Jeong et al.,2004). Т.о., SHH из эктодермы, по-видимому, является критическим сигналом, которые регулирует морфогенез верхней челюсти.

Role of Neural Crest Cells in Controlling Morphogenesis of the Face


Наши результаты выявили фундаментальный механизм, с помощью которого клетки нервного гребня могут контролировать морфогенез лица. Клетки нервного гребня участвуют в формировании паттерна верхней челюсти. Мы предлагаем двухступенчатую модель индукции экспрессии Shh в FEZ. Во-первых, передача сигналов SHH из переднего мозга стимулирует способность эктодермы экспрессировать Shh. Этот сигнал может устанавливать регионы, которые компетентны экспрессировать Shh (Hu and Marcucio,2009a). После того как клетки нервного гребня достигают FNP они индуцируют экспрессию Shh в FEZ. Мы продемонстрировали, что передача сигналов BMP внутри нервного гребня необходима для начала экспрессии Shh в FEZ (Foppiano et al.,2007). Является ли это непосредственным результатом передачи сигналов BMP из нервного гребня в эктодерму, неизвестно. Тем не менее, когда начинается экспрессия Shh в FEZ, то инициируется проксимо-дистальное удлинение верхней челюсти за счет контроля паттернов экспрессии генов, которые ответственны за рост и развитие скелета верхней челюсти (Hu and Marcucio,2009b).
Различия в пространственной организации экспрессии Shh в FEZ соответствуют разным характеристикам роста, наблюдаемым у эмбрионов птиц и млекопитающих. У птиц экспрессия Shh распространяется на всю медиолатеральную ширину FNP, но у эмбрионов млекопитающих экспрессия Shh ограничивается латеральными регионами (Hu and Marcucio,2009b). Сигналы от головного мозга участвуют в становлении правильного пространственного паттерна экспрессии Shh в FEZ. Когда активируется передача сигналов SHH в головном мозге птиц, FEZ расщепляется на два домена и рост напоминает таковой, наблюдаемый у млекопитающих. Интересно, что у эмбрионов, обработанных SU5402 домен экспрессии Shh в FEZ часто расщеплен на два латеральных домена и лицо выглядит как у млекопитающих. Такой вид возникает в результате аномального распределения клеток нервного гребня у обработанных эмбрионов кур. Более высокие количества клеток нервного гребня оказываются локализованными в латеральных регионах по сравнению с медиальными регионами верхней челюсти у обработанных эмбрионов кур, а эктодерма, соседствующая с этими клетками нервного гребня экспрессирует Shh. Та же самая организация наблюдается у эмбрионов млекопитающих и регионализация клеток нервного гребня может помогать регулировать уникальный паттерн экспрессии Shh, который различен в лицевой части птиц и млекопитающих. Исходя из этих наблюдений, мы приходим к выводу что иерархические события передачи сигналов между головным мозгом, нервным гребнем и лицевой эктодермой действуют, чтобы осуществить морфологическую диверсификацию, которая наблюдается во время или эволюции или болезни.