Дифференцированное состояние соматических клеток рассматривается как высоко стабильное. Во время эмбриогенеза онтогенетически пластичные стволовые клетки становятся специфицированными, детерминированными и в конечном счете ограничены определенным клеточным клоном высоко скоординированным образом. Став дифференцированными соматические клетки очень редко меняют одно дифференцированное состояние на др. Если этио происходит, то часто связано с болезнью и в особенности с раковой трансформацией. Дифференцированное состояние соматических клеток может быть обращено экспериментально в др. тип клеток с помощью процесса т.наз. 'ядерного репрограммирования' (Gurdon and Melton, 2008). Ядерное репрограммирование проще всего может быть определено как 'процесс, с помощью которого дифференцированное состояние клетки изменяется в др. подобное состояние'. Это может быть связано с обращением дифференцированных клеток к состоянию повышенной онтогенетической пластичности ('дедифференцировке'), или переключения с одного дифференцированного типа клеток на др. ('трансдифференцировка' или 'прямое репрограммирование'). В своей наиболее крайней форме, терминально дифференцированные клетки могут быть репрограммированы в состояние тотипотентности, так что они становятся способны к развитию в новое взрослое животное.

Характеристики каждой клетки предопределены с помощью экспрессии клон-специфических генов, которые определяют клеточные характеристики (клеточный фенотип). Поэтому, чтобы изменить определенные качественные особенности клетка д. переключиться на новые клон-специфические гены и выключить старые гены. В результате изменяются паттерны транскрипции , лежащие в основе перепрограммирования, как и в случае нормального развития. Репрограммирование соматических клеток поэтому использует перенастройку эпигенетических механизмов, которые которые поддерживают стабильность генной экспрессии, таких как метилирование ДНК и модификации гистонов (Pasque et al., 2011). Также происходят изменения в профилях генной экспрессии, успешное ядерное репрограммирование использует множество др. фундаментальных изменений в функции клеток, такие как репликация ДНК, ядерная организация, деления и метаболизм клеток. Экспериментальная индукция репрограммирования дает исследователям промежуток времени для понимания этих фундаментальных аспектов клеточной биологии.

Помимо использования технологии репрограммирования в качестве инструмента для понимания фундаментальной биологии, репрограммирование соматических клеток обладает значительными потенциалом для медицины. Недавние успехи в области репрограммирования привели к разработке ряда моделей болезней человека, созданных с помощью репрограммирования больных соматических клеток (Wu and Hochedlinger, 2011; Yamanaka, 2012). Это неоценимо для понимания и борьбы с рядом болезней человека. Использование репрограммированных клеток человека также пре6доставляет этически привлекательный источник аутологичных тканей человека для заместительной терапии (Wu and Hochedlinger, 2011).

Nuclear reprogramming by nuclear transfer to eggs (meiotic metaphase II oocytes)

Перенос ядер связан с физической трансплантацией одиночного ядра в мейотической метафазе II арестованного яйца (или 'MII ооцита' у млекопитающих), обычно после удаления из воспринимающего ядра генетического материала. Это был первый метод, с помощью которого клонировали впервые амфибий, а позднее и млекопитающих (Gurdon et al., 1958; Wakayama et al., 1998; Wilmut et al., 1997) и он часто наз. 'somatic cell nuclear transfer' (SCNT). Эта процедура первоначально использовалась для становления концепции консервации генома во время развития (Briggs and King, 1952; Gurdon et al., 1958). Эти ранние эксперименты продемонстрировали также, что клонирование животных возможно. Пере6нос ядра был успешно использован для репрограммирования у многих разных видов (Byrne et al., 2007; Cibelli, 2007; Noggle et al., 2011; Wakayama and Yanagimachi, 1999) и большая часть наших знаний по репрограммированию получена в экспериментах с использованием этих систем (rev. Gurdon and Wilmut, 2011). Клонируемые эмбриональные клетки, возникающие в результате этой процедуры могут быть также получены и культивируемы in vitro. С помощью этого способа возможно управлять embryonic stem cells (ESCs), клонируемые от эмбрионов млекопитающих (Byrne et al., 2007; Noggle et al., 2011; Yang et al., 2007). Такие культивируемые эмбриональные клетки могут быть также дифференцированы в различные типы взрослых клеток (Wakayama et al., 2001).

Ядерное репрограммирование с помощью этого пути считается 'воспроизводящим' естественное оплодотворение; ооцит пытается репрограммировать поступившее соматическое ядро в основном тем же самым способом, как если бы он репрограммировал отцовский геном при оплодотворении (Gao et al., 2007). Репрограммирование с помощью SCNT опосредуется с помощью естественных компонент яйца и использует экстенсивную репликацию ДНК и клеточные деления (Jullien et al., 2011). Этот постоянно меняющийся ядерный ландшафт и практические ограничения SCNT делают изучение ранних транскрипционных изменений, участвующих в репрограммировании довольно трудным (Jullien et al., 2011).

Эффективность SCNT, как показывает генерация полностью нормальных животных, низка, ниже ~1-2% , когда используются соматические ядра взрослых в качестве донора (Yang et al., 2007). Кроме того, некоторые клоны могут обнаруживать ряд аномалий на фенотипическом, молекулярном и физиологическом уровне (Wilmut et al., 2002; Yang et al., 2007). Низкая эффективность и аномалии, скорее всего, могут быть приписаны неспособности к полному репрограммированию генома донора, это отражает 'стабильность дифференцировки', наблюдаемой в клетках взрослых. Это иллюстрируется с помощью феномена 'эпигенетической памяти', при котором 'память' об экспрессии генов донорской клетки сохраняется некоторыми клетками возникающих в результате клонируемых эмбрионов. Это обусловлено частично неполной перестройкой эпигенетических факторов, таких как метилирование ДНК и варианты гистонов в ядре донора (Ng and Gurdon, 2007).

Direct transcriptional reprogramming by nuclear transfer to prophase I amphibian oocytes

Модифицированная форма SCNT использует трансплантацию множественных соматических ядер в увеличенное ядро [наз. germinal vesicle (GV)] развивающихся ооцитов амфибий. Эти крупные незрелые ооциты арестовываются в мейотической профазе I и подвергаются интенсивной продукции материнских транскриптов и белков, которые будут необходимы для поддержания раннего эмбрионального развития вплоть до активации зиготического генома (Gao et al., 2002).

Отсутствуют репликация ДНК или клеточные деления при этом пути репрограммировании и как результат не генерируются новые типы клеток. Имеется, однако, существенная реактивация транскрипции определенных молчащих генов в течение нескольких часов (Halley-Stott et al., 2010). С помощью этой процедуры молчащие гены [такие как гены плюрипотентности Oct4 (Pou5f1) и Sox2] в ядрах соматического донора оказываются непосредственно активированы в отсутствие клеточных делений и белкового синтеза (Halley-Stott et al., 2010). Ооцит будет транскрипционно репрограммировать ядра др. видов (мышей, напр.), это позволяет отличать вновь синтезированные транскрипты от материнского содержимого ооцита с помощью идентификации последовательностей.

Используя эту систему возможно исследовать условия, которые необходимы для обеспечения активации молчащих генов, 'транскрипционного репрограммирования'. Крупные размеры ооцита Xenopus и легкость манипуляций с эндогенными факторами репрограммирования с помощью избыточной экспрессии или нокдауна, делают эту систему мощным инструментом для изучения репрограммирования в транскрипционном контексте. k

Reprogramming by cell fusion

Транскрипционные изменения в соматических клетках могут быть достигнуты слиянием плазматических мембран разных типов клеток. Использование эмбриональных 'доминантных' клеток, таких как ESCs, чтобы репрограммировать соматические клетки, может вызывать транскрипцию генов, связанных с плюрипотентностью при правильных условиях (Yamanaka and Blau, 2010). После слияния яда обоих типов клеток могут оставаться разделенными в общей цитоплазме (образование гетерокариона) или после митоза будут сливаться ядра, образуя гибридный геном (синкарион). В случае ранних гетерокарионов, как полагают, не происходит клеточных делений и прямой трансактивации генов в чувствительных клетках (Chiu and Blau, 1984), хотя роль синтеза ДНК во время репрограммирования в гетерокарионах спорна (Tsubouchi et al., 2013). Напротив, синкарионы подвергаются репликации ДНК и клеточному делению, формирующим гибридный геном из смеси генетического материала обоих исходных ядер, хотя часто хромосомы одного геном теряются (Yamanaka and Blau, 2010).

Как и в случае с ядерным репрограммированием ооцитов на стадии GV, репрограммирование с помощью гетерокарионов также может быть осуществлено внутри вида и между видами (Yamanaka and Blau, 2010). Последний случай позволяет исследователям легко отслеживать изменения в транскрипции в чувствительных воспринимающих ядрах без внесения сигналов от 'carry-over' транскрипта, происходящего из доминантной клетки. Более того, способность манипулировать как с чувствительной так и доминантной клеткой с использованием стандартной техники культивирования клеток делает слияние клеток пригодным для изучения механизмов, которые лежат в основе ранних стадий репрограммирования (Piccolo et al., 2011).

Reprogramming by extract treatment

Репрограммирование может быть также достигнуто, по крайней мере, частично путем обработки ставших проницаемыми клеток с помощью белковых экстрактов, которые приготовлены, напр., из плюрипотентных клеток (Taranger et al., 2005). Плазматическая мембрана проницаемых клеток может быть затем снова запечатана, а культивирование клеток приведет к экспрессии ранее молчащих генов. Такое репрограммирование, как полагают, д. быть связано с клеточным делением и репликацией ДНК в большинстве примеров. Как и при др. процедурах репрограммирования, эффективность репрограммирования на базе экстрактов низкая (Bru et al., 2008).

Привлекательным аспектом репрограммирования является способность биохимического внесения и удаление факторов репрограммирования в или из экстракта. Более того, использование экстракта предоставляет возможности биохимического фракционирования, что позволяет исследователям идентифицировать новые факторы репрограммирования (Singhal et al., 2010). Обработанные экстрактом клетки могут также впоследствии использоваться в качестве стартового материала для индукции плюрипотентности или SCNT экспериментов (Bui et al., 2012; Ganier et al., 2011). Экстракты, приготовленные из относительно дифференцированных клеток могут быть также использованы для 'трансдифференцировки' клеток, по крайней мере, частично (Hakelien et al., 2002). Воспроизводимость воздействия экстрактов вызывает беспокойство (Liu et al., 2011; Singhal et al., 2010). Это, по-видимому, обусловлено тем, что трудно приготовить экстракты высокого качества, что может быть решено при дальнейшем развитии этой системы.

Reprogramming by transcription factor overexpression (induced pluripotency)

Наиболее важным успехом в репрограммировании стало открытие, что клетки могут быть репрограммированы путем избыточной экспрессии ключевых транскрипционных факторов (Takahashi and Yamanaka, 2006). 4 транскрипционных фактора (Oct4, Sox2, Klf4 и Myc) могут быть действительно трансфицированы в соматические клетки и при правильных условиях культивирования, будут репрограммированы некоторые из них в ESC-подобное состояние, обозначаемое 'induced pluripotent stem cells' (iPSCs) (Yamanaka, 2012).

Репрограммирование с помощью этого пути - это индукция профиля экспрессии плюрипотентных генов, напоминающая таковую в ESCs, при этом происходит экспрессия большого количества молчащих соматических генов. Обнаруживается обширная репликация ДНК и клеточные деле6ния, ведущие к генерации клеток с новыми качественными особенностями (Koche et al., 2011). Эти клетки могут затем дифференцироваться в любой тип клеток взрослого тела (Takahashi and Yamanaka, 2006).

Исследования iPSCs стали взрывными в последние 5 лет с рядом технологических усовершенствований и механистическими проникновениями в суть, приведших к прогрессу (Papp and Plath, 2013). Существенная порция работ сфокусирована на повышении низкой эффективности репрограммирования с помощью индукции плюрипотентности, это, как полагают, результат, по крайней мере, частично репрессивной природы хроматина в репрессированных локусах в соматических клетках и результат стохастической природы этой процедуры (Hanna et al., 2009; Jullien et al., 2011; Papp and Plath, 2013).

Кроме того, большое количество исследований было направлено на генерацию iPSCs без использования онкогена Myc и вирусных устройств для доставки генов, чтобы снизить потенциальный онкогенез (Nakagawa et al., 2008; Yamanaka, 2012). Первичным двигателем этих работ было разработка систем генерации iPSCs в достаточных количествах, чтобы они могли бы надежно быть использованы для тканевой заместительной терапии (Okita and Yamanaka, 2011).

Как и при др. системах репрограммирования здесь также, по-видимому, задействована определенная степень эпигенетической памяти в iPSCs, при этом репрограммированные клетки обладают эпигенетическими сигнатурами, связанными с исходным типом клеток, из которого они репрограммированы (Graf, 2009). Достигнуты определенные успехи по преодолению этого, так что не будет ограничивать медицинское использование этой технологии в будущем.

Transdifferentiation by transcription factor overexpression (direct programming)

Важная недавняя ветвь репрограммирования соответствует 'трансдифференцировке' или 'трансверсии', при которой соматические клетки переключаются из одного состояния в др., но при этом не обязательно возрастает онтогенетическая пластичность. Использование коктейля транскрипционных факторов успешно используется, чтобы трансдифференцировать ряд клеточных типов из одного клона в др. (Graf, 2011; Vierbuchen and Wernig, 2012).

Такое репрограммирование может произойти внутри клона, так, напр., конверсия экзокринных клеток в эндокринные клетки (обе энтодермального происхождения) (Zhou et al., 2008) или альтернативный поперечный переход клонов, как это было продемонстрировано при превращении фибробластов в нейроны (мезодермально-эктодермальное переключение клонов) (Vierbuchen et al., 2010). Можно ожидать, что список типов клеток, которые могут стать предметом для трансдифференцировки будет постоянно расти благодаря новым комбинациям транскрипционных факторов, способных обеспечивать определенные клеточные особенности (Vierbuchen and Wernig, 2011).

Трансдифференцировка также обещает ряд потенциальных преимуществ по генерации клинически пригодных клеток, особенно в отношении эффективности конверсии, которая, по-видимому, в некоторых случаях достаточно высокая. Кроме того, клетки, происходящие с помощью этого пути, могут нести меньший риск генерации карцином, поскольку необходимые онкогены не используются в этой процедуре репрограммирования (Sancho-Martinez et al., 2012).

Perspectives

Over the past six decades, nuclear reprogramming has acquired ever-increasing momentum, fuelled by the realisation that it could help to alleviate human suffering as well as uncover fundamental biological principles.

Despite the many major advances in the reprogramming field made in recent years, there are still a number of challenges facing investigators. Key outstanding questions include: What are the molecular mechanisms of nuclear reprogramming? Why is the efficiency of the process so low? What factors and mechanisms maintain the stable state of cellular identity? In each system, what are the steps of nuclear reprogramming? Does reprogramming by induced pluripotency or transdifferentiation involve a gradual reversion of the developmental steps followed during embryogenesis? What can we learn about the mechanisms of diseases using reprogrammed cells from patients? And most importantly, can we design effective new cures starting from a patient's own cells and reprogramme these to therapeutically useful cells? Progress so far and the development of modern laboratory techniques provide a battery of invaluable tools to address these outstanding questions and the field can expect many more exciting fundamental and applied discoveries in the coming decades.

Nuclear reprogramming Richard P. Halley-Stott, Vincent Pasque and J. B. Gurdon Development 2013 Vol.140, 2468-2471.

Nuclear reprogramming
Richard P. Halley-Stott, Vincent Pasque and J. B. Gurdon
Development 2013 Vol.140, 2468-2471.