C момента обнаружения антигена, идентифицируемого с помощью антител (Horton et al., 1985), множество белков было идентифицировано на мышиных остеокластах. Receptor activator NF-κB (RANK), RANK лиганд (RANKL) и osteoprotegerin были открыты с использованием мышиных клеток в 1997 (Kotake et al., 2012); , однако, лишь немногие белки были идентифицированы в остеокластах человека. Остеокласты человека отличаются от мышиных по многим аспектам; в самом деле, немногие исследованны остеокласты человека, хотя мы изучали механизм остеокластогенеза у человека (Kotake et al., 2009, 2012).
Voltage-dependent anion channels (VDACs) повсеместно экспрессируются на наружной митохондриальной мембране (Shoshan-Barmatz et al., 2010). VDACs обеспечивает транслокацию метаболитов и др. соединений в и наружу от митохондрий (Bathori et al., 1999; Elinder et al., 2005). Они также являются наиболее многочисленными белками наружной мембраны митохондрий. VDACs важны для регуляции высвобождения митохондриального cytochrome c при некоторых формах апоптоза благодаря взаимодействию с членами семейства Bcl-2 (Elinder et al., 2005). Высоког разрешения 3D структуры VDAC были определены тремя группами (Bayrhuber et al., 2008; Hiller et al., 2008; Ujwal et al., 2008); , однако, одной кристаллической структуры и NMR структуры может быть недостаточно из-за некоего конфликта с результатами биохимических и функциональных исследований (Colombini, 2009).
Мы идентифицировали новый белок в плазматической мембране остеокластов человека как VDAC. VDAC экспрессируется в плазматической мембране и др. клеток человека, включая гематопоэтические и эндотелиальные клетки (Bathori et al., 1999; Gonzalez-Gronow et al., 2003). VDACs действуют, по крайней мере, частично как Cl- каналы, регулируя д β у и функции клеток.
Silencing of VDAC-1 expression via RNAi may result in opposing physiological effects on the tumor cell. Dispossessing of an “anchor” for hexokinase on the outer mitochondrial membrane may deprive the tumor of a high flux rate of glycolysis, thus inhibiting tumor proliferation; Pro-apoptotic—the same can relieve the anti-apoptotic effects that result from the hexokinase-VDAC interaction. Anti-apoptotic—if oligomers of VDAC are involved in forming the mitochondrial permeability transition pore complex (MPTP), silencing VDAC may inhibit apoptosis; the same may occur if VDAC is involved in hetero-multimer formation with Bax or other pro-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins. Despite the opposing effects on apoptosis, the data presented by Koren et al. indicate that silencing VDAC-1 inhibits tumor metabolism significantly, most likely via disruption of both the enhanced glycolytic flux and the nucleotide/metabolite/ion shuttles across mitochondria.
Discussion
Идентифицирован VDACs среди белков, полученных из клеточных мембран остеокластов человека. Антитела против VDAC человека ингибируют остеокластогенез у человека, индуцируемый с помощью RANKL и M-CSF. Экспрессия VDACs на остеокластах человека подтвержена с помощью IEM, electrophysiological patch clamping и иммуноцитохимического двойного окрашивания и определена функция VDACs в резорбции кости с использованием Osteologic™ пластин. Установлено, что белок VDAC экспрессируется на плазматической мембране остеокластов человека, функционируя в качестве Cl- канала, регулирующего дифференцировку и функцию остеокластов человека.
VDACs появляется в плазматических мембранах множественных типов клеток, включая лимфобластоидные Nawalma клетки человека, эндотелиальные клетки человека, первичные культуры нейронов гиппокампа крыс, линию клеток гиппокампа HT22 мышей, C1300 мышиные клетки нейробластомы, телячьи астроциты и клетки HeLa (Dermietzel et al., 1994; Yu and Forte, 1996; Bathori et al., 1999; Buettner et al., 2000; Thinnes et al., 2000; Bahamonde et al., 2003; Baker et al., 2004; Akanda et al., 2008; De Pinto et al., 2010). VDACs также присутствует в плазматической мембране, где он концентрируется в кавеолах и caveolae-родственных доменах в обычных гематопоэтических клетках человека, включая лимфоциты, гранулоциты и моноциты (Shoshan-Barmatz et al., 2010). Baker et al. (2004) сообющили, что VDAC1 является NADH-ferricyanide редуктазой трансплазматической мембраны. Т.о., VDACs, как было установлено, встречается на некоторых клетках человека, включая моноциты; теперь мы добавили к этому списку ещё и остеокласты человека, хотя присутствие в плазматическрой мебране остеокластов мвшей ещё нуждается в подтверждении.
В 1996, присутствие VDACs в плазматической мембране всё ещё оставалось спорным (Yu and Forte, 1996). Основным аргументом против присутствия функциональных VDACs в плазматической мембране было следующим; если плазматические мембраны содержат VDACs, то эти каналы вряд ли функционируют нормально в этих мембранах, как наблюдаемые после очистки митохондриальные VDACs воспроизведенные в планарном липидном бислое, поскольку они могут вызывать в плазматических мембранах значительно большую проницаемость, чем они кажутся (Yu and Forte, 1996); , следовательно, скорее всего, что эти каналы не функционируют в обычных условиях (Yu and Forte, 1996). Однако, Bahamonde et al. (2003) подтвердили присутствие VDACs в местах помимо митохондрий, это строго подтверждено в двух независимых исследованиях (1) идентификация VDAC изоформы (plasmalemmal VDAC или pl-VDAC), которая содержит лидерную последовательность для своего проникновения в плазматическую мембрану (Buettner et al., 2000) и (2) присутствие VDACs в кавеолах (Shoshan-Barmatz et al., 2010). Было также предположено, что VDACs в плазматической мембране может быть в закрытом состоянии большую часть времени (Mannella, 1997; De Pinto et al., 2010). De Pinto et al. (2010) подтвердили, что VDACs перемещается в эндоплазматический ретикулум (ER) из митохондрий и оттуда в плазматическую мембрану. Мы установили, что anti-VDAC ингибируют остеокастогенез из мноцитов. Это указывает на то, что роль VDACs в плазматической мембране является критической, по крайней мере, частично в остеокластогенезе человека, индуцированного с помощью RANKL и M-CSF.
Anti-VDAC антитела обнаруживают тенденцию супрессировать токи Cl- зрелых остеокластов (но не существенно). VDACs в плазматической мембране являются в основном Cl- избирательными (Bathori et al., 1999); , однако, клеточные функции Cl- каналов плохо изучены в противовес хорошо известной роли катионных каналов. Ацидификация обязательна для резорбции кости; вакуолярного типа H+-ATPase помещает H+ во внутриклеточные пузырьки. Cl- забираются в эти пузырьки посредством ClC-7 канала, оставаясь нейтральным в качестве контенера ионов. Пространство между оборчатой мембраной и поверхностью кости, ‘лакуна резорбции’, содержит протеолитические энзимы и очень кислая. Этот компартмент часто обозначается как ‘внеклеточная лизосома’. ClC-7 в качестве позднего эндосомного по отношению к лизосомному Cl- каналу играет жизненно важную роль в ацидификации внеклеточной лизосомы между остеокластом и костью (Kornak et al., 2001). ClC-7 является Cl-/H+ antiporter, который обеспечивает основную проницаемость для Cl- из лизосом и является важным для ацидификации этой лизосомы (Graves et al., 2008). Его нарушение у мышей и людей ведет к дефекту деградации кости, приводя к тяжелой форме остеопетроза; , однако, Clcn7 -/- остеокласты теряют способность внеклеточной ацидификации, но всё ещё ацидифицируют внутриклеточные пузырьки (Kornak et al., 2001). Эти нахродки подтверждают, что вместе с др. Cl- каналами, ClC-7 может участвовать в ацидификации поздних эндосом и лизосом. Анионовые каналы для Cl- в остеокластах являются chloride ion channels (CLIC), anion exchanger 2 (AE2) и K+–Cl- котранспортерами (KCCs), помимо CLC-7 (Henriksen et al., 2008; Figure 7). Наши находки подтверждают, что VDAC является новым Cl- каналом в остеокластах человека и могут косвенно играть роль в ацидификации резорбционной лакуны между остеокластом и костью (Figure 7).
Остеокластогенез ингибируется с помощью anti-VDAC антител, когда добавлены в культуральную среду с RANKL на всем протяжении культивирования после 4-х дней (Figures 2A, 2B and 2C). RT-PCR анализ показал, что anti-VDAC антитела обнаруживают тенденцию ингибировать экспрессию мРНК NFATc1 в моноядерных преостеокластах; следовательно, возможно, что VDACs регулирует , по крайней мере, раннюю фазу остеокластогенеза. Однако, patch-clamp анализ показал, что ток Cl- наиболее ингибирован в зрелых остеокластах по сравнению с моноцитами или моноядерными преостеокластами. Т.о., VDACs скорее всего регулируют резорбцию кости зрелыми остеокластами.
Anti-VDAC обнаруживают тенденцию ингибировать все токи Cl- зрелых остеокластов, но не преостеокластов (Figures 4A and 4B), хотя IEM показывает, что VDACs присутствуют как в мембранах моноцитов, так и остеокластов (Figure 3), этому требуется объяснение.
Независимо от ориентации VDACs (see Thinnes et al., 2000; Hiller et al., 2008), мы подозреваем, что эпитоп anti-VDAC антител располагается в перекрывающейся части (последовательность в 10 аминокислот; TQTYGLGILS) пептида 24 и пептида 25 (Figure 6A), и что верхушка бочонко-подобной структуры VDAC на Figure 6B обращена лицом наружу клетки, поскольку антитела против VDAC , скорее всего, связывают внеклеточный домен.
Очевидно, что различия наиболее выражены между позитивным контролем и мышиным IgG-обработанными колодцами (wells) по сравнению с мышиными IgG и anti-VDAC антителами обработанными колодцами, как показано на Figures 2A и 2B. Мышиный IgG может обнаруживать легкий ингибирующий эффект на остеокластогенез у человека, но причина этого неясна. Figures 5A and 5B демонстрируют, что ингибирующие эффекты anti-VDAC антител (20B12) различны. В экспериментах с использованием клеток человека, мы часто находим различия эффектов между добровольцами людьми, но не у мышей.
In summary, expression of VDACs has now been found in the plasma membrane of human osteoclasts, where they regulate human osteoclastogenesis. Thus, inhibition of their function with anti-VDAC antibodies could be used to treat diseases with increased resorption of bone, such as osteoporosis, RA and Paget's disease.
