Морфогенез тракта оттока (OFT) сердца сложный и тонко настроенный процесс (Gittenberger-de Groot et al., 2005; Yutzey and Kirby, 2002; Waldo et al., 2001). Во время собственно развития OFT, крупные артерии достигают своих окончательных морфологических взаимоотношений, при этом аорта оказывается расположенной в центральном положении справа позади легочного ствола. Аномалии развития OFT приводят к аномальному расположению аорты и легочного ствола, наблюдаемым при некоторых формах врожденных пороков сердца, таких как тетрада Фалло, транспозии крупных сосудов и двойной выход из правого желудочка, часто характеризующихся расположением бок-о-бок крупных сосудов. Неправильное расположение крупных артерий и соотв. отверстий в этих примерах имеет серьезные последствия, сопровождаемые ранней гибелью без своевременного вмешательства.
Во время эмбрионального развития миокард OFT происходит из второго поля сердца, также обозначаемого как переднее или вторичное поле сердца (Kelly et al., 2001; Mjaatvedt et al., 2001; Waldo et al., 2001). Мы рассмотрим эту популяцию, которая включает целомическую стенку, покрывающую перикардиальную полость в области OFT сердца (Waldo et al., 2001). Эта популяция клеток экспрессирует среди прочих гены Isl1, Tbx1 и Tbx3, GATA4, Nkx2.5 и WT-1 (Brown et al., 2004; Cai et al., 2003; Kelly and Papaioannou 2007; Mesbah et al., 2008, 2012; Waldo et al., 2001). Экспрессия некоторых из этих генов, включая Tbx3 и Isl1, также наблюдается с клетках, происходящих из нервного гребня, а недавнее исследование показало двойное происхождение (микардиальные и нервного гребня клетки) Isl1 производных в сердце (Engleka et al., 2012; Mesbah et al., 2008). Клетки переднего поля сердца вносят вклад в сосудистую стенку крупных артерий и дифференцируются в миокардиальный фенотип после миграции в миокард OFT. Поскольку начало развития миокарда OFT является коротким, контролируемым взаимодействием между продуктами упомянутых выше генов, и сопровождается добавлением клеток из переднего поля сердца в OFT, который удлиняется в ответ. Хотя точный промежуток времени добавления клеток из передднего поля сердца в миокард OFT неясен, добавление происходит вплоть до дня эмбриогеназа (E) 11.5 у мышей (Xu et al., 2004). Используя иммунофлюоресцентное окрашивание и отложения Indian ink у кур, увеличение миокардиальной части OFT идет вплоть до ст. HH24 (Rana et al., 2007), что соответствует E12.5 у мышей.
Будущая аорта и легочный ствол и соотв. их отверстия расчполагаются бок-о-бок во время раннего развития сердца. Как полагают, помимо удлинения происходят ротационные перемещения OFT, необходимые для правильного позиционирования аорты и легочного ствола и их соотв. отверстий (Bajolle et al., 2006; Thompson and Fitzharris 1979; Thompson et al., 1987). Множественные онтогенетические сигнальные факторы, такие как Pitx2c и Fgf8/10, экспрессируются в переднем поле сердца асимметричным образом,как было установлено, c помощью потенциапльных регуляторов этого ротационного движения (Ai et al., 2006). Несколько мутантных мышиных моделей с фенотипом, который включает уродства OFT, сегодня доступны, включая модели с альтерациями экспрессии передачи сигналов vascular endothelial growth factor (VEGF). Ранее мы изучали VEGF 120/120 мутантных мышиных эмбрионов, которые экспрессиют только VEGF120 изоформу и установили высокую чувствительность этих эмбрионов к аномалиям OFT, включая тетраду Фалло и двойной выход из правого желудочка (Stalmans et al., 2003; Van Den Akker et al., 2007). Было предположено, что происходящий из переднего поля сердца subpulmonary миокард очень чувствителен к передаче сигналов VEGF и Notch, которые могут лежать в основе наблюдаемого неправильного распорложения OFT сосудов у
VEGF 120/120 мутантов. Однако прямая связь со вкладом мезенхимы переднего поля сердца в OFT не была изучена в деталях. В целом исследования, в которых динамика ротации OFT была бы связана с экспрессией маркеров, более типичных для предшественников миокарда в переднем поле сердца во время последовательных стадий развития, на сегодня отсутствуют. Следовательно, неизвестно как и если переднее поле сердца вносит вклад в миокард OFT, может ли он участвовать в ротации OFT и поэтому мы предприняли исследование уже описанного укорочения subaortic OFT (Watanabe et al., 1998, 2001) вместе с заметным относительным удлинением subpulmonary OFT, или обоих. Необходимо понять, как специфическая архитектура переднего поля сердца может приводить к асимметричному добалению в миокард OFT во время развития сердца. Мы продемонстрировали асимметрию вклада миокардиальных предшественников внутри переднего поля сердца и постулировали, что это основа ротации OFT и последующего нормального позиционирования отверстий аортального и легочного стволов. Кроме того, мы исследовали этот феноме у
VEGF120/120 эмбрионов, у которых был описан двойной выход из правого желудочка.
DISCUSSION
Ремоделирование OFT является важной частью развития сердца. Нормальное разделение и позиционирование крупных артерий OFT необходимо для сердца, чтобы поддержать его функцию как центрального насоса, координирующего кровоток посредством системного и легочного кругов кровообращения (Bartman and Hove 2005). Врожденные нарушения OFT могут тяжело нарушать физиологию, приводя к гемодинамическим перегрузкам, цианозу и ранней гибели (Bashore, 2007). Знание онтогенетических процессов, приводящих к образованию и ремоделированию OFT, также как и участвующих жизненноважных клеток и групп клеток, важно для понимания, когда и почему появляются уродства в результате приводящие к врожденным порокам сердца. В последние годы важность вклада клеток, происходящих из второго поля сердца, стала очевидной (Cai et al., 2003; Snarr et al., 2008; Vincent and Buckingham 2010), хотя точный механизм ремоделирования OFT, включая финальное положение аорты и легочного ствола и их отверстий, остается неясным.
Показано, что передняя часть второго поля сердца играет критическую роль в нормальном развитии OFT вместе с нервным гребнем и перикардом (Kirby et al., 1985; Gittenberger-de Groot et al., 2000; Waldo et al., 2005). Во время сердечно-сосудистого развития клетки из трех упомянутых выше популяций рекрутируются в линейную сердечную трубку посредством как артериального, так и венозного полюсов, начиная с E9.5 (Kelly and Buckingham, 2002; Perez-Pomares et al., 2003; Poelmann and Gittenberger-de Groot, 1999). Ранее было продемонстрировано, миокардиальная часть OFT, охватывающая как subaortic, так и subpulmonary миокард, происходит из второго поля сердца (Cai et al., 2003). Этот миокард,как было установлено, имеет общие клональные взаимоотношения с правосторонними и левосторонними головными мышцами, соотв. (Lescroart et al., 2010).
Мы исходя из результатов VEGF120/120 модели, ранее предположили, что происходящий из второго поля сердца subpulmonary миокард может быть высоко чувствительным к факторам передачи сигналов, таких как VEGF и Notch, которые могут лежать в основе наблюдаемых неправильных расположений FT сосудов у VEGF120/120 мутантов, но не выявили прямой связи со вкладом мезенхимы второго поля сердца в OFT в этом исследовании (Van Den Akker et al., 2007).
Лёгочный ствол происходит из задней левой стороны аортального мешка, тогда как предполагаемая аорта первоначально располагается на правой стороне (Gittenberger-de Groot et al., 2005; Waldo et al., 2005). После завершения развития OFT, однако, легочный ствол перемещается в правое переднее положение. Динамичный процесс, необходимый во время кардиального развития, приводит к ротационному движению легоочного ствола и отверстия вокруг аорты.
Механизм клеточной гибели, преимущественно обнаруживается в subaortic миокарде, вызывая укорочение subaortic части OFT, было предположено, что он собственно может служить механизмом образования вентрикуло-артериальных соединений (Watanabe et al., 1998, 2001; Schaefer et al., 2004). Клеточная гибель хорошо известный механизм в развитии сердца и,как было установлено, он появляется на уровне OFT (Poelmann and Gittenberger-de Groot, 2005; Vuillemin and Pexieder, 1989). Однако механизм асимметричного активного укорочения OFT только за счет клеточной гибели вряд ли объясняет сложное позиционирование OFT и не позволяет объяснить сопутствующее асимметричное увеличение длины subpulmonary миокарда, тогда как subaortic миокард остается относительно коротким с самого начала (Bartelings and Gittenberger-de Groot, 1991).
Ранее сообщалось, что асимметричная экспрессия Fgf8/10, Pitx2c и возможно Tbx1 в переднем поле сердца участвует в индукции асимметричного роста OFT (Nowotschin et al., 2006; Brown et al., 2004). Экспериментальный нокаут этих генов приводит к ассоциации с большим разнообразием фундаментальных дефектов в развитии OFT (Liu et al., 2002). Особенно важна, по-видимому, коэкспрессия Tbx1 с Pitx2, важным геном в передаче право-левосторонних сигналов в фарингеальной мезодерме OFT. Скрещивание гетерозиготных по Tbx1 и Pitx2 мышей приводит к кардиальным аномалиям, включая двойной выход из правого желудочка (Nowotschin et al., 2006). Эксперименты с использованием мечения правой и левой стороны второго поля сердца в OFT кур показывает вклады предшественников второго поля сердца в определенные боковые (lateralized) регионы OFT (Takahashi et al., 2012). Оставалось неясным, смогут ли др. известные маркеры предшественников миокарда внутри переднего поля сердца продемонстрировать сходную асимметричную экспрессию, которая могла бы объяснить описанную выше динамикку ремоделеировнаия OFT. Теперь мы показали, что это приложэимо также к экспрессии Nkx2.5 и Isl1. Удивительно, что Nkx2.5- и Isl1-позитивные области переднего поля сердца оказались последней частью сердца, покрываемой c помощью WT-1-экспрессирующего целомического эпителия, т.e., эпикардом. На аортальной стороне, которая, как полагают, возникает из правосторонней пре-фарингеальной мезодермы (current study; Bajolle et al., 2008; Takahashi et al., 2012), исчезновение Nkx2.5-позитивной популяции на 9.5 сопровождается началом экспрессии WT-1 в целомической стенке. Позитивное взаимодействие между Nkx2.5 и WT1 нуждается в дальнейшем изучении.
Получено подтверждение в нашем исследовании, что удлинение subpulmonary миокарда OFT происходит вплоть до дня эмбриогенеза 12.5, это, по крайней мере, на родин день дольше, чем описано в литературе (Xu et al., 2004; Viragh and Challice 1973), но согласуется с исследованиями на курах, которые показали вклад в OFT вплоть до ст. HH24 (соответствует 12.5 дню у мышей) (Rana et al., 2007).
Целью настоящего исследования было оценить, создает ли архитектура переднего поля сердца сигналы, необходимые для нормального позиционирования отверстий аорты и легочного ствола во время развития сердаца млекопитающих. Главной находкой настоящего исследования, базирующегося на 3D-реконструкциях последовательных стадий развития, стало то, что клетки миокардиальных предшественников асимметрично располагаются в OFT во время развития, т.к. они отчетливо наблюдались на легочной стороне, в то время как они почти отсутствовали на аортальной стороне. Данное исследование показало впервые, что непрерывное добавление из Nkx2.5-экспрессирующих мезенхимных миокардиальных предшественников ниже артерии шестой фарингеальной дуги может подталкивать будущее отверстие легочной артерии в направлении кпереди и вправо.
Кроме того, мы показали, что такое добавление было дизорганизованным и вытягивание в направлении левой стороны OFT было короче, чем у дикого типа у VEGF120/120 модели, где обнаруживался фенотип, в котором предоминировали нарушения OFT (Van Den Akker et al., 2007). Самостоятельный онтогенетический источник клеток, происходящих из второго поля сердца, вносит вклад в миокард в основании легочного ствола в противоположность миокарду в основании аорты (Bajolle et al., 2008). Клональные исследованияя показали более значительные количества клеток клонов в subpulmonary регионе, указывая на более высокую скорость пролиферации, тогда как клоны в subaortic регионе были очень небольшими (Bajolle et al., 2008). Subpulmonary миокард остается в заднем положении у Pitx2c нокаутных мышей, у которых присутствуют аномалии OFT, такие как транспозиции крупных артерий и двойной выход из правого желудочка (Bajolle et al., 2006). Мы полагаем, что доминантная левосторонняя экспрессия Pitx2c индуцируцет экспрессию Nkx2.5 внутри переднего поля сердца, которая может быть нарушена у Pitx2c нокаутных эмбрионов мышей. В нашем исследовании VEGF120/120 эмбрионов, мы смогли различить неправильное расположение Nkx2.5-позитивных мезенхимных клеток на пульмональной стороне OFT в соответствии с результатами Bajolle et al. (2006), которые показали, что неправильное расположение OFT миокарда в Pitx2c мутантных сердцах с двойным выходом из правого желудочка. Нарушение организации Nkx2.5-позитивной SHF мезенхимы по фронту глотки является показательным для аномальной дифференцировки SHF. Небольшая область Nkx2.5-позитивных миокардиальных предшественников, покрывающих пульмональную сторону OFT, д. лежать в основе наблюдаемой тетралогии Фалло и двойного выхода из правого желудочка в VEGF120/120 сердцах (Van Den Akker et al., 2007) , в которых недостаточно добавляется subpulmonary миокард.
При транспозиции крупных артерий, артериальные отверстия располагаются почти в одной плоскости (Bartelings and Gittenberger-de Groot, 1991), подтверждая тот факт, что добавление миокарда в OFT правого желудочка или не имеет места или недостаточно. Сходные наблюдения сделаны для сердец мышей с двойным выходом из правого желудочка с заметным укрочением OFT из правого желудочка (Bartram et al., 2001; Molin et al., 2004). В это время специфические паттерны во втором поле сердца для
Nkx2.5 и Isl1 не были описаны. Результаты на
VEGF120/120 модели. полученные в данном исследовании подтверждают предполагаемый механизм дефицита и нарушенной организации добавления миокардиальных предшестввенников на pulmonary сторону OFT. Асимметричный вклад происходящего из переднего поля сердца миокарда вокруг и в особенности ниже артерии левой 6-ой фарингеальной дуги во время критической стадии развития OFT объясняет динамический процесс, который приводит к позиционированию отверстия легочной артерии в её нормальном левом переднем положении. Можно задаться вопросом, действительно ли происходит настоящее ротационное движение, базирующееся на спирализации гребней тракта оттока. Последнее объяснение доминировало в позиционном ремоделировании в течение нескольких декад и аномальное скручивание рассматривалось в качестве механизма, лежащего в основе аномалий OFT тракта, наблюдаемых при транспозиции крупных артерий (Chuaqui and Bersch 1973; Lomonico et al., 1988; Thompson and Fitzharris 1979; Thompson et al., 1987). Это объяснение ротации тракта оттока, однако, стало предметом дискуссий и некоторые авт. показали, что такой ротации не происходит во время нормального развития (Steding and Seidl, 1980, 1981; De la Cruz and Da Rocha 1956; Gittenberger-de Groot et al., 2005). Принимая во внимание вклады второго поля сердца в ремоделирование OFT, появилась новая концепция для родственных аномалий. Очевидно, что собственно позиционирование крупных артерий д. происходить, чтобы достичь нормальных морфологических соотношений между аортой и легочным стволом. Результаты нашего исследования подтвердили появление ротации. Мы полагаем, что скорее, чем механизм, базирующийся на спирализации эндокардиальных OFT подушек, существует асимметричное удлинение правой части вентрикулярного OFT, вызывающее подталкивание легочного ствола в направлении его окончательного положения по фронту аорты, которое расценивается как ротация.
Conclusions
We conclude that the addition of Nkx2.5-positive myocardial precursors from the anterior heart field occurs during normal development predominantly below the left branch of the 6th pharyngeal arch artery. We postulate that this results in a movement without spiralization of the OFT in which, due to the continued addition of right-sided myocardium, the pulmonary trunk orifice is pushed in a rightward and anterior direction, which presents a new explanation for the rotation of the pulmonary orifice and trunk. This mechanism is referred to as pulmonary push, which results in a rotation of the pulmonary orifice to an anterior position. As the term rotation has been intrinsically used in many ways and for many OFT structures, we prefer the use of “pulmonary push” to describe the mechanism of OFT positioning. Deficient or disorganized positioning of the Nkx2.5-positive precursors, as was observed in the VEGF120/120 mutant, might explain cardiac malformations with side-by-side position of the great arteries.
