Pain

Боль по медицински определяется как 'неприятное сенсорное и эмоциональное переживание, связанное с действительным или потенциальным повреждением ткани, или описываемое в терминах таких повреждений' [1]. Восприятие боли является адаптивной реакцией, которая указывает на присутствие повреждающего и угрожающего жизни события (напр., травматического повреждения, потенциально вредных условий и инфекции) [2, 3]. Неспособность обнаруживать вредные стимулы означает серьёзный риск для нашего выживания и хорошего самочувствия. Индивиды, страдающие от врожденных аномалий, которые делают их неспособными обнаруживать болевые стимулы, часто подвергаются действию условий, которые могут угрожать жизни [4]. Боль может быть подразделена на три класса: (i) nociceptive (болезненная), (ii) воспалительная и (iii) нейропатическая. Nociceptive боль, такая как коротко остриженный палец, вызывающий восприятие ощущения (боли), сравнимое со стимулом (вредным). Это классический пример 'нормальной' боли. Боль, возникающая, напр., от повреждения ткани или инфекции, привлекающая повышенную чувствительность из-за высвобождения воспалительных медиаторов в поврежденной ткани. Поэтому восприятие ощущения (боли) не может быть более сравнимым со стимулами (non-noxious). При воспалительной боли, наблюдается снижение порога болевых рецепторов (nociceptors). И нормальная и воспалительная боль представляют собой ключевой признак болевой системы - она оперирует как набатный колокол. Ощущение боли ведет к предупреждению и защите [5]. Нейропатическая боль, однако, отражает аномальное функционирование болевой системы. Боль не действует более как сигнал тревоги; скорее она становится проблемой, вызывая 'ложную тревогу'. Если обычная медицина справляется с нормальной и воспалительной болью довольно эффективно, нейропатическая боль не находит адекватного лечения.

Neuropathic pain

Международная Ассоциация по Изучению Боли определяет нейропатическую боль как 'боль, инициируемую или вызываемую, прежде всего, повреждением нервной системы' [6]. Боль вследствие повреждения нерва парадоксальна. Парадокс в том, что во многих случаях этот результат повреждения нерва (травма, патология и т.д. ) не устраняет причиняющие боль сигналы. Скорее травма или болезнь нерва, приводящая к рассечению аксонов, часто ассоциирует с инициацией симптомов, которые включают: (i) чуткость к стимулам в денервированной части тела (hyperalgesia и allodynia), (ii) боль вызывается обычными движениями или весовой нагрузкой и (iii) спонтанная боль [5].

Тот факт, что боль присутствует (и даже усиливается) после повреждения нерва указывает на сложную природу изменений и событий, имеющих место как в периферической нервной системе (PNS), так и central nervous system (CNS), после радикальных повреждений нервов. Некоторые патологические процессы, затрагивающие периферические нервы, сенсорные ганглии и структуры CNS, могут вызывать нейропатическую боль.

Боль обычно является результатом активации болевых центростремительных волокон за счет действительных или потенциальных стимулов повреждения ткани. Боль может также возникать за счет активности, генерируемой в нервной системе в отсутствие адекватной стимуляции периферических сенсорных окончаний. Это может быть обусловлено болезнью, травмой или чем-нибудь, что воздействует на периферические нервы. Часто результатом таких повреждений является возникновение хронической, часто не поддающейся лечению боли.

Эта категория включает различные хронические болезни, напр., боль при пояснично-крестцовом радикулите, болезненная диабетическая нейропатия и фантомная боль в конечностях.

Phantom limb pain

Феномен 'фантомной боли' удивительный случай нейропатической боли. Ампутация конечности обычно сопровождается ощущением, что отсутствующая часть тела всё ещё присутствует. Фантомные не болезненные ощущения могут воспринимать специфическое положение, форму или движение фантома, ощущение тепла или холода, зуд, покалывание или электрические ощущения и др. paraesthesias. Боль в той части тела, которая больше не присутствует, появляется в 50-80% от всех ампутаций [7]. Фантомная боль обще распространена после ампутации конечностей, удаления молочной железы, а также в тех частях тела, которые денервированы, но всё ещё присутствуют (anesthesia dolorosa) [8-11]. Фантомная боль имеет многие признаки: один конец спектра ограничен простым, коротко длящемся и редко появляющимся болезненным шоком в отсутствующей части тела; на др. конце спектра может быть постоянное, мучительное болезненное ощущение, во время которого индивид получыает яркое и интенсивное восприятие отсутствующей части тела. Оно кажется более сильным в дистальных частях фантома и может иметь ряд характеристик, таких как терзание, пульсирование, жжение или сжимание. Её появление может быть немедленным, но она может также появиться спустя много лет после ампутации. Хотя большинство после ампутации обладает психологическими симптомами, такими как страх, депрессия и оторванность, отсутствуют доказательства, что фантом конечности сам по себе представляет психологическое нарушение. Изменчивость ощущений боли в целом ставит в тупик исследователей. Предложены некоторые животные модели боли, обладающие преимуществом в отношении униформности и контролируемости условий.

Neuropathic pain models in rodents

Модели на грызунах ценны для идентификации патофизиологических механизмов поведенческих и эмоциональных отклонений [12]. В области исследований боли обширные исследования охарактеризовали поведенческие фенотипы для ряда моделей боли, включая нейропатическую боль [13-15]. Модели на грызунах могут быть подразделены на две первичные группы в соответствии с (i) локализацией [дорсальные или вентральные корешки, dorsal root ganglion (DRG) или периферические нервы] и (ii) типом повреждения (поперечный разрез, тугая или слабая перевязка, раздавливание и т.д.) [16]. Важно отметить, что из-за отсутствия информации прямая оценка нейропатической боли у грызунов невозможна. Вместо этого используется альтернативный подход: наблюдаются изменения пороговых реакций на механические и термальные стимулы, нападения на собственную денервированную конечность (самоколечние) и др. показатели используются в качестве индикаторов присутствия нейропатической боли. Wall et al. [17] представили нейромную модель нейропатической боли в качестве эффективной модели появления спонтанной боли после радикального повреждения нерва. Нейромная модель воспроизводит клинические симптомы фантомной боли конечности. Полная денервация лап достигается перерезкой как седалищного, так и подкожного нервов. Как результат, некоторые животные обнаруживают драматические изменения в своем поведении, обнаруживается 'самокалечение', поведение, которое характеризуется царапанием и кусание онемевших лап. Уровень боли оценивается по величине autotomy. Нейромная модель успешно была использована как на крысах, так и мышах для физиологического и генетического анализа [18-20]. Более того, в всестороннем комплексном исследовании различных моделей боли у животных Mogil et al. [21, 22] предоставили убедительное описание болевого поведения и его изменчивость между линиями мышей, указывающую на её пригодность для поведенческих и генетических исследований. Вариабельность нейромной модели в разных линиях мышей представлена на Fig. 1. Оценка болевого поведения также позволяет делать предварительную селекцию по полу (т.e. самки в противовес самцам) , исходя из ожидаемой изменчивости [23]. Результаты представленных выше исследований дали четкое указание о наследуемой природе болевого фенотипа и в самом деле было запущено несколько исследований с целью генетического картирования компонентов, влияющих на болевое поведение [24, 25].

Figure 1. Variability of neuropathic pain (autotomy) among 12 inbred strains. X-axis - 12 inbred mice strains. The Y-axis represents the mean autotomy score for males and females (purple and dark blue bars, respectively).

Pain genetics

В целом генетические исследования боли представлены экспериментами, которые были сфокусированы или на роли генов в процессинге боли и передаче сигналов или на эффектах генетических факторов, которые могут вызывать предрасположенность к боли, измеряемой по тяжести, началу, латентности и реакции на болевое воздействие и т.д. Здесь мы сфокусируемся на идентификации генов, связанных с чувствительностью к нейропатической боли, или др. словами, как персонализированные различия (отражающиеся в их генетическом составе) влияют на болевое поведение.

Нейропатическая боль, включая фантомную боль, испытывает зависимость как от природы нервного повреждения, так и психосоциальных факторов. Её пользующаяся дурной славой вариабельность среди индивидов, даже если применяется идентичное повреждение нервов, указывает на существенный генетический вклад в величину восприятия боли [2]. Эта изменчивость, которая в основном обусловлена генетическими различиями, является ключевой особенностью в идентификации генов боли.

Полученные на грызунах модели для хронической боли могут быть скомбинированы и использованы для преимущественного картирования популяций, что позволяет картировать генетические факторы, ассоциированные с болью при выверенных болевых воздействиях. Использование такого подхода позволяет обойти вариабельность боли, мешающей в группах людей.

Complex traits

Основным известным препятствием в генетике боли является природа боли в виде сложного признака. В противовес Менделевским признакам, при которых генотип-фенотипические корреляции довольно четки и определенные, сложные признаки характеризуются непрерывными фенотипами, которые затеняют ассоциацию генотипа с исследуемым фенотипом [26]. Сложное наследование таких признаков приписывается ряду вносящих вклад генов и генетических вариантов (даже сотен), средовым факторам и взаимодействиями ген-среда [27].

Главным преимуществом картирования генетических факторов, ассоциированных с каким-либо признаком (positional cloning) является тот факт, технологии геномного сканирования представляют собой беспристрастное тестирование гипотез. Оно a priori не нуждается в предположениях о лежащей в основе физиологии. Несмотря на существенные успехи в обнаружении quantitative trait locus (QTL) , действительная идентификация генов после QTL остается обескураживающей целью. Использование модельных организмов, таких как грызуны помогает увеличить до максимума шансы выявления QTLs и лежащих в их основе генов [28]. Тщательное описание стратегий картирования и и статистика картирования представлены детально в др. работах [29-32].

Gene mapping

QTL detection

Traditionally, the starting point of QTL detection required the creation of a mapping population, usually either an F2 or backcross (BC) population. Subsequently, the estimation of the QTL location in the genome and the definition of its confidence interval (CI) are determined. This interval mapping procedure is performed using the same population used for the previous stage. Applying this procedure each chromosome is scanned, looking at pairs of markers at a time. The assigned probability value logarithm of odds (LOD) score indicated on the most significant regions to contain a QTL (the highest LOD score value). The next significant step toward QTL identification lies in the application of the appropriate fine-mapping strategy. The choice needs to take into consideration the trait mode of inheritance, resource availability and more [30, 32]. There are several strategies aimed at providing QTL fine mapping at high resolution. Starting with the preliminary steps described above, fine mapping is needed in order to reduce the mapping interval and the number of relevant candidate genes.

Chromosome substitution strains (CSS)

CSS has been suggested as a valuable resource for QTL mapping. Those lines are based on a donor strain (D) and a host strain (H). Each CSS carries both copies of chromosome 1…19 or sex chromosome from the donor strain, whereas all other chromosomes from the host strain are intact and homozygous. By this way, any effect can be attributed to a defined chromosome [33]. Fine mapping using CSS can be carried out in the form of congenic line production. This step involves further backcrossing of the CSS in which the QTL was mapped. The results would be a set of CSS - recombinant lines each carrying a relatively small single segment from the donor strain on the background of the host strain (i.e. congenic line). It needs to be noted though that the production of the above lines is time consuming and subsequent genotyping needs to be applied [31].

Recombinant inbred lines (RILs)

RILs considered to be an excellent genetic resource. RILs are formed by intercrossing a pair of inbred strains followed by recurrent inbreeding of the progeny producing a panel of inbred animals, each with a unique combination of the progenitor genomes. Once a series of RIL is genotyped, this information will be useful for future experiments. In case where the trait of interest showed contrasting phenotype in RIL progenitors, using RIL for mapping an effect can be highly productive as a QTL can be mapped to a relatively small interval. The high mapping resolution of the RIL was the basis for more advanced mapping strategies.

Collaborative Cross (CC)

In order to exploit the high mapping resolution of the RIL and to overcome the inherent limitation of RIL as it is based on two strains only, the CC has been developed. The construction of the CC was based on genetically diverse set of eight founder inbred strains. Systematic outcrosses of the founder strains followed by inbreeding resulted in a population that provide a unique opportunity to observe phenotypic variation via massive novel allelic combinations [34]. The usefulness of the CC as a reference population tailored for the dissection of complex trait was exemplified for various quantitative traits such as behavior, body weight and blood chemistry [35].

Recombinant inbred segregation test (RIST)

The RIST approach applies the advantage of RILs. Assume that a set of RIL presenting contrasting phenotype for the trait of interest is selected resulting in QTL detection to a certain interval on a certain chromosome. The RILs obtaining recombination points in the interval harboring the QTL are crossed with both parental lines to generate two segregating populations. The QTL will segregate in one population but not in the other population with relation to the recombination point, thus localized to small interval. The resolution of the fine mapping is dictated entirely by the number of the recombinations found in the mapped interval. The main advantages of the RIST approach are: feasible number of animals required even for small effects and the time frame that requires only two generations [30].

Recombinant progeny testing (RPT)

RPT forms another useful fine-mapped strategy. Assume that a BC population is generated from two distinct inbred strains, and QTL is mapped. Individuals with various recombination points along the mapped intervals are isolated. The selected individuals are backcrossed to one of the original progenitors and a new population is produced and selectively phenotyped. The comparison between the new RPT families (each carrying a unique genetic pattern along the area of interest) reduced the CI to a smaller interval with a corresponding reduction in relevant candidate gene number. RPT strategy requires only three generations for fine mapping. Furthermore, it can be very useful where there is an interest in two particular inbred strains for a certain trait but with no available panel of RIL. The application of the RPT strategy has enabled the fine mapping of loci for various traits [36].

In silico analysis

A complementary approach to gene mapping is in silico analysis. Application of in silico tools can significantly contribute to the detection of genes and rare variants. Data mining and automated tracking of new knowledge facilitate locus mapping. In addition, in silico prioritization of candidate genes plays an indispensable role in dealing with linked or associated loci [37]. The basic in silico mapping approach in the mouse relies on known differences between mouse inbred strains and uses a high density of markers to derive a strain distribution pattern that can be used for mapping. For example, assume that we look at a trait of interest for four inbred strains. Group 1 (A-B) shows certain phenotype and group 2 (C-D) presents contrasting phenotype. By scanning all known sequences of the four strains one may focus only on sequences (haplotypes or single SNP, for example) that show complete cosegregation of alleles and the phenotype in one group but not in the other. Doing so can speed up candidate gene prioritization [38, 39]. A highly informative reservoir is the Mouse Phenome Database [40]. 'In silico' not only describes the search for particular information (data mining) that is stored in computer-based resources but also includes task such as organizing, analyzing, and predicting increasingly complex data arising from molecular and clinical studies with the aid of a computer. In recent years, the implications of in silico analyses have shown its efficacy in terms of detecting novel loci for various traits [41-43].

Association studies

Genome-wide association studies (GWAS) were developed in order to address some of the shortcomings of traditional linkage tests, especially the low power of standard linkage analyses [44, 45]. Association means a relationship that is defined by the non-random occurrence of a genetic marker with a trait, which suggests an association between the genetic marker (or a marker close to it) and the investigated phenotype such as disease pathogenesis. This approach is hypothesis free, i.e. there is no pre-existing hypothesis about a particular gene or locus, and a null hypothesis that no detectable association exists. As in any classical association design, GWAS is based on employing two groups of unrelated affected and healthy individuals selected from the population. An allele is considered to be associated with the trait if it occurs at a significantly different frequency among cases when compared with controls.

A true association between a particular allele and a trait can occur in two situations. Association will obviously occur if the studied allele directly influences the trait. Such causative allele will have functional properties that increase the risk of developing the disease. Second, the studied allele might be indirectly associated with the disease by being in correlation with the causative allele. This correlation is termed linkage disequilibrium, i.e. the non-random association between alleles at different adjacent loci.

mRNA expression profiling

An independent approach applied for causal gene identification is whole transcriptome microarray analysis. The importance of microarray analysis lies in the actual discovery of expression alterations that relate to the trait of interest. As a complementary tool for gene mapping, expression profiling offers the opportunity to explore the functional consequences of a defined (but not completely characterized) genetic difference at the molecular level even before the identity of the causal locus itself is known [46]. For example, gene expression profiling of the DRG in chronic pain models has revealed the alteration of various genes [47], some of which were subsequently shown to be key modulators of pain [48]. Nonetheless, gene expression analysis using microarray technology suffers from well-known limitations including poor sensitivity and dynamic range, a requirement for substantial amounts of RNA, and a limited capacity to identify new transcripts or RNA splice sites.

An integrated approach for candidate gene selection

In principle, each of the methods specified above can stand on its own. An accelerating number of independently studies using either gene mapping, in silico mapping, mRNA profiling or GWAS are being published on a regular basis. Nevertheless, in this research, we aimed to show how the integration of various methods can lead to the identification of the gene(s) underlying a QTL, in a case such as neuropathic pain. The rationale, of course, is that the combination of different approaches can compensate for the caveats and disadvantages of any single method.

As a platform, this approach aims to facilitate gene discovery for many traits so long as the basic components of animal models and distinguishable phenotype are applicable and exist. Figure 2 presents a simple-to-follow scheme of the integrated approach. The actual 'integration' starts once a QTL that is/are associated with the trait has been mapped. Then, it is divided into two major levels of screening: (i) QTL analysis and (ii) gene expression analysis (Venn diagram - Fig. 2). For the QTL analysis, initial mapping, fine mapping and bioinformatic analysis are preformed in a sequential manner. Once the QTL was mapped to a manageable size interval (and number of candidate genes), the use of sequence databases enables further reduction of the number of relevant genes ([49], [50]).

Figure 2. Schematic presentation of the integrated approach. The first step starts with a standard whole-genome screen for quantitative trait locus mapping (gray mouse). Subsequently, fine-mapping strategies (recombinant progeny testing and recombinant inbred segregation test, see text), sequence-based analysis and mRNA profiling (dark/light blue and red circles, respectively) are performed in parallel, and the overlapping genes are selected and prioritized. Following the selection of the most promising candidate gene, its role in pain is confirmed by behavior and functional analyses in mutated mice (stargazer mice). The final step is an association testing in human cohorts (breast cancer patients) establishing the connection of the gene to neuropathic pain susceptibility.

In parallel to the QTL analysis, a second methodology is already in action. Gene expression analysis provides an independent source of information that can be of great value for the identification of the actual genes affecting a trait. The causative gene must be expressed in a trait-relevant tissue and may also exhibit varying expression levels for different states related to the trait. This analysis may highlight potentially relevant genes. This combination has the potential to reduce the list of candidate genes down to a single gene or a mere few [41, 51].

The results of the combined methods allow the selection of a leading candidate gene. It is advised, however, that this selection will be followed by examination of its relevance using a mutant mouse strain as a useful complementary tool [52], that is, the third level in this approach (Fig. 2, graph diagram). When one succeeded to tie the selected candidate gene to the trait of interest, the transnational stage is coming into effect in the form of human association study for the selected candidate only (Fig. 2, human cohort diagram).

Beyond the purpose of actual gene identification in a field that is eager for new genetic targets, this approach enables the moving in a timely fashion from QTL to quantitative trait gene (QTG). The ultimate proof is not complete until one can specify which polymorphic sites in the identified gene actually cause the difference in the trait phenotype - the quantitative trait nucleotides (QTN). For that purpose, the use of additional molecular methods, perhaps augmented by pharmacological approaches, needs to be considered. We argue that the integrated approach has the potential to move one rapidly also to this final stage.

It is important to add that even with the decreasing costs of genome sequencing, executing large-scale GWAS is still very expensive. Therefore, identifying genes in animal models and then translate the data to humans can still be more cost effective.

Ниже приводятся методы идентификации CACNG2 как единственного гена, картированного после QTL [53]. Мы использовали эксперименты, не выдвигая предварительных гипотез относительно ожидаемых генетических компонентов.

Стартовой точкой идентификации гена стало выявление QTL. Seltzer et al. [25] описали QTL для нейромной модели боли в исследовании, базирующемся на RILs панели из C57BL/6J и A/J мышей. Они назвали его Pain1. Мы подтвердили это на избранных предшественниках инбредных линий (C3H/Hen и C58/J) [24]. Выбор этих линий базировался на их чрезвычайно контрастном болевом фенотипе и низкой вариабельности в этих линиях (Fig. 1). C3H/Hen и C58/J BC популяции были созданы для инициальной детекции QTL (Fig. 2, gray mouse image). Был проведен скрининг всего генома и тесты на сцепление и была верифицирована связь региона на хромосоме 15 и фенотипом нейропатической боли. Картирование привело к тому же самому региону на Chr.15.

Следующей важной ступенью на пути идентификации QTL стало использование соотв. стратегии тонкого картирования. Следовало сделать выбор, исходя из информации о способе наследования признака, доступности ресурса и т.д. [30, 32]. Тонкое картирование необходимо, чтобы редуцировать интервал картирования и ряд относящихся к делу генов кандидатов. Две эффективные техники тонкого картирования были использованы: RPT и RIST. Индивиды, несущие разные рекомбинации вдоль интервала, содержащего QTL Pain 1, были отобраны, чтобы создать RPT популяцию и сравнить болевое поведение между RPT семьями.

Чтобы ускорить тонкое картирование мы использовали параллельно RIST стратегию. Прародителями RIST были C57BL/6J и A/J RILs, несущие рекомбинационные точки внутри картируемого интервала. Уменьшение количества возможных причинных генов стало первой стадией проекта. Это уменьшение было достигнуто путем комбинирования стратегий тонкого картирования RPT и RIST (Fig. 2, Venn diagram).

Болевое поведение предшественников каждой популяции было хорошо охарактеризовано [21, 23], и комбинация результатов позволила достичь цели, драматически уменьшив размер интервала до 4.2 Mbp с первоначального интервала картирования ~50 Mbp (25 cM) [24]. Использование плотной карты SNP мыши показало её пригодность для уменьшения количества причинных генов в данном регионе [54]. Анализ in silico - комбинаций профилей всеобъемлющего болевого поведения для более 10 инбредных линий мышей предоставил дополнительную SNP информацию, позволившую исключить существенное число генов. Этот in silico анализ включал полиморфные SNP из всех геномных функциональных классов (e.g. Coding non-synonymous, 3'/5' UTR, splice sites, etc.). В этом анализе, Cacng2 был отмечен в качестве возможного гена для дальнейшего исследования, из-за присутствия нескольких полиморфных SNP, отличающихся между некоторыми чувствительными к боли и устойчивыми к боли инбредными линиями. Эти SNPs располагались в основном в интронах и в 3' UTR.

Кодирующие не-синонимные SNPs были признаны как важный функциональный класс, т.к. они непосредственно затрагивали трансляцию продукта гена. Тем не менее, SNPs в др. регионах, таких как UTR регионы и интроны рассматривались как важные сайты, влияющие на экспрессию и свойства гена [55-57]. Следовательно, включение этих SNP в анализ оказалось оправданным.

Параллельно с QTL картированием и биоинформационным анализом, было использовано профилирование экспрессии мРНК. Анализ микромассивов является мощным инструментом, необходимым для оценки вклада гена в фенотип (т.к. это отражается на экспрессии генов). Профилирование экспрессии базируется на сравнении между чувствительными и толерантными к боли линиями мышей и между двумя условиями: 'sham' (т.e. отсутствию повреждения нерва) и 'поврежденным нервом' [53]. Мы установили, что экспрессия Cacng2 изменяется как в ответ на повреждение нерва (sham vs nerve injury), так и когда экспрессия Cacng2 в линии, чувствительной к нейропатической боли (C3H) сравнивалась с 4 др. разными толерантными к боли линиями. Анализ данных микромассивов является нетривиальным. Проблемы могут возникать при разработке способов для ранжирования генов, которое обычно базируется на степени различий между двумя экспериментальными условиями. Порог изменяется более чем в 1.5 раза, а значение p менее 0.001 принимается, чтобы минимизировать фальшивые положительные результаты (Fig. 2, Venn diagram).

Результаты комбинированных методов позволили нам выбрать ведущий ген кандидат. Процесс установления приоритетов в большинстве анализов (Fig. 2) указывал на Cacng2 как наиболее подходящий ген кандидат, т.к. он оказался единственным геном в интервале тонкого картирования, удовлетворяющим всем 4 критериям скрининга: (i) полная совместная сегрегация SNPs между генотипом и фенотипом, (ii) функциональная связь с болью с помощью PubMed исследования, (iii) достоверная регуляция после повреждения нерва и (iv) дифференциальная экспрессия в линиях с высокой и низкой autotomy. Ни один из др. генов не удовлетворял любым трем критериям и только 9 удовлетворяли двум критериям. Более того, дополнительно подтверждение было получено в результате иммуномечения на тканевых срезах. Этот метод подтвердил, что Cacng2 в самом деле заметно экспрессируется в PNS (L5-DRG) и что он локализуется в нейронах скорее, чем в глии или др. клетках.

Результаты картирования являются статистическими по природе, а профилирование экспрессии имеет свои собственные ограничения. Анализ экспрессии может выявить общее количество транскриптов, которое регулируется при перерезке аксонов. Однако необходимы дополнительные методы, чтобы идентифицировать какие играют важную роль в восприятии самой боли. В этом случае, необходимо тестирование эффекта Cacng2 при мутации одиночного гена (т.е. у нокаутных мышей). По этой причине, мы использовали естественно возникшую гипоморфную мутацию 'stargazer' [58]. Проверяли stargazer мышей с помощью двух тестов: (i) наблюдение болевого поведения, базирующееся на фенотипе самокалечения и (ii) электрофизиологическим методом. Stargazer мыши (с потерей транскриптов Cacng2) обнаруживали сильное болевое поведение, тогда как мыши, гетерозиготные по мутации или дикого типа не обнаруживали болевого фенотипа совсем. Второй тест на Cacng2 KO stargazer мышах с электрофизиологическим анализом спонтанных разрядов, генерируемых в центростремительных нейронах, с отсечением аксонов. Количество исследований, предоставляющих доказательства, что возникновение спонтанных разрядов в центростремительных нейронов является важным субстратом спонтанной dysesthesias и боли при разных условиях нейропатической боли [5, 59-61]. Показатель спонтанной активности был почти вдвое выше у мутантных мышей по сравнению с гетерозиготами и мышами дикого типа. Наши исчерпывающие эксперименты с использованием stargazer мышей далее подтвердили возможную роль Cacng2 в нейропатической боли.

Human pain gene

Пригодность грызунов в качестве модели для изучения нейропатической боли хорошо известна. Ключевым конечным результатом является использование этих данных применительно к человеку. Наша успешная идентификация Cacng2 в качестве гена, который вносит вклад в восприятие боли у мышей, поощрило нас посмотреть значение этой находки в контексте человека.

Главной целью исследований боли, является облегчение её у тех, кто страдает. Прогресс может выражаться в форме способствования пониманию хронического синдрома и конечно с целью улучшения терапии боли. Естественно, что после идентификации Cacng2 в качестве болевого гена у мышей мы должны были посмотреть потенциальную роль его у людей. Фантомная боль молочной железы затрагивает женщин, которые подверглись удалению груди (mastectomy) [8, 62, 63]. Мы анализировали человеческий гомолог CACNG2 в группе из 549 пациентов с раком груди. Использование стандартного анализа ассоциаций, трех SNP гаплотипов выявило его ассоциацию с тенденцией к развитию нейропатической боли после мастэктомии (Fig. 2, human cohort).

Тот факт, что определённые женщины имеют основания A-C-C в трех специфических соседних SNPs , обнаруживает существенную предсказательную силу, что может развиться послеоперативная боль (odds ratio = 1.7). Следовательно, присутствие A-C-C гаплотипа, который может быть установлен с помощью простой проверки крови, может быть использован, чтобы информировать хирургов о необходимости повышенного внимания, чтобы минимизировать повреждения нервов. Было подчеркнуто, однако, что необходим тест на воспроизводимость этой генетической находки.

Значение животных моделей для болезненных фенотипов у людей источник длительных споров среди ученых [14, 64, 65]. Несмотря на это, по крайней мере, в случае CACNG2 важность животных моделей для перенесения на фенотип человека подтверждена.

Споры относительно физиологической функции CACNG2 в боли находится вне контекста данного обзора. Дальнейшие исследования очень важны. CACNG2 изучался в основном в контексте эпилепсии [66-68]. Взаимосвязь между хронической болью и эпилепсией всё ещё неуловима. Однако разработаны некоторые прекрасные киллеры нейропатической боли из лекарств против конвульсий и эпилепсии, тем самым подтверждается связь между двумя нейрологическими феноменами, по крайней мере, фармакологической перспективе.

Parallel approaches for pain genes identification

Наши исследовательские подходы контрастируют с др.альтернативами, которые обычны в области исследований боли. Так, огромное большинство исследований генетики боли базируется на подходах к генам кандидатам. Стратегия предварительно избранных кандидатов имеет преимущество в том, что способна связать генотип с фенотипом. Если имеются данные относительно генного продукта и паттерна его экспрессии, то может быть установлена связь с этим признаком. Обнаружены некоторые гены ассоциируют с разными фенотипами хронической боли. Напр., следующие: COMT [69], µ-opioid receptor [70], DRD4 [71] и др. гены. Слабость подхода гена кандидата в том, что он предмет необоснованной склонности, из-за количества предположений a priori , высказываемых при выборе кандидата для тестирования. Альтернативно, GWAS является хорошо обоснованной стратегией с большим преимуществом в виде высокого разрешения, которое позволяет открывать любой локус с незначительным эффектом на фенотип. Несмотря на то, что множество статистических затруднений связано с громадными размерами выборок и использований множественных тестирований, GWAS становится стандартной методологией для открытия новых причинных генов [45, 72]. Однако, если это касается боли, то GWAS используется очень редко. Основная причина в том, что благонадежный GWAS нуждается в огромном количестве аккуратно фенотипированных индивидов с соотв. подобранными контролями. Количества, необходимые для GWAS очень трудно получить в области исследований боли, поскольку необходимы субъекты с идентичной патологией. Болевые GWAS могут быть осуществлены только в сотрудничестве многих сторон, как это осуществляется в отношении др. признаков [73, 74]. Кроме того, такое сотрудничество должно базироваться на стандартизированном методе исследования боли, который всё ещё редок среди большинства лабораторий и клиник, связанных с болью. Недавно такое сотрудничество дало достоверные результаты для мигрени [75]. Но оно всё ещё остается исключением на арене генетики боли.

Neely et al. [76] применили слегка отличный подход, добавив др. модельный организм в уравнение. Геномный скрининг Drosophila проведен с целью идентифицировать новые термальные болевые (nociception) гены. Одиночный ген кандидат был позднее отобран из результатов первичного скрининга из более чем 500 потенциальных кандидатов, исходя из их известной связи с широко используемыми аналгетиками нейропатической боли у людей. Отобранный ген (a2d3) в дальнейшем был тестирован в отношении ассоциации с болевым фенотипом у мышей и людей. Выбор a2d3 среди большого количества генов кандидатов, базируясь на a priori знаниях физиологических характеристик, может рассматриваться как отрицательная сторона, сужение границ открываемых генов. Первая стадия исследования, состоящая в беспристрастном геномном скрининге, практически не нужна. Напротив, при интегрированном подходе, описанном выше, не учитывается физиологическая информация перед выбором гена кандидата Cacng2. Скорее выбор базируется на конвергенции разных генетических подходов. Др. подход проиллюстрирован недавно Costigan et al. [77], которые использовали профилирование экспрессии микромассивов у мышей в качестве единственного инструмента скрининга для идентификации болевого гена. Согласно их анализу, несколько генов (более 100) были отмечены как гены кандидаты. Значение отобранного гена (KCNS1) тестировали на некоторых группах людей с разными синдромами хронической боли.

Возможно наилучшей 'проверкой концепции' интегрированного подхода является недавняя находка, достигнутая тем же способом. Недавно, Mogil et al. [78] использовали сходный подход для выяснения роли рецептора vasopressin-1A в чувствительности к боли. Осуществление этого подхода той же группой привело к идентификации P2X7 рецептора (P2X7R) в качестве др. нового болевого гена, влияющего на чувствительность к хронической боли у мышей и людей [79]. Наша успешная идентификация CACNG2 в качестве гена нейропатической боли, а также недавно опубликованные исследования рекомендуют интегрированный подход в качестве платформы для беспристрастного вычленения сложных признаков.

Future directions of pain genetics

Integrating genetics, bioinformatics and expression data can be highly useful for understanding more comprehensively the complex features of pain genetics and physiology and how genetic polymorphisms affect pain phenotype, susceptibility to pain after nerve injury, for example. Nevertheless, the addition of more analytical tools such as cognitive methodologies and advanced imaging techniques brings considerable optimism for deciphering the elusive ‘pain matrix’.

From a different angle, the emerging world of stem cell research and regenerative medicine bears great promise for both basic science and pain treatments. For example, the ability to reprogram cells makes it possible to focus on neurological features of the individual patient, characterize them and perform screening for different agents [80-82]. In a recent study, Franchi et al. [83] showed the treatment of neuropathy by using neuronal stem cells in an animal model.

Pain genetics has just matured from its juvenile stage. It can be benefited from the methods and techniques pioneered by others. As networking between different disciplines (such as the different ‘omics’) becomes routine in science, it is hoped that future discoveries will illuminate understanding of not only pain physiology and genetics per se but also other traits such as human cognitive development, behavior and perception.

From mouse to humans: discovery of the CACNG2 pain susceptibility gene J Nissenbaum Clinical Genetics Volume 82, Issue 4, pages 311–320, October 2012

From mouse to humans: discovery of the CACNG2 pain susceptibility gene
J Nissenbaum
Clinical Genetics Volume 82, Issue 4, pages 311–320, October 2012