Эмбриональное развитие является процессом, характеризующимся быстрым регулярными сменами клеточных состояний, возникающими в результате динамических изменений в программах генной экспрессии. Эти изменения в экспрессии генов инициируются в результате быстро меняющихся внешнесредовых сигналов, которые влияют на клеточные состояния, изменяя структуру хроматина и транскрипцию генов. Растут доказательства, подтверждающие, изменения в специфических модификациях гистонов, особенно триметилирования гистона H3 по lysines 4 и 27, могут играть роль в координации этого высоко контролируемого процесса. Хотя H3K4me3 обнаруживается практически вовсех активных transcriptional start sites (TSS) (Schneider et al., 2004), концентрация H3K27me3 происходит в генах, которые транскрипционно репрессируются с помощью белков Polycomb group (PcG) (Cao et al., 2002). Геномные исследования показали, что PcG-зависимое триметилирование H3K27 не является универсальным механизмом репрессии, но репрессирует ограниченный субнабор генов, которые обычно кодируют онтогенетические регуляторы (Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006). Отметим, что в недифференцированных embryonic stem cells (ESCs), большая порция онтогенетических генов, триметилирования по H3K27, также обогащена H3K4me3, создаются бивалентные состояния, при которых гены уравновешены в отношении будущей активации, но остаются неактивными до тех пор, пока не будет удалена репрессивная метка (Bernstein et al., 2006). Когда ESCs дифференцируются в нейроны или фибробласты, то многие из этих генов разрешаются от своего бивалентного состояния или с помощью H3K27me3 или H3K4me3 (Mikkelsen et al., 2007). Однако, критические вопросы о значении H3K27me3 и H3K4me3 модификаций в развитии ткани и органа остаются нерешенными. Напр., всё ещё неясно, ассоциированы ли H3K27me3- и H3K4me3-зависимые изменения в структуре хроматина с быстрыми клеточными переходами в развитии, и может ли бивалентность, однажды устраненная, быть снова восстановлена и может ли этот механизм быть важен во время терминальной дифференцировки, когда клетки приобретают свои функциональные свойства.

Основным ограничением в исследовании этих важных вопросов является то, временные клональные промежуточные состояния не могут быть выявлены в достаточном количестве из эмбрионов, чтобы осуществить глобальное профилирование хроматина. Это препяствие может быть преодолено путем рекапитуляции важных ступеней развития in vivo в in vitro посредством направленной дифференцировки ESCs. Недавно разработан протокол панкреатической дифференцировки, которые в основном базируется на человеческих ESCs (hESCs) под действием разных сигнальных факторов, тем самым клетки постепенно проводятся через несколько популяций предшественников в направлении приобретения панкреатической судьбы (D'Amour et al., 2006; Kroon et al., 2008). Во-первых, hESCs понуждаются к развитию в дефинитивную энтодерму (DE), которая является преходящей популяцией развивающихся клеток, которая дает кишечник, легкие, печень и поджелудочную железу. DE затем превращается в клетки примитивной кишечной трубки (GT). Внешние сигналы, как известно, участвуют в передне-задней регионализации GT, и затем используются, чтобы генерировать заднюю кишку (FG), это сопровождается индукцией панкреатической энтодермы (PE). После имплантации мышам происходящая из hESC PE на поздних стадиях культивирования дифференцируется в чувствительные к глюкозе, инсулин секретирующие β клетки, способные к устранению диабета (Kelly et al., 2011; Kroon et al., 2008). Т.о., этот протокол дифференцировки позволяет нам понять как клетки переходят от промежуточной стадии развития и детерминируют механизмы ремоделирования хроматина, связанные с этими переходами.

В противоположность клеткам, продуцирующим инсулин, после трансплантации, инсулин+клетки, сгенерированные in vitro лишены характеристик зрелых β клеток. Такие клетки продуцируют мало инсулина, они не реагируют на глюкозу и часто одновременно экспрессируют др. панкреатические гормоны (D'Amour et al., 2006). Следовательно, хотя PE, генерируемые с помощью направленной дифференцировки из hESCs, компетентны дифференцироваться в функциональные β клетки, когда имплантируются мышам, но на сегодня зрелые β клетки не могут быть получены in vitro. Необходимо определить, насколько близко молекулярные характеристики β клеток, происходящих из hESC, напоминают таковые в их первичных аналогах у человека и какие из этих признаков не могут быть воспроизведены in vitro.

В данном исследовании мы изучали изменения архитектуры хроматина, связанные с быстрыми клеточными переходами развития за счет проведения RNA-seq профилирования, а также ChIP-seq для H3K27me3 и H3K4me3 клональных промежуточных производных по время ступенчато-образной панкреатической дифференцировки из hESCs in vitro и после дифференцировки in vivo функциональных эндокринных (FE) клеток у мышей. Мы продемонстрировали, что бивалентность является чрезвычайно динамичной и тесно ассоциирована с активацией и замалчиванием онтогенетических регуляторов во время прогрессирования клонов. Более того, мы установили, что хроматин из критических генов β клеток аберрантно ремоделируется во время эндокринной дифференцировки in vitro.

DISCUSSION

The Role of PcG-Dependent Repression and Derepression Mechanisms during Progression of Pluripotent Cells toward the Pancreatic Endocrine Lineage

Из-за ограниченной доступности и небольших размеров переходной клеточной популяции эмбриональных клеток, бивалентные домены были изучены в избирательных клеточных контекстах (Bernstein et al., 2006; Lien et al., 2011; Mikkelsen et al., 2007; Pan et al., 2007). Следовательно, сосуществование репрессирующих H3K27me3 и активирующих H3K4me3 гистоновых меток в одном и том же локусе остается спорным, поскольку нелегко определить, представляют ли эти двойные гистоновые метки разные клетки внутри гетерогенной ткани.

В данном исследовании мы экспериментально продемонстрировали конкурентное обогащение H3K4me3 и H3K27me3 в одном и том же локусе и показали, что на каждой такой ступени клонального прогрессирования критические регуляторы развития теряют свое бивалентное состояние с одновременно активацией генов. Т.о., наше исследование подтверждает существование бивалентных доменов и предоставляет чёткие доказательства их биологической важности. Напр., группа генов демонстрирующая бивалентность в hESCs, теряет H3K27me3, а индукция экспрессии на DE стадии включает большинство известных детерминант клеточных судеб, участвующих в формировании DE. Сходным образом, основные регуляторы раннего развития поджелудочной железы, следуют этому паттерну во время образования PE. Следовательно, удаление PcG-обусловленной репрессии, по-видимому, является преимущественным механизмом индукции для генов, участвующих в прогрессии онтогенетических клонов. Следовательно, гены с всё ещё неизвестными функциями, демонстрирующие стадио-специфическую индукцию и потерю бивалентности, скорее всего, выполняют онтогенетическую роль. Особенно интересным оказалось присутствие некоторых компонентов сигнальных путей Notch и Netrin в этом коротком списке генов, связанных с панкреатической клональной детерминацией. Хотя передача сигналов Notch имеет хорошо известную роль в терминальной дифференцировке панкреатических клеток (Apelqvist et al., 1999), но всё ещё неизвестно необходима ли передача сигналов Notch или Netrin для детерминации клеток в панкреатический клон. Известно, что Netrins экспрессируются в эмбриональных панкреатических эндотелиальных клетках (Yebra et al., 2011) и эндотелиальные сигналы необходимы для раннего развития поджелудочной железы (Lammert et al., 2001), подтверждая, что Netrins могут передавать сигналы между эндотелием и предшественниками передней кишки во время индукции панкреатической судьбы.

Мы установили, что критические транскрипционные регуляторы образования DE первыми демонстрируют удаление PcG репрессии при возникновении DE и затем быстро снова приобретают PcG репрессию после выхода из стадии DE. Базируясь на наблюдении, что SMAD2/3 рекрутируют H3K27 demethylase JMJD3 на EOMES, SOX17 и GSC (Kim et al., 2011; Teo et al., 2011), было предположено, что активация энтодермальных генов зависит от активного удаления H3K27me3 репрессивных меток. Было продемонстрировано непосредственно, что JMJD3-обеспечиваемое удаление H3K27me3 необходимо для активации DE-специфических генов, наше исследование выявило причинную роль модификаций H3K27me3 в регуляции генов. Более того, мы показали, что во время прогрессирования клонов ключевые регуляторы формирования DE быстро восстанавливают PcG-зависимые модификации H3K27me3, приводя к быстрой потере экспрессии генов после выхода из DE стадии. Многие из генов, восстанавливающих H3K27me3 репрессивную метку при выходе из DE (т.e., ROR2 и SOX17), нуждаются в реактивации, когда DE дифференцируется в др. DE-производные ткани и органы, такие как лёгкие, кишечник или желчный пузырь (Spence et al., 2009; Yamada et al., 2010). Т.о., PcG-обеспечиваемая репрессия генов, по-видимому, представляет собой особенно быстрый и гибкий способ регуляции генов во время дифференцировки и, следовательно, специфически связан с генами, важными для переходных промежуточных клонов. Этот механизм может также иметь отношение к сходной регуляции генов во время развития др. зародышевых слоёв, поскольку он позволяет клеткам поддерживать молекулярную гибкость быстрого восстановления экспрессии в более поздние временные точки.

Наши данные далее выявили, что переход от бивалентности к активному H3K4me3 состоянию также ассоциирует с индукцией генов, важных для функции эндокринных клеток во время терминальной дифференцировки. Такие контрастирующие находки выявлены в нейрональном развитии, во время которого большинство бивалентно модифицированных генов теряют бивалентность при переходе к нейрональным предшественникам, но не во время терминальной дифференцировки в нейроны (Mikkelsen et al., 2007). Т.о., наше исследование выявило роль бивалентных доменов после ранней детерминации клонов и продемонстрировало различия в том, как архитектура хроматина ремоделируется во время развития разных тканей.

Aberrant Chromatin Modifications during Endocrine Differentiation In Vitro

Основным ограничением существенного оздоровительно эффекта является то, что условия культивирования, поддерживающие эффективную продукцию β клеток, способных к устранению диабета, ro` предстоит идентифицировать. В настоящее время, эффект большого количества разных культуральных условий на созревание β клеток трудно проверить in vitro, поскольку аналитические инструменты в основном ограничены функциональными исследованиями зависимой от глюкозы секреции инсулина. Наш анализ глобальной экспрессии генов показал, что трансплантации PE мышам вызывают программу экспрессии генов, удивительно сходную с таковой в первичных островках человека.

Список генов, которые отличаются в in vivo- от in vitro-дифференцированных клеток, может стать ценным молекулярным показателем для оценки степени, с которой модифицированные культуральные условия могут продуцировать клетки in vitro с очень высоким сходством с функциональными β клетками.

Мы наблюдали, что недостаточность индукции эндокринных генов in vitro связана с аберрантным паттерном модификации гистонов во время терминальной дифференцировки в эндокринные клетки. Этот аберрантный паттерн, по-видимому, важен для генов β клеток, таких как инсулиновый, недавно идентифицированная метка UCN3 созревания β клеток (Blum et al., 2012) и рецепторы FFAR1 и GLP1, которые модулируют зависимую от глюкозы секрецию инсулина (Ito et al., 2003; Preitner et al., 2004). Т.о., неправильное ремоделирование хроматина во время терминальной эндокринной дифференцировки in vitro может быть важным фактором, который вносит вклад в аномальную функцию этих клеток. Отметим, TFs, как известно, регулирующие функциональные свойства β клеток, такие как MODY3 ген HNF1A (Horikawa et al 1997) и с type 2 diabetes-ассоциированные гены TCF7 an HHEX (Sladek et al., 2007), также недостаточно индуцируются во время дифференцировки in vitro. Можно предположить, что отсутствие этих TFs может быть ответственным за недостаточную активацию и несоответствующее ремоделирование хроматина генов β клеток, таких как insulin, UCN3, FFAR1 и GLP1R во время дифференцировки in vitro. Подтверждает эту идею то, что HNF1A, как было установлено, рекрутирует комплексы, модифицирующие гистоны, которые ведут к сайт-специфическому метилированию H3K, предупреждая при этом H3K27 триметилирование (Luco et al 2008). Дальнейшие эксперименты позволять установить, могут ли манипуляции с этими TFs или хроматин модулирующими энзимами помочь продуцировать полностью дифференцированные β клетки in vitro. Протоколы по генерации таких клеток будут иметь важное значение для заместительной клеточной терапии и изучения патогенеза диабета.