Эмбриональное развитие является процессом, характеризующимся быстрыми изменениями в клеточных состояниях, возникающими в результате динамических изменений программ экспрессии генов. Эти изменения экспрессии генов инициируются за счет быстро изменяющихся внешних сигналов, которые воздействуют на клеточные состояния за счет изменения структуры хроматина и транскрипции генов. Растут доказательства, подтверждающие, что изменения в специфических гистоновых модификациях, особенно триметилирования гистона H3 по лизинам 4 и 27, могут играть роль в координации высоко регулируемых процессов. Хотя H3K4me3 обнаруживается практически во всех активных transcriptional start sites (TSS) (Schneider et al., 2004), обогащение H3K27me3 происходит в генах, которые транскрипционно репрессируются с помощью белков Polycomb group (PcG) (Cao et al., 2002). Геномные исследования показали, что PcG-зависимое триметилирование H3K27 не является универсальным механизмом репрессии, а репрессирует ограниченный субнабор генов, которые обычно кодируют регуляторы развития (Boyer et al., 2006; Lee et al., 2006). Отметим, что недифференцированных embryonic stem cells (ESCs), основная часть онтогенетических генов, которые оказываются триметилированными по H3K27, оказываются также обогащенными и по H3K4me3, это создает бивалентное состояние, при котором гены подготовлены для будущей активации, но остаются неактивными вплоть до тех пор, пока репрессивная метка не будет удалена (Bernstein et al., 2006). Когда ESCs дифференцируются в нейроны или фибробласты, то многие из этих генов теряют свое бивалентное состояние или по H3K27me3 или H3K4me3 (Mikkelsen et al., 2007). Однако остается нерешенным критический вопрос о значении модификаций H3K27me3 и H3K4me3 в развитии тканей и органов. Напр., всё ещё неясно, ассоциированы ли H3K27me3- и H3K4me3-зависимые изменения в структуре хроматина с быстрыми клеточными переходами развития, может ли бивалентность, однажды утерянная, быть восстановлена и имеет ли этот механизм отношение к терминальной дифференцировке, когда клетки приобретают свои функциональные свойства.

Aberrant Chromatin Modifications during Endocrine Differentiation In Vitro

→ Pancreatic lineage progression is governed by PcG-dependent chromatin remodeling → A temporal chromatin signature predicts regulators of pancreatic development →Endocrine cells differentiated from hESCs in vivo are similar to native human islets → In vitro-produced malfunctioning endocrine cells exhibit aberrant chromatin structure

Основным ограничением исследования этих важных вопросов является то, что преходящие клональные промежуточные состояния не могут быть выделены в достаточных количествах из эмбрионов, для глобального профилирования хроматина. Это ограничение может быть преодолено за счет воспроизведения важных ступеней развития in vivo в in vitro с помощью направленной дифференцировки ESCs. Недавно разработан протокол панкреатической дифференцировки, согласно которому человеческие ESCs (hESCs) подвергаются действию разных сигнальных факторов, заставляя тем самым двигаться ступенчато-образно клетки через несколько популяций предшественников в направлении панкреатической судьбы (D'Amour et al., 2006; Kroon et al., 2008). Во-первых, hESCs индуцируются к развитию в definitive endoderm (DE), которая является временной онтогенетической популяцией клеток, которая дает кишечник, легкие, печень и поджелудочную железу. DE затем превращается в клетки примитивной gut tube (GT). Внешние сигналы, которые, как известно, участвуют в передне-задней регионализации GT, последовательно прилагаются, чтобы генерировать заднюю часть передней кишки (FG), что сопровождается индукцией pancreatic endoderm (PE). После имплантации мышам, происходящие из hESC, PE из культур поздних стадий дифференцируются в чувствительные к глюкозе, продуцирующие инсулин β клетки, способные устранять диабет (Kelly et al., 2011; Kroon et al., 2008). Т.о.. этот протокол дифференцировки позволяет нам исследовать, как клетки переходят через промежуточные стадии развития и осуществляют механизмы ремоделирования хроматина, связанные с этими переходами.

В противоположность инсулин-продуцирующим клеткам, получаемыми после приживления трансплантата, insulin+cells, генерируемые in vitro, лишены характеристик зрелых β клеток. Эти клетки продуцируют мало инсулина, не реагируют на глюкозу и часто одновременно экспрессируют др. панкреатические гормоны (D'Amour et al., 2006). Следовательно, хотя PE и генерируются за счет направленной дифференцировки hESCs они оказываются компетентными дифференцироваться в функциональные β клетки только будучи трансплантированными мышам, в настоящее время зрелые β клетки не могут быть получены in vitro. Остается установить как очень похожие молекулярные признаки β клеток, происходящих из hESC, напоминают таковые своих первичных человеческих аналогов, и какие из этих признаков недостаточно индуцируются in vitro.

В данном исследовании мы анализировали изменения в архитектуре хроматина, ассоциированные с быстрыми клеточными переходами развития с помощью осуществления RNA-seq профилирования, а также с помощью ChIP-seq для H3K27me3 и H3K4me3 клональных промежуточных образований во время постепенной панкреатической дифференцировки из hESCs in vitro и после дифференцировки in vivo в функциональные эндокринные (FE) клетки мышей. Мы продемонстрировали, что бивалентность чрезвычайно динамична и тонко ассоциирована с активацией и замалчиванием онтогенетических регуляторов во время прогрессирования клонов. Более того, мы выявили, что хроматин из критических генов β клеток аберрантно ремоделируется во время дифференцировки эндокринных клеток in vitro .

DISCUSSION

The Role of PcG-Dependent Repression and Derepression Mechanisms during Progression of Pluripotent Cells toward the Pancreatic Endocrine Lineage

Из-за ограниченных доступности и количеств переходных популяций эмбриональных клеток, бивалентные домены были изучены только в отобранных клеточных контекстах (Bernstein et al., 2006; Lien et al., 2011; Mikkelsen et al., 2007; Pan et al., 2007). Следовательно, сосуществование репрессивной H3K27me3 и активирующей H3K4me3 гистоновых меток в одном и том же локусе оставалось спорным, поскольку нелегко определить, представлена ли эта двойная гистоновая метка в разных клетках в гетерогенной ткани. Мы экспериментально продемонстрировали конкурентное обогащение H3K4me3 и H3K27me3 в одном и том же локусе и показали, что на каждой ступени прогрессирования клона критические онтогенетические регуляторы принимают решение о их бивалентном состоянии в соответствии с активацией гена. Т.о., наше исследование подтвердило существование бивалентных доменов и предоставило четкие доказательства их биологического значения. Напр., группа генов, обнаруживающая бивалентность в hESCs, теряет H3K27me3, и индукция экспрессии на ст. DE, включает большинство известных детерминантов клеточных судеб, необходимых для формирования DE. Сходным образом, большинство регуляторов раннего развития поджелудочной железы следует этому паттерну во время формирования PE. Следовательно, удаление PcG-обеспечиваемой репрессии, по-видимому, является преимущественным механизмом индукции для генов, участвующих в онтогенетическом прогрессировании клонов. Следовательно, гены со всё ещё неизвестными функциями, обладающие стадио-специфической индукцией и потерей бивалентности, скорее всего, выполняют онтогенетические роли. Особенно интересным было присутствие нескольких компонентов из путей передачи сигналов Notch и Netrin в этом коротком списке генов, ассоциированных с детерминацией панкреатических клонов. Хотя передача сигналов Notch обладает хорошо известной ролью в терминальной дифференцировке панкреатических клеток (Apelqvist et al., 1999), всё ещё неизвестно, необходимы ли передача сигналов Notch или Netrin для детерминации клеточной судьбы в панкреатический клон. Отметим, что Netrins экспрессируются в эмбриональных эндотелиальных клетках (Yebra et al., 2011) , а эндотелиальные сигналы необходимы для раннего развития поджелудочной железы (Lammert et al., 2001), подтверждая, что Netrins д. пересылать сигналы между эндотелием и предшественниками передней кишки во время индукции панкреатической судьбы.

Мы установили, что критическим транскрипционным регулятором формирования DE является первое продемонстрированное удаление PcG репрессии при вступлении в DE и затем быстрое приобретение вновь PcG репрессии после выхода из ст. DE. Базируясь на наблюдении, что SMAD2/3 рекрутирует H3K27 деметилазу JMJD3 на EOMES, SOX17 и GSC (Kim et al., 2011; Teo et al., 2011), было предположено, что активация энтодермального гена зависит от активного удаления H3K27me3 репрессивных меток. С помощью прямой демонстрации, что JMJD3-обеспечиваемое удаление H3K27me3 необходимо для активации специфичных для DE генов, наше исследование установила причинную роль модификации H3K27me3 в регуляции генов. Более того, мы показали, что во время прогрессии клонов ключевые регуляторы формирования DE быстро восстанавливают PcG-зависимые модификации H3K27me3, приводящие к быстрой потере экспрессии генов после выхода из ст. DE. Многие из генов, восстанавливающие H3K27me3 репрессивную метку при выходе из DE (напр., ROR2 и SOX17) нуждаются в реактивации, когда DE дифференцируется в др. происходящие из DE ткани и органы, такие как легкие, кишечник или желчный пузырь (Spence et al., 2009; Yamada et al., 2010). Т.о., PcG-обеспечиваемая репрессия генов, по-видимому, осуществляется особенно быстро и выступает в качестве гибкого способа регуляции генов во время дифференцировки и поэтому специфически ассоциирует с генами, важными для переходных промежуточных клонов. Этот механизм может также иметь отношение к подобной регуляции генов во время развития др. зародышевых слоёв, поскольку это позволяет клеткам сохранять молекулярную гибкость быстро восстанавливаемой экспрессии в более поздние временные моменты.

Наши данные далее подтвердили, что устранение бивалентности, чтобы активировать H3K4me3 состояние, также связано с индукцией генов, важных для функции эндокринных клеток во время терминальной дифференцировки. Это противоречит находкам в нервном развитии, при котором большинство первоначально бивалентно модифицированных генов, теряет бивалентность в нейрональных предшественниках, а не во время терминальной дифференцировки в нейроны (Mikkelsen et al., 2007). Т.о., наше исследование выявило роль бивалентных доменов после ранней детерминации клонов и продемонстрировало различия в том, как архитектура хроматина ремоделируется во время развития в разных ткагнях.

Основным ограничением является то, что культуральные условия, поддерживающие эффективную продукцию β клеток, способных к устранению диабета, ещё не идентифицированы. Сегодня эффекты большого количества разных культуральных условий на созревание β клеток трудно проверять in vitro, поскольку инструменты анализа в основном ограничены функциональными исследованиями зависимой от глюкозы секреции инсулина. Наш анализ глобальной экспрессии генов показал, что трансплантации PE мышам индуцируют программу генной экспрессии с удивительным сходством с таковой в первичных островках человека. Список генов, которые отличаются при in vivo- от in vitro-дифференцировки в клетках, д. быть ценным молекулярным показателем для оценки степени, с которой модифицированные культуральные условия могут продуцировать клетки in vitro очень сходные с функциональными β клетками.

Мы наблюдали, что недостаточная индукция эндокринных генов in vitro ассоциирует с аберрантным паттерном модификаций гистонов во время терминальной дифференцировки в эндокринные клетки. Этот аберрантный паттерн наблюдается на важных для β клеток генах, таких как insulin, недавно идентифицированный маркер созревания β клеток UCN3 (Blum et al., 2012), и FFAR1 и GLP1 рецепторы, которые модулируют зависимую от глюкозы секрецию инсулина (Itoh et al., 2003; Preitner et al., 2004). Т.о., некорректное ремоделирование хроматина во время терминальной эндокринной дифференцировки in vitro может быть важным фактором, который вносит вклад в нарушение функции этих клеток. Отметим, что TFs, как известно, регулирующие функциональные свойства β клеток, такие как MODY3 ген HNF1A (Horikawa et al., 1997) и type 2 diabetes-ассоциированные гены TCF7 и HHEX (Sladek et al., 2007), также недостаточны, чтобы индуцировать дифференцировку in vitro. Время предполагать, что эти TFs могут быть ответственны за недостаточную активацию и неправильное ремоделирование хроматина генов β клеток, таких как insulin, UCN3, FFAR1 и GLP1R во время дифференцировки in vitro. Подтверждает эту идею, что HNF1A, как было установлено, рекрутирует гистон-модифицирующие комплексы, это ведет к сайт-специфическому метилированию H3K4, при этом предупреждается триметилирование H3K27 (Luco et al., 2008). Дальнейши е эксперименты позволят определить, могут ли манипуляции с этими TFs или хроматин-модифицирующими энзимами помочь продуцировать полностью дифференцированные β клетки in vitro. Протоколы продукции таких клеток будут иметь важное значение для заместительной клеточной терапии и изучения патогенеза диабета.