Отсутствие кровеносных сосудов в зрелой роговице является критическим для её прозрачности и функции зрения. Лишенная сосудов взрослая роговица активно поддерживается за счет баланса между про-ангиогенными и анти-ангиогенными факторами (Ambati et al., 2007; Ellenberg et al., 2010; Han and Zhang, 2010). Несовсем ясно отсутствие сосудов роговицы устанавливается во время развития или про- и анти-ангиогенные факторы регулируют этот процесс.

Во время эмбрионального развития эндотелиальные клетки предшественники (ангиобласты) мигрируют на длинные расстояния, пролиферируют и сливаются в примитивные кровеносные сосуды во время процесса васкулогенеза. Этот процесс обеспечивает образование не закупоренных просветов сосудов и формирует сосудистую сеть, которая транспортирует кровь, богатую кислородом, питательными веществами и клетками для развивающейся ткани (Risau and Flamme, 1995; Eichmann et al., 2005; Ferguson et al., 2005; Schmidt et al., 2007). По мере роста эмбриона некоторые примитивные кровеносные сосуды удаляются, тогда как др. соединяются с соседними сосудистыми разрастаниями, чтобы сформировать стабильные крупные сосуды, которые позднее проникнут в новые регионы посредством процесса, известного как ангиогенез.

Чтобы поддерживать собственно васкуляризацию тканей во время эмбриогенеза и у взрослых проникновение сосудов в результате васкулогенеза и ангиогенеза тонко регулируется за счет комплементарного действия про- и анти-ангиогенных факторов, расположенных внутри окружающей среды, где они сталкиваются. Многочисленные ростовые факторы и регуляторные белки, которые управляют миграцией ангиобластов или участвуют в стабилизации сосудов, были идентифицированы (Lindahl et al., 1997; Adams and Alitalo, 2007; Gaengel et al., 2009; Adams and Eichmann, 2010; Hellberg et al., 2010; Tam and Watts, 2010; Crivellato, 2011). Про-ангиогенные факторы, включая vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF) и platelet-derived growth factor B (PDGFB) способствуют миграции, пролиферации и дифференцировке ангиобластов и эндотелиальных клеток. Нулевые мутации VEGFA, PDGFB или их соотв. рецепторов, VEGFR1, VEGFR2, и PDGFR-β, вызывают сосудистые и кардиальные дефекты, которые приводят к гибели эмбрионов (Tomanek et al., 2001; Bjarnegard et al., 2004). Дефицит FGF2, FGFR1 и FGFR2 приводят к дефектам сосудов и др. аномалиям развития (Blaber et al., 1999; Miller et al., 2000; Murakami et al., 2008). Напротив, анти-ангиогенные факторы, включая Semaphorins (Sema3A и Sema3E), Netrins (Netrin1 и Netrin4) и soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt1, укороченная форма VEGFR1) оказывают эффекты, противоположные про-ангиогенным факторам во время васкулогенеза. Semaphorins и Netrins действуют как отталкивающие сигналы наведения, которые подавляют миграцию эндотелиальных клеток (Gu, 2005; Guttmann-Raviv et al., 2007; Acevedo et al., 2008; Bouvree et al., 2008; Lejmi et al., 2008; Sakurai et al., 2010), тогда как sFlt1 соединяется с и секвестрирует VEGFA во внеклеточной среде (Aiello et al., 1995; Ambati et al., 2006).

Кровеносные сосуды, которые снабжают взрослую роговицу, были отслежены от их источника от глазничной артерии, которая ветвится по мере её роста в направлении передней части глаза, чтобы сформировать артерии цилиарных тел из расположенного вокруг роговицы сосудистого сплетения в регионе лимба, соседствующего с роговицей. Присутствие физического барьера внутри переходной лимбической области, которая отделяет лишенную сосудов роговицу от снабженного многочисленными сосудами лимба всё ещё предмет споров (Ellenberg et al., 2010). Однако недавние исследования оспорили эту гипотезу, продемонстрировав, что неоваскуляризация может быть индуцирована путем добавления про-ангиогенных факторов, таких как VEGF, FGF и PDGF во взрослую роговицу (Kenyon et al., 1996; Auerbach et al., 2003; Zhang et al., 2009; Cao et al., 2011). Как индуцированная, так и патологическая неоваскуляризация роговицы может быть подавлена добавлением анти-ангиогенных факторов (Ambati et al., 2006; Benny et al., 2010; Chen et al., 2010). Кроме того, наше предыдущее исследование показало, что не существует такого физического барьера во время развития роговицы, поскольку клетки нервного гребня из окружающего глаз региона (Hay, 1980; Creuzet et al., 2005) мигрируют между эктодермой и хрусталиком, чтобы сформировать эндотелий и строму роговицы (Lwigale et al., 2005). Сегодня неясно, мигрируют ли ангиобласты в презумптивную роговицу одновременно с клетками нервного гребня. Кроме того, неясно также, регулируются ли миграция ангиобластов и васкулогенез за счет баланса между про- и анти-ангиогенными факторами внутри окологлазного или роговичного окружения, чтобы установить и поддерживать васкулатуру, которая ограничивается регионом лимба.

В данном исследовании мы первоначально определили, когда устанавливается бессосудистость роговицы с помощью характерного васкулогенеза в передней части глаза. Используя Tg(tie1:H2B:eYFP) трансгенных эмбрионов перепела, мы показали, что во время развития глаз, ангиобласты мигрируют в переднюю часть глаза, но избегают презумптивную роговицу и формируют первичную сосудистую сеть в соседней области вокруг глаз. Наши данные по анализу экспрессии мРНК с помощью reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) и гибридизации in situ срезов показали, что про- и анти-ангиогенные факторы, также как и их рецепторы, экспрессируются в переднем регионе глаза во время глазного васкулогенеза. Эти данные продемонстрировали впервые, что отсутствие сосудов в роговице устанавливается одновременно с формированием стромы и подтверждают потенциальную роль про- и анти-ангиогенных факторов во время этого процесса.

Итак, мы показали, что отсутствие сосудов в роговице устанавливается рано и поддерживается во время развития глаз птиц, когда клетки нервного гребня мигрируют из окологлазной области, чтобы сформировать роговичный эндотелий и строму. Наши результаты генной экспрессии и потенциального участия в глазном васкулогенезе суммированы на схематической презентации передней части глаза (Fig. 7). Транскрипты, кодирующие про- и анти-ангиогенные факторы, экспрессируются в передней части глаза во время развития роговицы, тогда как их рецепторы экспрессируются мигрирующими ангиобластами и вновь формируемой глазной васкулатурой. Экспрессия основных про-ангиогенных факторов VEGFA, FGF2, PDGFB и анти-ангиогенных факторов sFlt1, Netrin1, Netrin4, Sema3E и Sema3A (not described in the current study), перекрывается в хрусталике и оптическом бокале. На более поздних стадиях развития глаза, VEGFA и Sema3E также перекрываются в окологлазной мезенхиме презумптивного угла между радужкой и роговицей. Принимая во внимание, что все вышеуказанные факторы секретируются в окружающей ангиобласты и формирующуюся васкулатуру среде, отсутствие миграции ангиобластов в презумптивную роговицу указывает на то, что анти-ангиогенные сигналы доминируют в этом регионе и предупреждают её вакуляризацию. Напротив, про-ангиогенные сигналы, секретируемы хрусталиком, оптическим бокалом и периокулярной мезенхимой могут доминировать в периокулярной области и делать возможной миграцию ангиобластов и развитие сосудов. Экспрессия Sema3E в переднем регионе оптического бокала подтверждает, что передача сигналов Sema3E/PlexinD1 предоставляет дополнительные ингибирующие сигналы для предупреждения миграции ангиобластов мимо кончика оптического бокала. Экспрессия Sema3G и его рецептора Npn2 формируемой васкулатурой подтверждает, что аутокринная передача сигналов Sema3G предупреждает миграцию ангиобластов как инициальную ступень в направлении васкулогенеза. Дополнительная передача сигналов Sema3G в окружающий Npn2-позитивный периокулярный нервный гребень может принимать участие в формировании перицитов и сосудистых гладких мышц, это стабилизирует вновь формируемые глазные кровеносные сосуды. Экспрессия Netrin1 в глазном бокале подтверждает, что он играет роль в предупреждении развития ретинальных кровеносных сосудов. Кроме того, при формировании сосудистого паттерна эти факторы могут играть и др. роли, такие как ведение в нейральную часть сетчатки, а также пролиферация и дифференцировка хрусталика и клеток периокулярного нервного гребня. Полученные результаты подтверждают присутствие про-ангиогенных и анти-ангиогенных факторов в передней части глаза с потенциалом контролировать формирование периокулярные кровеносные сосуды, а также поддержание безсосудистости роговицы во время развития. Сходный паттерн можно предположить на основании всё увеличивающихся доказательств, что про- и анти-ангиогенные факторы поддерживаются сбалансированными при нормальных физиологических условиях во взрослой роговице и играют жизненно важную роль в её свободе от сосудов и прозрачности. Помимо, про- и анти-ангиогенных факторов др. игроки, такие как miRNAs, которые важны как регуляторы ангиогенного процесса, и могут участвовать в васкулогенезе глаз (Suarez and Sessa, 2009; Xu, 2009). Понимание паттернов их экспрессии во время развития глаз и их взаимодействия с про- и анти-ангиогенными факторами дело будущих функциональных исследований.

Figure 7. Schematic diagram summarizing gene expression and the putative role of pro- and anti-angiogenic factors during vasculogenesis of the anterior eye. Pro- and anti-angiogenic factors are expressed in the lens, optic cup, and periocular mesenchyme (blue and red, respectively). These expression patterns suggest that corresponding proteins are secreted into the presumptive cornea and periocular region (blue and red arrows, respectively). Angioblasts, blood vessels (green), and periocular neural crest cells (gray) express receptors for the pro- and anti-angiogenic factors. Absence of angioblast migration and vasculogenesis in the developing cornea suggest a strong response to anti-angiogenic factors probably secreted by the lens and optic cup. In contrast, there is a strong response to angiogenic factors in the periocular region, which favor angioblast migration and proliferation. Brown coloration in the optic cup represents the retinal pigment epithelium. pc, presumptive cornea; PM, periocular mesenchyme; OC, optic cup; A/BV, angioblasts and blood vessels; NC, neural crest cells; VEGF, vascular endothelial growth factor; FGF, fibroblast growth factor; PDGF, platelet-derived growth factor.