Посещений:
ЗАПРОГРАММИРОВАННАЯ ГИБЕЛЬ МЕЖПАЛЬЦЕВЫХ ПРОМЕЖУТКОВ

Роль HOXA13

HOXA13 regulates Aldh1a2 expression in the autopod to facilitate interdigital programmed cell death
Siming Shou, Hanqian L. Carlson, Wilma D. Perez, H. Scott Stadler
Developmental Dynamics Volume 242, Issue 6, pages 687–698, June 2013

Background: Retinoic acid (RA), plays an essential role in the growth and patterning of vertebrate limb. While the developmental processes regulated by RA are well understood, little is known about the transcriptional mechanisms required to precisely control limb RA synthesis. Here, Aldh1a2 functions as the primary enzyme necessary for RA production which regulates forelimb outgrowth and hindlimb digit separation. Because mice lacking HOXA13 exhibit similar defects in digit separation as Aldh1a2 mutants, we hypothesized that HOXA13 regulates Aldh1a2 to facilitate RA-mediated interdigital programmed cell death (IPCD) and digit separation. Results: In this report, we identify Aldh1a2 as a direct target of HOXA13. In absence of HOXA13 function, Aldh1a2 expression, RA signaling, and IPCD are reduced. In the limb, HOXA13 binds a conserved cis-regulatory element in the Aldh1a2 locus that can be regulated by HOXA13 to promote gene expression. Finally, decreased RA signaling and IPCD can be partially rescued in the Hoxa13 mutant hindlimb by maternal RA supplementation. Conclusions: Defects in IPCD and digit separation in Hoxa13 mutant mice may be caused in part by reduced levels of RA signaling stemming from a loss in the direct regulation of Aldh1a2. These findings provide new insights into the transcriptional regulation of RA signaling necessary for limb morphogenesis. Developmental Dynamics 242:687–698, 2013


Рисунки к статье

Формирование аутопода нуждается в интеграции сигнальных факторов, таких как bone morphogenetic proteins (BMPs), fibroblast growth factors (FGFs), hedgehog и ретиноевая кислота (RA), чтобы облегчить рост конечностей, формирование скелетных элементов и разделение пальцев (Zuzarte-Luis and Hurle, 2002; Zhao et al., 2010; Rosello-Diez et al., 2011; Probst et al., 2011). Координация этих сигналов контролируется частично Group 13 HOX транскрипционных факторов, включая HOXA13 и HOXD13, чьих генов мишеней продукты регулируют формирование пальцев, суставов фаланг и carpal/tarsal элементов (Fromental-Ramain et al., 1996; Stadler et al., 2001; Knosp et al., 2004, 2007; Kuss et al., 2009; Perez et al., 2010; Villavicencio-Lorini et al., 2010).
Разделение пальцев, процесс осуществляемый за счёт interdigital programmed cell death (IPCD), также регулируется с помощью HOXA13, поскольку мыши, лишенные HOXA13, обнаруживают пониженные уровни IPCD, а также тяжелую синдактилию (Stadler et al., 2001; Knosp et al., 2004; Perez et al., 2010). Наши исследования механизмов, лежащих в основе синдактилии палаьцев в мутантных Hoxa13 конечностях показали, что HOXA13 способствует IPCD , регулируя непосредственно Bmp2 и Bmp7 в межпальцевой ткани (Knosp et al., 2004). Интересно, что хотя добавление BMP2 или BMP7 увеличивает IPCD в мутантных аутоподах, но эти воздействия не могли полностью восстанавливать апоптоз до уровней у их контрольных сибсов, указывая, что могут быть необходимы дополнительные мишени для HOXA13 для разделения пальцев (Knosp et al., 2004).
Недавно несколько исследований подтвердили, что fibroblast growth factor 8 (FGF8) и передача сигналов RA играют важные роли в регуляции IPCD и роста конечностей. Для IPCD, подавление FGF8 в лежащей поверх эктодерме, по-видимому, является существенным сигналом для подлежащей мезенхимы, чтобы подвергнуться запрограммированной клеточной гибели (Hernandez-Martinez et al., 2009). Будучи инициированной, IPCD поддерживается с помощью RA, поскольку дефицит рецепторов ретиноевой кислоты или метаболических энзимов, необходимых для превращения витамина A в RA сильно воздействует на IPCD, разделение пальцев и рост передних конечностей (Zhao et al., 1996; Cash et al., 1997; Dupe et al., 1999; Niederreither et al., 2002; Zuzarte-Luis and Hurle, 2002; Zhao et al., 2010). В развивающихся эмбрионах HOX белки, по-видимому, являются одним из координирующих факторов, необходимых для передачи сигналов RA. В самом деле, исследования Vitobello et al. (2011) продемонстрировали, что ALDH1A2 (RALDH2), ключевой энзим, необходимый для превращения retinaldehyde в RA, регулируется с помощью HOXA1, чтобы облегчить сегментацию раннего заднего мозга. ALDH1A2 также является основным энзимом, превращающим retinaldehyde в конечностях, где он продуцирует RA, необходимую роста передних конечностей и IPCD в задних конечностях (Cash et al., 1997; Dupe et al., 1999; Niederreither et al., 2002; Kuss et al., 2009; Hernandez-Martinez et al., 2009; Zhao et al., 2010).
Открытие, что Aldh1a2 может регулироваться с помощью HOX белков во время эмбриогенеза, также как и его важная роль в IPCD, позволило на предположить, что синдактилия, наблюдаемая у людей и мышей, лишенных функции HOXA13, может быть вызвана потерей экспрессии Aldh1a2 в межпальцевой ткани, вызывая недостаточные уровни передачи сигналов RA, необходимые для IPCD (Stern et al., 1970; Poznanski et al., 1975; Innis, 1993; Fromental-Ramain et al., 1996; Mortlock and Innis, 1997; Stadler et al., 2001; Perez et al., 2010). Проверка данной гипотезы в данном исследовании подтвердила, что экспрессия Aldh1a2 и передача сигналов RA задержаны и в конечном итоге редуцированы в конечностях гомозиготных мутантов Hoxa13. Более того, мы идентифицировали непосредственное связывание цис-регуляторного элемента в локусе Aldh1a2 с помощью HOXA13 в мезенхиме конечностей и что HOXA13 может использовать этот цис-регуляторный элемент для прямой экспрессии гена in vitro. Наконец, добавление суб-тератогенных доз RA было успешным в улучшении передачи сигналов RA и IPCD в мутантных Hoxa13 конечностях, подтверждая, что пониженные уровни экспрессии Aldh1a2 и передачи сигналов RA вносят вклад в потерю IPCD, наблюдаемую у гомозиготных Hoxa13 мутантов. Итак, эти результаты предоставили новую информацию об иерархии генов, регулируемых с помощью HOXA13 в дистальных частях конечностей, а также о транскрипционных компонентах, необходимых для IPCD и разделения пальцев.

DISCUSSION


Общей функцией HOX белков является их способность точно контролировать формирование ткани путем регуляции множественных ступеней генетического каскада развития (Weatherbee et al., 1998; Hittinger et al., 2005; Walsh and Carroll, 2007). Механистически HOX белки осуществляют этот уровень регуляции за счет связывания уникальной последовательности ДНК, присутствующей в цис-регуляторных элементах генов мишеней. В случае HOXA13, анализ потери функции показал ключевую роль в регуляции адгезии мезенхимных клеток, хондрогенеза, формирования скелетных элементов и IPCD, подтвердив способность регулировать множественные ступени внутри индивидуальных онтогенетических каскадов (Fromental-Ramain et al., 1996; Stadler et al., 2001; Knosp et al., 2004, 2007; Perez et al., 2010). В своей регуляции IPCD, HOXA13, по-видимому, действует как канонический HOX белок, регулируя экспрессию BMPs и RA, чтобы облегчить удаление межпальцевой ткани (Francis et al., 1994; Cash et al., 1997; Merino et al., 1999; Knosp et al., 2004, 2007; Hernandez-Martinez et al., 2009).

HOXA13 is Required for the Maintenance of IPCD but not its Initiation


Предыдущие исследования показали, что передача сигналов FGF-, BMP- и RA играют доминирующую роль в IPCD генетическом каскаде (Francis et al., 1994; Dupe et al., 1999; Merino et al., 1999; Guha et al., 2002; Niederreither et al., 2002; Hernandez-Martinez et al., 2009). Ключом к инициации IPCD является подавление FGF8 (Hernandez-Martinez et al., 2009). Здесь HOXA13, по-видимому, не играет непосредственной роли, поскольку домены экспрессии HOXA13 и Fgf8 expression разделены в развивающемся аутоподе (Stadler et al., 2001). Более того, поскольку экспрессия и подавление Fgf8 протекают нормально в конечностях Hoxa13 мутантов, то мало вероятно, что HOXA13 косвенно регулирует экспрессию Fgf8.
Поскольку инициация IPCD протекает нормально в мутантных Hoxa13 конечностях, снижение IPCD обнаруживается после созревания конечностей, указывая тем самым, что поддержание ICPD нуждается в функции HOXA13. В этой роли HOXA13, по-видимому, координирует экспрессию некоторых генов, чьи продукты необходимы для прогрессии IPCD, включая Aldh1a2, Bmp2 и Bmp7 (Dupe et al., 1999; Merino et al., 1999; Stadler et al., 2001; Niederreither et al., 2002; Guha et al., 2002; Knosp et al., 2004). Добавление Aldh1a2 в качестве мишени для HOXA13 в межпальцевые ткани также подтверждает механизм, объясняющий, почему добавление BMP в мутантные Hoxa13 конечности лишь частично восстанавливает потерю IPCD, т.к. RA, продуцируемая с помощью ALDH1A2, необходима для индукции экспрессии Caspase 3, главного эффектора IPCD (Kuida, 1997; Woo et al., 1998; Ali-Khan and Hales, 2003; Knosp et al., 2004).

Impact of Aldh1a2 and Cyp26B1 Expression on RA Signaling in the Hoxa13 Mutant Autopod


Отсутствие экспрессии Aldh1a2 у мутантов на ст. E11.5 в домене аутопода подтверждает, что IPCD может быть затронут пониженными уровнями передачи сигналов RA. Проверка этой гипотезы выявила неожиданный результат, поскольку не было выявлено передачи сигналов RA в домене аутопода на ст. E11.5 ни у дикого типа, ни у гомозиготных мутантов, используя RARE-LACZ репортера. Это отсутствие передачи сигналов указывает, что небольшая передача сигналов RA происходит в дистальной части аутопода на ст. E11.5 и может быть объяснена соотв. пиком экспрессии Cyp26B1 в этом самом регионе. Здесь CYP26B1 метаболизирует RA в менее активную форму, такую как 5, 8-epoxy RA, 4-hydroxy RA и 18-hydroxy RA, которые модулируют передачу сигналов RA, чтобы облегчить эмбриогенез (White et al., 1996; Fujii et al., 1997; Sakai et al., 2001). Однако по мере созревания конечности экспрессия Cyp26B1 снижается в межпальцевых тканях вследствие активной передачи сигналов RA, а IPCD представляет собой механизм временно регулирующий разделение пальцев. При этом изменения в экспрессии Aldh1a2 в мутантных межпальцевых тканях д. затрагивать передачу сигналов RA и IPCD, это подтверждается снижением уровней активности RARE-LACZ репортера в мутантных конечностях с E12.5 по E14.5, а также снижением IPCD в мутантных конечностях, и отсутствием реакции на добавление RA.

Role of RA Supplementation, Hoxd13, and Hoxa13 in IPCD and Limb Development


Экспрессия Aldh1a2 и передача сигналов RA снижены в мутантных гомозиготных Hoxa13 конечностях. Поскольку RA необходима для экспрессии ткань ремоделирующих генов Hmgn1 и Fgf18 в палец-межпальцевые промежутки регионах, чтобы облегчить разделение пальцев, то очевидно, скорее всего, что снижение продукции RA д. вносить вклад, частично, в исчезновение IPCD, наблюдаемое в мутантных конечностях (this work; Zhao et al., 2010). Становится ясным, что низкие дозы RA частично устраняют потерю IPCD, вызываемую потерей функции HOXA13. Однако мало вероятно, что добавление материнской RA д. разрабатываться в качестве терапевтического подхода для восстановления нормальной IPCD в мутантных конечностях, поскольку тератогенные эффекты, вызываемые высокими дозами RA, будут возникать эпистатически к эффектам RA на IPCD. Более того, поскольку Bmp2 и Bmp7 также регулируются с помощью HOXA13 в межпальцевых тканях, то возможно, что эти ткани будут менее способны отвечать на RA как на дополнительный про-апоптический сигнал (Knosp et al., 2004).
HOXD13 также, по-видимому, регулирует Aldh1a2 в развивающихся конечностях. Однако его функция в конечностях отличается от HOXA13. Здесь HOXD13, как полагают, регулирует Aldh1a2, чтобы облегчить передачу сигналов RA, необходимую для модуляции формирования хряща и кости (Kuss et al., 2009). В присутствии аллеля Spd из Hoxd13, экспрессия Aldh1a2 существенно снижается, приводя к формированию добавочных пальцев и эктопический конденсатов хрящей и костей (Kuss et al., 2009). Что интересно касательно совместной регуляции Aldh1a2 с помощью HOXA- и HOXD13 так это то, что RA, необходимая для супрессии эктопического роста костей у Spd мутантов, 5 g/g, д. вызывать тяжелые уродства в мутантных Hoxa13 конечностях. Этот результат подтверждает, что уровни RA, продуцируемые в Spd (Hoxd13) мутантных конечностях могут быть ниже, чем те, что присутствуют в мутантных Hoxa13 конечностях, это д. позволить применение более высоких доз, принимая во внимание Spd мутацию перед вызыванием тератогенного эффекта. Spd конечности отвечают на 5 g/g дозы появлением меньших в размерах, указывающее на общее ингибирование роста аутопода, которое может быть результатом этой дозы RA. Альтернативно функция ткани конечности, затрагиваемой потерей HOXA13, может быть более чувствительной к флюктуациям в передаче сигналов RA, чем в типах клеток, испытывающих влияние мутации Spd, это д. приводить к более существенным тератологическим эффектам, вызываемых с помощью RA в мутантных Hoxa13 конечностях. Наконец, регуляция Aldh1a2 с помощью HOXA13 также может выполнять более глобальную роль, поскольку функциональный HOXA13 необходим для своего собственного подавления, а RA, как известно, супрессирует экспрессию Hoxa13 (Knosp et al., 2004; Shou et al., 2005).
Итак, эти исследования идентифицировали Aldh1a2 в качестве новой мишени для HOXA13 в развивающемся аутоподе. В отсутствие функции HOXA13 экспрессия Aldh1a2 снижается, вызывая последующее снижение активной передачи сигналов RA в межпальцевых тканях. Добавление с пищей RA успешно преодолевает потерю экспрессии Aldh1a2, приводя к усилению передачи сигналов RA и IPCD в HOXA13 мутантных задних конечностях, подтверждая, что HOXA13's регуляция Aldh1a2 играет существенную роль в обеспечении IPCD в задних конечностях. Ранее мы идентифицировали Bmp2 и Bmp7 в качестве проапоптических факторов, регулируемых с помощью HOXA13 в межпальцевой мезенхиме (Knosp et al., 2004). Эти результаты в согласии с данным исследованием, подтверждают, что HOXA13 функционирует в межпальцевых тканях, чтобы регулировать множественные факторы, необходимые для IPCD и разделения пальцев. Более того, эти результаты подтвердили, что многоступенчатая регуляция аппендикулярных онтогенетических каскадов может быть канонической функцией для HOX белков, законсервированной как у беспозвоночных, так и позвоночных.