Механизм, участвующий в индукции и формировании паттерна происходящей из нервного гребня (NC) Hox-позитивной мезенхимы в фарингеальных дугах, представляет огромный интерес (Creuzet et al., 2005). Мезенхима 2nd фарингеальной дуги дает некоторые скелетные элементы, включая retroarticular отросток, columella, posterior basihyoid и ceratobranchial элементы скелета языка (Ruhin et al., 2003; Kulesa et al., 2004). NC мигрирует из области среднего мозга кур на ст. Hamburger and Hamilton stage (HH) 9 (Hamburger and Hamilton, 1951) в виде волны спереди кзади, при этом гиоидный (hyoid) поток начинает свою миграцию от ромбомера 4 (r4) приблизительно на ст. HH11 (Couly et al., 1992). Имеются небольшие вклады r3 и r5, которые не подвергаются апоптозу, добавляются к передней и задней части гиоидного потока, соотв. (Kulesa and Fraser, 2000; Graham et al., 2004; Kulesa et al., 2004). Миграция краниального NC завершается на ст. HH14 при этом проксимальная и дистальная популяции формируют от медиальных до более латеральных элементов подъязычной кости (Kontges and Lumsden, 1996).

У птиц развитие хряща из гиоидного NC зависит от сигналов, которые возникают в фарингеальной энтодерме (Ruhin et al., 2003; Creuzet et al., 2004). Удаление передней и всё более задней полосок медиальной или латеральной энтодермы передней кишки на премиграторных стадиях демонстрирует, что фарингеальная энтодерма необходима для формирования паттерна специфических скелетных элементов. На уровне 2-й дуги, производные NC включают элементы, такие как basihyoid и ceratobranchial (Ruhin et al., 2003). Превращение мезенхимы в хрящевые конденсаты неизбежно влечет за собой то, что эпителиально-мезенхимные взаимодействия выполняют несколько функций. Мигрирующая скелетогенная мезенхима сначала локализуется за счет локальных эпителиально-мезенхимных взаимодействий, влияющих на размер популяции предшественников для каждого краниального скелетного элемента, обеспечивающих сигналы инициальной конденсации и тем самым делающим возможной дифференцировку хондроцитов и, наконец, оссификацию (Hall, 2008). Предыдущие исследования рассматривали присутствие или отсутствие хрящевых элементов, но не исследовали промежуточные ступени для определения, имеет ли место недостаточность (Creuzet et al., 2005). Локализация, спецификация прехондральных качественных особенностей мезенхимы или хондрогенные программы могут быть нарушены.

Columella возникает из NC мезенхимы, которая мигрирует в проксимальную часть 2-й дуги, примыкая к фарингеальной энтодерме (Kontges and Lumsden, 1996). Единственная косточка среднего уха цыплят, columella, является составной структурой, состоящей из сохранившихся и замещенных хрящевых элементов. Проксимальная косточка columella вставляется в овальное окошечко канала слуховой улитки, а более дистальный extracolumella хрящ вставляется в барабанную перепонку, занимая по ширине полость среднего уха (Jaskoll and Maderson, 1978; Wood et al., 2010). Эффект сигналов, от лежащей в основе фарингеальной энтодермы , на проксимально расположенную мезенхиму columella не был проанализирован в более ранних исследованиях (B. Ruhin and N. le Douarin, personal communication). Мы попытались установить, предоставляет ли фарингеальная энтодерма достаточные и необходимые сигналы для спецификации предполагаемой мезенхимы columella, это делает энтодерму идеальной тканью для исследования временного промежутка между миграцией и хондрогенезом.

Мы полагаем, что сигналы, необходимые для спецификации прехондрогенных качественных особенностей и начала действия хондрогенной программы в этой мезенхимной популяции, располагаются в подлежащей фарингеальной энтодерме. Чтобы проверить это выделяли ткани из области среднего уха и растили в культуре коллагеновго геля. Sox9, член high mobility group (HMG) domain содержащих транскрипционных факторов, участвует в спецификации NC, при этом экспрессия Sox9 в мезенхиме является маркером прехондральных качественных особенностей (Cheung and Briscoe, 2003; Wood et al., 2010). Начало экспрессии Col2a1 указывает на инициацию хондрогенной программы на эмбриональный день (E) 7.5 у кур (Zhao et al., 1997; Eames et al., 2004; Betancur et al., 2010). Благодаря нашим экспериментам по рекомбинации тканей, мы показали, фарингеальная энтодерма, соседствующая с мезенхимой после миграции, дает предполагаемую columella конденсацию, это достаточно, но не нуждается в индукции экспрессии Sox9 и, , следовательно, для возникновения прехондрогенных качественных особенностей.

Энтодермальные сигналы, возникающие в каудальной части передней кишки, влияют на Hox-позитивную мезенхиму в 2-й и более задних дугах, включая прехондрогенную особенность (Ruhin et al., 2003). Передача реципрокных сигналов между Fgf8-экспрессирущей энтодермой и клетками NC в лицевой области необходима для образования конденсатов (Creuzet et al., 2004). Многочисленные fibroblast growth factor (FGF) гены с пространственно ограниченной экспрессией присутствуют в этой области (Ohyama et al., 2007; Schimmang, 2007), потенциально обеспечивая эти эпителиально-мезенхимные взаимодействия (Shigetani et al., 2000). Поэтому мы рассмотрели известных членов семейства FGF, чтобы выявить Fgf гены, экспрессирующиеся в фарингеальной энтодерме. Эмбрионы анализировались на миграторной и постмиграторной NC стадиях HH14 и HH18/19, когда впервые обнаруживается мезенхимная экспрессия Sox9.

Многоступенчатое общение необходимо между энтодермой и происходящей из NC мезенхимой, привоядщее к формированию хряща(Creuzet et al., 2005). Наше функциональное исследование демонстрирует, что передача сигналов FGF достаточна и необходима для индукции прехондрогенных качественных особенностей, но не может поддерживать экспрессию Sox9, чтобы инициировать хондрогенную программу. Экспрессия маркера хондроцитов Col2a1 однако выявляется в присутствии фарингеальной энтодермы, указывая на нужду во втором сигнале. Передача сигналов только BMP4 способна индуцировать и поддерживать экспрессию Sox9, но комбинация BMP с передачей сигналов FGF необходима для индукции хондрогенной программы. Мы показали, что BMP4 в комбинации с FGF8 достаточен, чтобы инициировать хондрогенную программу и подтверждает, что это может быть генеральным механизмом формирования паттерна внутри более задних фарингеальных дуг, которые экспрессируют комбинации этих секретируемых сигнальных молекул.

DISCUSSION

A Refined Model of Cartilage Formation in the Neural Crest-Derived Mesenchyme

Мы представили модель, в которой фарингеальная энтодерма достаточна, но не необходима, чтобы специфицировать прехондрогенные качественные особенности и инициировать хондрогенную программу в скелетогенной мезенхиме у эмбрионов, начиная со ст. HH14, это демонстрируется присутствием транскриптов Sox9 и Col2a1 сотв. Спецификация прехондрогенных характеристик и инициация автономной хондрогенной программы завершается на ст. HH19 в присутствии сигналов от фарингеальной энтодермыю Мезенхима, изолированная на ст. HH19 и HH24 экспрессирует Sox9 и Col2a1 во время долговременного культивирования.

Более того, наши исследования избыточной и недостаточной функции с использованием HH14 эксплантов из изолированной мезенхимы демонстрируют, что передача сигналов FGF как достаточна, так и необходима для индукции Sox9, но не может поддерживать его экспрессию в течение длительного времени. BMP4 рекомбинантный белок может, однако, как индуцировать, так и поддерживать экспрессию Sox9, хотя сам по себе это слабый инициатор хондрогенной программы. Совместная передача сигналов FGF и BMP необходима для неприкрытой дифференцировки и экспрессии хондрогенного маркера Col2a1.

Итак, мезенхима обладает общим основным паттерном (Minoux et al., 2009), со множественными FGF и BMP сигнальными молекулами, ограниченными во времени и пространстве фарингеальной энтодермой во всех дугах (Creuzet, 2004), это, скорее всего, общий механизм формирования паттерна, хотя это еще необходимо проверить.

Pharyngeal Endoderm Is Sufficient to Induce and Maintain Sox9 Expression, But not Required

Устранение фарингеальной энтодермы оставляет все остальные ткани в регионе интактными, обнаруживающими экспрессию Sox9. Как демонстрируется нашими рекомбинационными экспериментами, сигналы от отического эпителия действуют как индуктор Sox9 в мезенхиме, происходящей из NC. Сходным образом, поверхностная эктодерма, экспрессирующая Fgf8 в нервной трубке, хорде и 2-й дуге, может действовать как как индуктор, но эндотелиальные сосуды, такие как дорсальная аорта, не могут. Хотя др. ткани достаточны, но принимая во внимание расстояние от предполагаемой columella in vivo, вряд ли эта фарингеальная энтодерма действует в качестве эндогенного индуктора.

Чтобы осуществить хондрификацию премиграторные клетки из краниального NC млекопитающих д. взаимодействовать с краниальной эктодермой по типу индуктор/отвечающий элемент. У кур сигналы от поверхностной эктодермы лица необходимы для формирования паттерна клюва на поздних стадиях, но не др. скелетных элементов (Helms and Schneider, 2003; Schneider and Helms, 2003). У низших позвоночных, таких как амфибии, премиграторный NC взаимодействует с бранхиальной эктодермой (Hall, 2008). Наши результаты демонстрируют, что у кур дорсолатеральная поверхностная эктодерма, не экспрессирующая FGF, неспособна специфицировать прехондрогенные характеристики. Однако Fgf8-экспрессирующая поверхностная эктодерма на уровне фарингеальных желобков достаточна в этом отношении. Мы отметили, что экспрессия Fgf8 в этой ткани кратковременна, появляется и затем исчезает между HH8 и HH15. Т.о., эктодермальная экспрессия может привлекать или проталкивать (prime) клетки NC когда они мигрируют в заднюю часть желобка, чтобы достичь дистальной порции каждого кармана.

FGF Signaling Is Sufficient and Required to Induce, But Cannot Maintain, Sox9 Expression

Специфицируемые клетки, которые следуют по скелетогенному пути нуждаются в воздействии передачи сигналов FGF, при этом передача сигналов FGF8 становится мощным индуктором прехондрогенных характеристик (Ruhin et al., 2003; Creuzet et al., 2004; Minoux et al., 2009). Роль FGF8 в спецификации скелетогенной мезенхимы не обсуждается, но мы установили, что FGF8 неспособен поддерживать экспрессию Sox9 в изолированной мезенхиме.

Имеются др. Fgf гены в этом регионе, так FGF8 является известным регулятором экспрессии Fgf19 (Ladher et al., 2005; Gimeno and Martinez, 2007). В наших эксплантах эффект FGF19 на мезенхимные клетки, по-видимому, менее сильный, чем FGF8, с меньшим количеством клеток, экспрессирующих Sox9. Хотя мы не оценивали это количественно можно предположить, что эндогенная роль FGF19 может заключаться в спецификации или формировании паттерна только субнабора мезенхимных клеток. Учитывая близость клеток columella к фарингеальной энтодерме мезенхима columella может специфически нуждаться в FGF19, хотя это необходимо проверить. Fgf19 экспрессия обнаруживается только в дистальной части 2-й и 4-й дуг, что вызывает доверие к этой идее. Более слабая, ограниченная в пространстве и во времени экспрессия Fgf3 и Fgf4 в энтодерме 2-й дуги также должна быть предметом будущих исследований. Экспрессия fgf3 в энтодерме рыбок данио необходима для образования дуг 1-4 (David et al., 2002). Интересно, что эти авт. также предположили, что необходимы сигналы, дополнительные к FGFs в энтодерме для формирования паттерна скелетных элементов, возникающих из дуг.

Pharyngeal Endoderm Is Required for Induction of the Chondrogenic Program

Экспланты от HH14 эмбрионов, культивируемые с фарингеальной энтодермой, способны экспрессировать Col2a1 на ст. E8. Как только специфицируется популяция мезенхимы, на ст. HH19, хондрогенез может осуществляться даже в отсутствие фарингеальной энтодермы. Т.о., фарингеальная энтодерма не только достаточна, чтобы специфицировать прехондрогенные характеристики, но и должна быть источником множественных сигнальных молекул, действующих, чтобы инициировать хондрогенез (Creuzet et al., 2005). Мы показали, что BMP4 достаточен в этом отношении.

Передача сигналов BMP играет роль в осуществлении компакции прехондрогенных клеток, приводя к образованию зачатка хряща (прехондрогенная конденсация) и безусловно является кандидатом на роль дополнительного сигнала. BMP4 экспрессируется в виде определенного пространственно-временного паттерна (Wood et al., 2010). Потеря передачи сигналов BMP ведет к неспособности образования конденсатов и неспособности дифференцироваться в хондроциты, даже в конденсированных клетках (Duprez et al., 1996; Yoon et al., 2005; Bandyopadhyay et al., 2006; Barna and Niswander, 2007; Karamboulas et al., 2010). Более того, BMP4 известен как индуктор Sox9, а наши результаты подтверждают эту находку, демонстрируя, что BMP4 также поддерживает экспрессию Sox9 в течение длительного времени. BMP4 может также действовать как прямой активатор транскрипции Col2a1 (Semba et al., 2000). В наших мезенхимных эксплантах, передача сигналов в отдельности FGF8 или BMP4 способна индуцировать, но только передача сигналов BMP4 может поддерживать экспрессию Sox9. Ни один из сигналов в отдельности не ведет к экспрессии Col2a1, только когда передача сигналов FGF и BMP скомбинирована транскрипты Col2a1 обнаруживаются на ст. E8.

Reconciling Models of Hyoid Skeletal Formation

Представленные результаты обогащают наше понимание тканей и механизма передачи сигналов, необходимых для индукции и формирования паттерна мезенхимы. происходящей из NC. Происходящие из NC клетки фарингеальных дуг, по-видимому, обладают общим основным паттерном (Minoux et al., 2009), при этом более ранние трансплантационные эксперименты продемонстрировали достаточность и необходимость фарингеальной энтодермы в передаче региональных характеристик (Ruhin et al., 2003; Creuzet et al., 2004). Подтверждением этому является удаление соседней фарингеальной энтодермы in ovo , приводящей к потере basihyoid и ceratobranchial скелетных элементов (Ruhin et al., 2003). Однако механизм, приводящий к неспособности не оценивали в данном исследовании. Имеется несколько возможных стадий, на которые скелетные элементы могут быть повреждены: миграция NC, спецификация прехондрогенных характеристик, формирование конденсатов или хондрогенез.

Передача сигналов FGF является привлекательной для мигрирующих клеток NC cells (Creuzet et al., 2005). Генетическое устранение энт одермы у рыбок данио van gogh, casи bon мутантов ведет к неспособности формировать хрящи (Piotrowski and Nusslein-Volhard, 2000; David et al., 2002; Piotrowski et al., 2003). У мутантов cas и bon особенно, отсутствие образования энтодермы ведет к неспособности к образованию бранхиальных дуг. Клетки NC мигрируют, но неспособны проникать в бранхиальные дуги, вместо этого скапливаются на поверхности желтка в виде неорганизованных масс, теряют маркеры прехондрогенной мезенхимы. Мы подтвердили, что сходный механизм действует у кур, у которых удаление энтодермы на уровне 2-й дуги во время премиграторной стадии (Ruhin et al., 2003; Creuzet et al., 2004), ведет к неспособности NC располагаться правильно и/или специфицироваться в прехондрогенные клетки (David et al., 2002). Добавление источника FGF8 на место устраненной энтодермы устраняет этот фенотип благодаря привлечению мигрирующих клеток и спецификации прехондрогенных характеристик. Более того, наши результаты показали, что передача сигналов FGF от др. тканей индукторов в этот регион может индуцировать прехондрогенные характеристики, но не может локализовать NC в правильной позиции. Т.о., наши результаты показывают, что фарингеальная энтодерма достаточна, но не необходима для становления прехондрогенных характеристик.

Благодаря экспериментальным подходам, использованным в более ранних исследованиях, это предназначение энтодермы не было замечено. Неспособность клеток NC мигрировать в правильное положение и тем самым индуцировать и поддерживать прехондрогенные характеристики объясняла потерю специфических скелетных элементов. Т.о., наш экспериментальный подход более подходящий благодаря использованию клеток NC, которые являются постмиграторными, и избегли осложнений с локализацией. Очевидно, что передача сигналов FGF, возникающих из фарингеальной энтодермы необходима для локализации мигрирующих клеток NC. Передача сигналов FGF и BMP может индуцировать прехондральные характеристики, хотя только BMP может поддерживать это состояние. В наших долговременных культурах ни FGF, ни BMP сигналы в отдельности были недостаточны, чтобы индуцировать хондрогенную программу. Только когда оба сигнальных фактора комбинировали, происходила индукция хондрогенной программы, что определялось по экспрессии Col2a1.