Посещений:
ПЕРВИЧНАЯ ПОЛОСКА
Механизмы образования и функции
|
Mouse primitive streak forms in situ by initiation of epithelial to mesenchymal transition without migration of a cell population Margot Williams, Carol Burdsal, Ammasi Periasamy, Mark Lewandoski, Ann Sutherland Developmental Dynamics
Volume 241, Issue 2, pages 270–283, February 2012 |
Background: During gastrulation, an embryo acquires the three primordial germ layers that will give rise to all of the tissues in the body. In amniote embryos, this process occurs via an epithelial to mesenchymal transition (EMT) of epiblast cells at the primitive streak. Although the primitive streak is vital to development, many aspects of how it forms and functions remain poorly understood. Results: Using live, 4 dimensional imaging and immunohistochemistry, we have shown that the posterior epiblast of the pre-streak murine embryo does not display convergence and extension behavior or large scale migration or rearrangement of a cell population. Instead, the primitive streak develops in situ and elongates by progressive initiation EMT in the posterior epiblast. Loss of basal lamina (BL) is the first step of this EMT, and is strictly correlated with ingression of nascent mesoderm. Once the BL is lost in a given region, cells leave the epiblast by apical constriction in order to enter the primitive streak. Conclusions: This is the first description of dynamic cell behavior during primitive streak formation in the mouse embryo, and reveals mechanisms that are quite distinct from those observed in other amniote model systems. Unlike chick and rabbit, the murine primitive streak arises in situ by progressive initiation of EMT beginning in the posterior epiblast, without large-scale movement or convergence and extension of epiblast cells. Developmental Dynamics 241:270–283, 2012. © 2011 Wiley Periodicals, Inc.
Рисунки к статье
|
Первичная полоска является критической для образования трех зародышевых слоёв-энтодермы, мезодермы и эктодермы-у большинства эмбрионов амниот. Это осуществляется в результате локализованного в пространстве и времени эпителиально-мезенхимного перехода (EMT), который продуцирует мезодерму и дефинитивную энтодерму из слоя клеток эпителиального эпибласта. Эксперименты на эмбрионах кур предоставили некоторую информацию о морфогенетических клеточных перемещениях, которые вносят вклад в формирование первичной полоски кур. Перед образованием полоски клетки эпибласта птиц инициируют , крупномасштабные ротационные движения, наз. движениями полонеза (Graeper, 1929), которые приводят клетки предшественники полоски в позицию на заднем конце эмбриона (Lawson and Schoenwolf, 2001a), что зависит от передачи сигналов fibroblast growth factor (FGF) (Chuai et al., 2006). Картирование судеб показало, что эта популяция предшественников располагается в области, напоминающей по форме серп в задней части эпибласта, лежащей поверх серпа Koller's (Lawson and Schoenwolf, 2001a), которая перестраивается в треугольной формы зарождающуюся полоску. Зарождающаяся полоска затем удлиняется в результате интеркаляции клеток эпибласта (Lawson and Schoenwolf, 2001a,b), это, как было установлено, в некоторых работах находится под контролем передачи сигналов планарной клеточной полярности (PCP) (Voiculescu et al., 2007), тогда как в др. работах было установлено, что это не зависит от данного пути (Chuai et al., 2006). Клетки задней части эпибласта конвергируют по задней части срединной линии, расширяя клетки полоски кпереди, чтобы сформировать зрелую, палочковидную первичную полоску.
Образование мезодермы происходит в результате EMT из клеток эпибласта в первичной полоске. Этот EMT характеризуется локальной потерей базального листка (BL) между эпибластом и подлежащим гипобластом и путем вторжения и приобретения миграторного поведения возникающими в результате мезодермальными клетками. Потеря BL чётко скоррелирована с вторжением мезодермы и, как полагают, инициирует др. события EMT (Nakaya et al., 2008). Активность RhoA, как было установлено, регулирует целостность BL и тем самым EMT, но множество др. клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе EMT первичной полоски у эмбрионов кур, неизвестно. ЭМ показала, что клетки эпибласта приобретают бутылко-образную форму внутри полоски (Nakaya and Sheng, 2009), строго указывая на апикальные сужения в качестве метода вторжения. Последующая миграция мезодермы прочь из полоски исследована более подробно (Yang et al., 2002; Hardy et al., 2008; Sweetman et al., 2008; Yang et al., 2008; Yue et al., 2008); однако промежуточные ступени между конденсацией полоски и миграцией мезодермы изучены недостаточно.
Ещё менее известно об образовании первичной полоски у эмбрионов млекопитающих. Помимо трудностей культивирования и выявления постимплантационых стадий, форма эмбриона отличается у разных видов, делая затруднительными обобщения. Кстати, наиболее изученной моделью в терминах клеточных механизмов образования полоски является кролик, у которого эмбриональная область представлена в форме плоского бластодиска, как и у кур. В то же самое время эмбрионы мыши оказались лучше всего изученной моделью в отношении генетической регуляции гаструляции и картирования судеб эпибласта (Lawson et al., 1991; Quinlan et al., 1995; Tam and Zhou, 1996; Tam et al., 1997a, b; Kinder et al., 2001). Хотя эпибласт перед образованием полоски у эмбрионов кроликов не подвергается движениям полонеза per se, наблюдение вживую выявляет стереотипичные движения клеток, наз. "L turns" и "U turns" , которые могут быть эквивалентом у млекопитающих подобного поведения клеток птиц (Halacheva et al., 2011). Исследования по отслеживанию краски подтверждают, что клетки эпибласта кроликов подвергаются движениям конвергенции и вытягивания во время образования первичной полоски (Viebahn et al., 2002), которые, как было установлено, являются результатом интеркаляции клеток малого масштаба, наз. "processional" движениями (Halacheva et al., 2011). ЭМ выявила апикально суженые клетки в первичной полоске как мышей, так и кроликов (Tam et al., 1993; Viebahn et al., 1995), подобные таковым у кур, но мало было сделано наблюдений относительно клеточной динамики в первичной полоске млекопитающих. И хотя исследования трансгенных мышей привели к идентификации сигнальных путей, жизненно важных для образования первичной полоски, таких как Wnt3, Nodal и BMP4 (Winnier et al., 1995; Conlon, 1994; Liu et al., 1999; Brennan et al., 2001), нижестоящие клеточные биологические процессы, с помощью которых эти пути вызывают первичную полоску, почти полностью неизвестны. В отсутствие доказательств, известных для первичной полоски кур и кроликов, существует тенденция экстраполяции на эмбрионы мыши. Но поскольку детальные изображения отслеживание клеток не были осуществлены в задней части эпибласта у эмбрионов мыши перед гаструляцией, то поведение клеток, которое предшествует и вносит вклад в образование первичной полоски мышей, не установлено. Из-за существенных различий в геометрии эмбрионов кур, кроликов и мышей-эмбрионы кур и кроликов развиваются в виде плоских бластодисков, а у мышей в виде яйцевого цилиндра-было бы неразумно подозревать, что морфогенез первичной полоски осуществляется по разному в этих системах.
Наши доказательства показывают, что первичная полоска мышей формируется фактически с помощью механизмов, отличающихся от таковых у птиц и кроликов. Используя наблюдения вживую генетически меченных эмбрионов мыши перед, во время и после образования первичной полоски, мы оказались способны наблюдать и отслеживать движения индивидуальных клеток в ходе развития. Мы установили, что задняя часть эпибласта не обнаруживает движений полонеза и не подвергается конвергенции и вытягиванию перед образованием первичной полоски. Кроме того, мы не нашли доказательств образования полоски из популяции предшественников, как это наблюдается у кур. Вместо этого мы установили, что первичная полоска мыши формируется in situ, без дальнодействующих клеточных движений, а удлиняются в результате прогрессивной инициации EMT, начинающегося в задней части эпибласта и распространяющегося кпереди. Этот регион характеризуется потерей BL и продукцией мезодермы в пространственной и временной прогрессивной манере. Как только теряется BL в данном регионе, клетки эпибласта начинают сужаться на своих верхушках и вступают в подлежащий слой мезодермы с помощью somal транслокации. Хотя ещё предстоит многое узнать о гаструляции у мышей, это первое детальное описание динамических морфогенетических механизмов образования первичной полоски у мышей.
DISCUSSION
Morphogenesis of the Primitive Streak
Данное исследование идентифицировало многие морфогенетические механизмы, которые вносят вклад в образование первичной полоски у эмбрионов мыши. Наши результаты подтвердили, что отсутствуют крупные перестройки клеток, которые формируют полоску из предназначенной популяции, а скорее полоска развивается in situ за счет инициации EMT в задней части эпибласта. Потеря базальной ламины определяет область этого EMT, и, следовательно, область первичной полоски. В этом смысле полоска может рассматриваться не как структура, созданная из клеток, а скорее как акведук (conduit), через который проходят клетки. Нельзя сказать, что не имеется клеток, которые бы располагались внутри полоски, поскольку существуют определенные доказательства такой популяции (Bonnerot and Nicolas, 1993; Cambray and Wilson, 2007). Но в терминах элонгации полоски, нет доказательств структуры, состоящей из клеток, которая бы проталкивалась кпереди по мере её удлинения (поскольку переднее смещение клеток не обнаруживается в месте полоски), единственной областью, которая расширяется -это отверстие в BL, которое увеличивается. Этот EMT инициируется прогрессивно сзади кпереди, включая всё более передние клетки и продуцируя мезодерму во все более передних регионах, тем самым "удлиняя" полоску в направлении дистального кончика эмбрионального цилиндра.
Если рассматривать в сравнении со значительно лучше описанными процессами образования первичной полоски у кур и кроликов, то наши результаты подчеркивают существенные различия в механизмах образования и удлинения, но существенное сходство в процессе и прогрессировании EMT. У эмбрионов кур и кроликов первичная полоска обнаруживает четкие структуры, созданные клетками, которые конденсируются и удлиняются, чтобы сформировать структуру (Lawson and Schoenwolf, 2001a, b; Viebahn et al., 1995). Это достигается посредством движений полонеза у кур (Graeper, 1929; Cui et al., 2005) и "U" и "L" поворотов у кроликов (Halacheva et al., 2011), а также конвергирующих и вытягивающих движений, которые удлиняют и распределяют предшественников полоски вдоль передне-задней оси, как только будет достигнута определенная толщина популяции (Idkowiak et al., 2004; Voiculescu et al., 2007). Напротив, мы установили, что ни одно из этих движений клеток эпибласта не происходит в первичной полоске у мышей и в самом деле не образуются морфологически определенные структуры перед началом EMT. Первичная полоска мышей формируется тогда и где происходит EMT, который продуцирует мезодерму. Этот способ, с помощью которого развивается полоска у мышей in situ и он не использует перестройку предназначенной для этого популяции "клеток полоски". Возможно, что эти различия в клеточных механизмах для становления первичной полоски между курами, кроликами и мышами связаны с геометрией эмбриона. Клетки более передних регионов эпибласта кур или кроликов, которые являются плоским бластодиском, д. значительно дальше путешествовать, чем те в аналогичных местах эпибласта мыши, который имеет форму чашеобразного цилиндра.
Движения конвергенции и вытягивания внутри эпибласта до появления полоски у кур, как было установлено, зависят от передачи сигналов PCP (Voiculescu et al., 2007), хотя др. не выявили роли передачи сигналов PCP (Chuai et al., 2006). У мышей дефекты первичной полоски не наблюдались у эмбрионов, мутантных по большинству PCP генов (Kibar et al., 2001; Curtin et al., 2003; Murdoch et al., 2003; Lu et al., 2004; Yen et al., 2009), за исключением эмбрионов, лишенных Wnt5a, которые имели укороченную первичную полоску на ст. E7.75 (Yamaguchi et al., 1999). Поскольку этот специфический дефект не наблюдается вплоть до, по крайней мере, 24 ч после инициации полоски, то это указывает, что Wnt5a не играет роли в формировании или инициации удлинения полоски к дистальному кончику эмбриона (которые завершаются приблизительно на ст. E6.75; Fig. 2), но скорее играет роль в последующей фазе роста полоски, которая связана с удлинением эмбриона в целом. Эти результаты согласуются с нашим наблюдением, что эпибласт мыши не подвергается конвергенции и вытягиванию перед образованием первичной полоски.
EMT at the Primitive Streak
EMT, который происходит в первичной полоске, имеет несколько ступеней, которые завершаются последовательно и ассоциированы с серией поведенческих изменений. Потеря базальной ламины это первая ступень этого перехода, которая предопределяет локализацию первичной полоски и наделяет клетки способностью к внедрению, хотя большинство не делает этого непосредственно. В самом деле, большинство клеток внутри полоски сохраняют свои эпителиальные соединения и полярность внутри разрыва BL, сохраняя эпителиальную целостность по всему эпибласту. Occludin и aPKC затем теряются с апикальной поверхности клеток эпибласта по мере вступления в полоску, процесс, связанный с апикальными сужениями и транслокациями этих клеток в подлежащий слой мезодермы. Оказавшись в слое мезодермы, клетки теряют свой E-cadherin, как только они мигрируют прочь от места полоски. Этого не происходит до тех пор, пока эти клетки не приобретут такого миграторного поведения и E-cadherin подавляется, это многими рассматривается как завершение EMT. Не все клетки внутри полоски проходят эти ступени в одно и то же время, гарантируя как целостность эпителия, так и постоянство потока мезодермы из полоски.
Каждая из этих ступеней EMT (потеря BL, ингрессия и миграция), по-видимому, самостоятельны и, скорее всего, находятся под контролем отдельных молекулярных механизмов. Напр., мышиные эмбрионы, мутантные по Wnt3 или Nodal (среди прочих) не обнаруживают потери BL и не инициируют образование первичной полоски совсем (Winnier et al., 1995; Conlon, 1994; Liu et al., 1999; Brennan et al., 2001). У эмбрионов мыши, мутантных по транскрипционном у фактору Snail, BL теряются и клетки проникают в полоску, но эти клетки снова эпителизируются, указывая на неспособность к EMT (Carver et al., 2001). У эмбрионов мыши, мутантных по компонентам передачи сигналов FGF, клетки внедряются в полоску и принимают мезенхимную морфологию, но неспособны мигрировать прочь из полоски, по-видимому, в результате неспособности подавлять E-cadherin (Sun et al., 1999; Ciruna and Rossant, 2001; Garcia-Garcia and Anderson, 2003). Эти примеры иллюстрируют, что потеря BL, внедрение и миграция являются самостоятельными процессами во время гаструляции у мышей, следующие ступень за ступенью, чтобы завершить EMT.
Потеря E-cadherin важна в этом разграничении между завершенным EMT и внедрением, т.к. это, по-видимому, жизненно важно для приобретения миграторного поведения, но не для ингрессии. Важно, что блокирование функции E-cadherin в эксплантах мышиных эпибластов достаточно, чтобы вызывать EMT (Burdsal et al., 1993), это вместе с выше упомянутыми примерами мутантных Snail и FGF мышей, подтверждает, что потеря E-cadherin необходима и достаточна для завершения EMT в полоске мыши. У эмбрионов кур, однако, поскольку воздействие ингибиторами FGF не предупреждает миграции мезодермы прочь от места полоски, следовательно, не влияет на экспрессию E-cadherin (Hardy et al., 2011). Некоторые исследователи установили, что избыточная экспрессия Snail у эмбрионов приводит к подавлению E-cadherin и преждевременному EMT (Acloque et al., 2011), тогда как др. установили противоположное (Hardy et al., 2011), вообще-то подтверждающее легкие отличия в роли E-cadherin в EMT во время гаструляции у мышей и кур.
Elongation of the Primitive Streak
Инициация EMT в первичной полоске осуществляется прогрессивно сзади наперед, и экспансия области EMT, которая объясняет элонгацию полоски. Инструкции для клеток в эпибласте, чтобы вступить в этот переход, также распространяются сзади наперед. Каков этот сигнал и как распространяется, неизвестно. Однако наиболее подходящие кандидаты на роль таких сигналов, идентифицированные у трансгенных мышей, включают BMP4, Wnt3, Nodal или их комбинацию (Conlon et al., 1994; Winnier et al., 1995; Liu et al., 1999; Brennan et al., 2001). Cotcnhetn несколько возможных механизмов, с помощью которых эти молекулы будут индуцировать и удлинять полоску: (1) ранние сигнальные события д. устанавливать стабильный препаттерн, детерминирующий какие клетки будут подвергаться EMT и когда; (2) популяция клеток в наиболее задней части эмбриона д. индуцировать EMT всегда только в передних регионах за счет продукции диффундирующего сигнала; или (3) популяция клеток "инициаторов" в проксимальной задней части эпибласта могут инициировать механизм прямой связи (feed-forward), тем самым каждый ряд клеток не только инициирует EMT, но и в последствии индуцирует своих передних соседей как подвергаться EMT, так и становиться компетентными к индукции новых рядов (tier) клеток. Взаимодействие между внеэмбриональной эктодермой и проксимальной задней частью эпибласта между ст. E5.5 и E6.0 необходимо для образования первичной полоски у мышей, демонстрируя присутствие инициирующего сигнала (Rodriguez et al., 2005; Georgiades and Rossant, 2006). Функция этого сигнала в регуляции элонгации полоски, однако, неизвестна. Было установлено у кур, что диффундирующий сигнал от области серпа Koller's отвечает за индукцию полоски (Khaner and Eyal-Giladi, 1986; Callebaut et al., 2003), и также, что комбинация сигналов в маргинальной зоне необходима для индукции задней части полоски (Skromne and Stern, 2001), но это не исключает возможности механизма прямой связи (feed-forward) для элонгации.
Signaling Within the Primitive Streak
Помимо качественных особенностей сигнальных путей, ответственных за индукцию полоски, всё ещё неизвестно, какие нижестоящие эффекторы этой передачи сигналов вызывают потерю BL и переход к мезенхимному фенотипу. Было установлено у эмбрионов кур, что потеря базальной ламины является первой ступенью EMT в полоске и индукция эктопической потери BL достаточна, чтобы вызвать вторжение мезодермы (Nakaya et al., 2008). Это наблюдается и у эмбрионов мыши. Эмбриоидные тела, полученные из эмбриональных стволовых клеток мышей, которые лишены Laminin ?1 цепи и поэтому неспособные формировать базальные мембраны, не эпителизируются и обнаруживают повышенные уровни экспрессии мезодермальных и EMT маркеров (Fujiwara et al., 2007). А у FLRT3 мутантных эмбрионов мыши развиваются полости в висцеральной энтодерме и в ассоциированной BL, приводя к эктопическому EMT в этих местах (Egea et al., 2008). У кур потеря BL, как было установлено, является результатом нестабильности микротрубочек, вызываемой потерей активности RhoA на базальной стороне клеток эпибласта (Nakaya et al., 2008). Регуляция активности RhoA является также важным свойством собственно EMT в первичной полоске мышей (Fuse et al., 2004). Вышестоящая передача сигналов ответственна за изменения в локализации и активности RhoA, однако, пока она не идентифицирована.
Ingression Within the Primitive Streak
Данное исследование продемонстрировало, что как только инициируется EMT в первичной полоске, то клетки вторгаются с помощью апикальных сужений и somal транслокации. Удивительно, целостность эпителиального слоя эпибласта сохраняется во время процесса ингрессии. Это не только вносит вклад в структурную целостность эмбриона, но и также, скорее всего, отвечает за пополнение клетками первичной полоски. Т.к. клетки внутри полоски сужают свои верхушки, то это заставляет соседние клетки становиться ближе к срединной линии, в результате чего происходит пассивное продвижение боковых частей эпибласта в направлении полоски (хотя мы не можем исключить возможность вклада некоторых и др. добавочных сил). Хотя клетки эпибласта конвергируют над полоской во время вторжения, общая форма эмбриона не меняется. Единственным объяснением может быть то, что постоянно увеличивающемуся количеству клеток и объему эпибласта, обусловленному большим количеством клеточных делений (Fig. 4F), противодействуют какие-то физические силы, продуцируемые в первичной полоске, которые могут вызывать искажения в массе ткани. Этот паттерн движений в эпибласте также отражает прогрессивную природу EMT в полоске. Поскольку клетки сдвигаются в направлении срединной линии, где клетки проникают в полоску, то область EMT может быть идентифицирована по поведению клеток боковой части эпибласта. В самом деле, область эпибласта, которая обнаруживает медиальное перемещение, расширяется скоординировано с удлинением полоски.
Мы получили больше информации об образовании и функции первичной полоски, однако, знание, что механизмы гаструляции варьируют между амниотами, заставит биологов развития понять, то, что верно для эмбрионов кур и кроликов, не обязательно верно для мышей.
|