Во время нормального развития индукция и морфогенез ткани нуждаются в точной регуляции сигнальных путей ростовых факторов, тогда как многие из одних и тех же путей оказываются не регулируемыми во время прогрессирования рака. В случае простаты, недавний анализ профилирования генной экспрессии показал, что эмбриональные программы генной экспрессии реактивируются в раке простаты (Schaeffer et al., 2008; Pritchard et al., 2009). Однако, относительно мало известно о критических сигнальных путях, которые регулируют или нормальное развитие млм канцерогенез простаты.

Органогенез предстательной железы зависит от андрогенов и использует реципрокные сигнальные события, происходящие между эпителием урогенитального синуса и окружающей мезенхимой. Эти тканевые взаимодействия ведут к инициальному появлению зачатка простаты из рострального конца урогенитального синуса, который появляется на 17.5 days postcoitum (dpc) у мышей (Cunha et al., 1987). Затем простатический эпителиальный зачаток подвергается экстенсивному разрастанию протоков и ветвлению в окружающую мезенхиму в течение первых трех недель постнатального развития, давая отличающиеся переднюю, дорсолатеральную и вентральную доли простаты (Lung and Cunha, 1981; Sugimura et al., 1986; Cunha et al., 1987; Prins and Putz, 2008). Во время этого процесса органогенеза первичные эпителиальные типы клеток эпителия простаты специфицируются в соотв. просветные секреторные клетки и подлежащий базальный эпителий, а также в редкую популяцию нейроэндокринных клеток (Shen and Abate-Shen, 2010).

Тканевые взаимодействия, необходимые для развития простаты, активно исследовали, используя метод тканевой рекомбинации, при котором диссоциированные эпителиальные и мезенхимные клетки рекомбинировали и трансплантировали по капсулу почки иммунодефицитных мышей (Cunha et al., 1987; Cunha, 2008). Важно, что исследования тканевой рекомбинации показали, что дифференцировка простаты нуждается как в эпителиальных, так и мезенхимных компонентах, поскольку зрелые типы клеток неспособны дифференцироваться в отсутствии любого из компонентов. Хотя специфичность урогенитальной мезенхимы сравнительно строгая при этом исследовании формирования простаты, имеется относительно меньшая специфичность эпителиального компонента из-за широких пределов эпителиальных типов клеток, могущих формировать простату при комбинировании с урогенитальной мезенхимой (Cunha et al., 1987; Bhatia-Gaur et al., 1999; Cunha, 2008; Taylor et al., 2009).

Некоторые недавние исследования предоставили доказательства центральной роли канонической передачи сигналов Wnt при формировании простаты (Zhang et al., 2006; Schaeffer et al., 2008; Mehta et al., 2011; Simons et al., 2012). В каноническом пути Wnt связывание секретируемых Wnt лигандов с Frizzled/Lrp рецепторными комплексами активирует пути сигнальной трансдукции, которые приводят к накоплению ядерного β-catenin и транскрипции нижестоящих генов мишеней с помощью β-catenin вместе с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF (Logan and Nusse, 2004). Роль канонической передачи сигналов Wnt в раннем развитии простаты была предположена в результате экспрессии многочисленных Wnt лигандов в урогенитальной мезенхиме, а также в эпителии перед и во время образования простаты (Zhang et al., 2006; Prins and Putz, 2008; Schaeffer et al., 2008; Yu et al., 2009). В самом деле, некоторые Wnt лиганды, а также коактиваторы канонического Wnt пути обнаруживают зависимый от пола диморфный паттерн экспрессии, выявляемый специфически в урогенитальном синусе самцов, а также в зачатках простаты (Mehta et al., 2011). Более того, недавнее исследование показало, что делеция β-catenin ведет к потере или редукции образования зачатка простаты, подтверждая важную роль канонической передачи сигналов Wnt ы формировании простаты (Simons et al., 2012; Francis et al., 2013; Mehta et al., 2013). Однако остается неясным, необходима ли каноническая передача сигналов Wnt для индукции простаты per se,или вместо этого она необходима для ранних событий разрастаний протоков простаты, чо отличается от тканевой индукции.

Предыдущие исследования нашей лаб. показали, что гомеодоменовый транскрипционный фактор Nkx3.1 является самым ранним из известных молекулярных маркеров эпителия простаты (Bhatia-Gaur et al., 1999). Экспрессия Nkx3.1 ограничена эпителиальными клетками внутри формирующего зачатка простаты из вентральной, дорсолатеральной и передней долей вскоре после их появления на ст. 17.5 dpc (Bhatia-Gaur et al., 1999; Berman et al., 2004). Во время постнатального органогенеза Nkx3.1 продолжает экспрессироваться в эпителии всех трех долей простаты и оказывается в основном ограниченной клетками просвета у взрослых (Bhatia-Gaur et al.,1999; Chen et al., 2005; Wang et al., 2009). Хотя Nkx3.1 не существенен для формирования простаты, Nkx3.1^-/- нулевые мутантные мыши обнаруживают нарушения образования протоков простаты, при этом обнаруживается 25-40% снижение в количестве кончиков протоков (Bhatia-Gaur et al., 1999; Schneider et al., 2000; Tanaka et al., 2000). Nkx3.1^-/- взрослые простаты также обнаруживают снижение продукции секреторных белков, а также эпителиальную гиперплазию и дисплазию, которые ведут к образованию prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) с возрастом (Bhatia-Gaur et al., 1999; Tanaka et al., 2000; Kim et al., 2002a). Наконец, экспрессия Nkx3.1 маркирует популяцию просветных стволовых клеток и также необходима для поддержания стволовых клеток и клеток предшественников во время регенерации простаты (Wang et al., 2009). Т.о., Nkx3.1 , скорее всего, представляет собой ключевой регулятор органогенеза простаты и дифференцировки просвета, а также активности эпителиальных предшественников.

Базируясь на этих наблюдениях мы исследовали гипотезу, что каноническая передача сигналов Wnt, продуцируемая мезенхимой урогенитального синуса регулирует эпителиальную экспрессию Nkx3.1 во время развития простаты. В нашем исследовании мы использовали целенаправленно lacZ knock-in аллель Nkx3.1, а также высоко чувствительный трансгенный репортер для активности канонической передачи сигналов Wnt для изучения их тканевого распределения во время образования простаты. Мы установили, что активность канонической передачи сигналов Wnt не обнаруживается в эпителии урогенитального синуса до формирования простаты, но была установлена как в эпителии, так и мезенхиме после начала почкования простаты. При исследовании органной культуры урогенитального синуса мы установили, что ингибирование передачи сигналов Wnt нарушает рост зачатка простаты и дифференцировку просвета и подавляет экспрессию Nkx3.1. Напротив, мы также установили, что Nkx3.1 регулирует активность канонической передачи сигналов Wnt в кончиках зачатков простаты во время неонатального развития простаты. Предложена модель формирования простаты, согласно которой каноническая передача сигналов Wnt действует совместно с Nkx3.1 во время органогенеза, регулируя разрастания протоков и эпителиальную дифференцировку.

DISCUSSION

В данном исследовании мы показали, что каноническая передача сигналов Wnt активна как в мезенхимном, так и эпителиальном компартменте во время образования зачатка простаты и раннего роста протоков и ветвления. Используя метод культивирования эксплантов вместе с высоко чувствительными мышиными репортерами для детекции экспрессии Nkx3.1 и реакцию на каноническую передачу сигналов Wnt, мы установили, что ингибирование канонической передачи сигналов Wnt нарушает почкование простаты. Эти дефекты в формировании зачатка и разрастаний ассоциируют со снижением клеточной пролиферации, снижением экспрессии Nkx3.1, и нарушениями дифференцировки просвета в эпителии простаты. Более того, мы установили, что каноническая передача сигналов Wnt активна в кончиках протоков во время разрастаний протоков простаты, при этом она локализуется совместно с экспрессией Nkx3.1, в то время как потеря функции Nkx3.1 ведет к снижению или отсутствию активности канонической передачи сигналов Wnt в кончиках протоков.

Базируясь на своих находках мы предложили след. схематическую интерпретацию наших находок относительно функции канонического Wnt и Nkx3.1 в развитии простаты (Fig. 6). Перед инициацией почкования простаты на ст. 17.5 dpc, каноническая активность Wnt присутствует в мезенхиме урогенитального синуса, но эти Wnt сигналы не воспринимаются эпителием урогенитального синуса. После того как зачаток простаты начинает формироваться каноническая передача сигналов Wnt от мезенхимы непосредственно или косвенно активирует экспрессию Nkx3.1 а также эпителиальную активность Wnt в зарождающихся кончиках зачатков. На неонатальных стадиях, Nkx3.1 и каноническая передача сигналов Wnt в эпителии создает позитивную петлю обратной связи, чтобы способствовать морфогенезу ветвления и дифференцировке просветов внутри удлиняющихся зачатков простаты. Отметим, что такая модель согласуется с известными функциями Nkx3.1 в ветвлении протоков и дифференцировке просветов (Bhatia-Gaur et al., 1999). Более того, каноническая передача сигналов Wnt на кончиках зачатка простаты, скорее всего, регулирует разрастания протоков и ветвление, в соответствии с её сходной ролью в др. органных системах, включая развитие почек (Bridgewater et al., 2008), лёгких (Cardoso and Lu, 2006), слюнных желез (Haara et al., 2011; Patel et al., 2011) и молочных желез (Sternlicht et al., 2006).

Figure 6. Proposed roles of canonical Wnt signaling during prostate development. Before prostate bud formation, canonical Wnt signaling activity (green) is detected only in the urogenital mesenchyme and not the urogenital epithelium. After bud formation, canonical Wnt signals from the mesenchyme activate epithelial Nkx3.1 expression, and also up-regulate canonical Wnt signaling activity in prostate bud epithelial cells (blue arrows). At neonatal bud tips, Nkx3.1 functions together with canonical Wnt signals in a positive feedback loop to regulate ductal branching and luminal differentiation. dpc, days postcoitum; P, postnatal day; UGE, urogenital epithelium; UGM, urogenital mesenchyme.

В подтверждение роли канонической передачи сигналов Wnt в морфогенезе ветвления, мы наблюдали высокие уровни активности Wnt репортера в кончиках зачатков простаты во время первой недели неонатального развития простаты, когда количество дистальных кончиков и точек ветвления увеличивается с наивысшей скоростью (Sugimura et al., 1986). Также в согласии с этой моделью то, что делеция β-catenin в эпителиальных клетках в органной культуре или воздействие на ст. P2 на простату крыс Dkk1 в органной культуре приводят к редукции ветвления протоков, хотя и при сниженном количестве базальных эпителиальных клеток (Wang et al., 2008; Francis et al., 2013). Более того, мы установили, что активность Wnt репортера снижена в кончиках зачатка простаты Nkx3.1^-/-, в которой количество протоков простаты снижено по сравнению с диким типом (Bhatia-Gaur et al., 1999), указывая тем самым, что Nkx3.1 может регулировать активность канонического Wnt в кончиках зачатка во время органогенеза простаты. Отметим, поскольку не все Nkx3.1-экспрессирующие клетки экспрессируют также TCF/Lef:H2B-GFP репортер, то очень вероятно, что каноническая передача сигналов Wnt не нужна клеткам автономно для поддержания экспрессии Nkx3.1.

Наш анализ канонической передачи сигналов Wnt и экспрессии Nkx3.1 был облегчен двумя высоко чувствительными мышиными реагентами. Во-первых, чтобы отслеживать экспрессию Nkx3.1в эксплантах урогенитального синуса, мы сгенерировали новую целенаправленную Nkx3.1lacZ knock-in линию, в которой экспрессия β-galactosidase воспроизводила эндогенную экспрессию Nkx3.1. Интересно, что для независимой Nkx3.1lacZ knock-in линии была описана экспрессия β-galactosidase в нескольких тканях, которые не экспрессируют Nkx3.1 (Schneider et al., 2000), это может быть обусловлено позиционными эффектами от не вырезанной PGK-neo селекционной кассеты, подобно описанным эффектам не вырезанных селекционных кассет в нескольких различных targeted локусах (Olson et al., 1996; Pham et al., 1996; Moran et al., 1999).

Во-вторых, мы использовали высоко чувствительный репортер для канонической передачи сигналов Wnt в TCF/Lef:H2B-GFP трансгенной линии (Ferrer-Vaquer et al., 2010), чтобы увидеть динамическое распределение канонической активности передачи сигналов Wnt in vivo, а также в эксплантах урогенитального синуса. В частности, чувствительность этих Wnt репортерных мышей намного превосходит предыдущие литературные находки. Напр., мы оказались способными выявлять каноническую передачу сигналов Wnt в мезенхиме урогенитального синуса перд образованием простаты, тогда как предыдущие исследования, используя BAT-gal транспортер могли только выявлять активность β-galactosidase в эпителиальных клетках простаты на постнатальный день 5 (Wang et al., 2008). Важно, мы уверены, что TCF/Lef:H2B-GFP репортер аккуратно воспроизводит распределение канонической активности Wnt, поскольку паттерн экспрессии GFP во время органогенеза простаты соответствует опубликованному описанию экспрессии Axin2 , а также Lef1 в кончиках протоков зачатка (Mehta et al., 2011; Wu et al., 2011; Francis et al.,2013). Не смотря на чувствительность TCF/Lef:H2B-GFP репортера для канонической активности Wnt, мы не смогли обнаружить экспрессию GFP в эпителии урогенитального синуса на ст. 15.5 или 17.5 dpc, подтверждая тем самым, что передача сигналов Wnt может не восприниматься эпителиальными клетками до формирования зачатка простаты. Напротив, экспрессия Axin2 в эпителии урогенитального синуса на ст. 16.5 и 17.5 dpc была описана с помощью количественной reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR; Simons et al., 2012) и с помощью гибридизации in situ низкого разрешения по целому препарату (Mehta et al., 2011); однако, экспрессия Axin2 мРНК может не всегда соответствовать канонической передаче сигналов Wnt (Jho et al., 2002).

Отметим, что недавняя работа с использованием экспериментов на органной культуре показала, что индуцибельная делеция β-catenin как в урогенитальном эпителии, так и клетках мезенхимы ведет к недостаточности почкования простаты и отсутствию экспрессии Nkx3.1, указывая на роль в спецификации простаты (Simons et al., 2012). Два др. недавних исследования показали, что индуцибельная делеция β-catenin специфически в эпителии урогенитального синуса ведет к сильному нарушению почкования и потере экспрессии Nkx3.1 в органной культуре и in vivo (Francis et al., 2013; Mehta et al., 2013). Эти результаты согласуются с нашими находками, что экспрессия Nkx3.1 сильно снижается после воздействия на UGS экспланты растворимыми Wnt ингибиторами, которые, скорее всего, не полностью ингибируют каноническую передачу сигналов Wnt в наших экспериментах с органной культурой. Однако наши наблюдения отсутствия активности репортера TCF/Lef:H2B-GFP в урогенитальном эпителии перед образованием простаты подтверждает, что передача сигналов Wnt в мезенхиме не нужна для почкования простаты per se. Вместо этого мы предпочитаем гипотезу, что мезенхимная и эпителиальная передача сигналов Wnt, скорее всего, необходима последовательно для разрастания зачатка простаты и последующих событий ветвления протоков и дифференцировки эпителия просветов (Fig. 6), так что отсутствие канонической передачи сигналов Wnt в обоих компартментах или в только в эпителиальном компартменте д. приводить к дефектному росту зачатка и потере Nkx3.1.

Наше исследование предоставляет новую информацию о взаимоотношениях канонической передачи сигналов Wnt с функцией androgen receptor (AR) во время формирования простаты. В частности, AR первоначально необходим в урогенитальной мезенхиме для продукции сигналов для индукции и роста простаты и только позднее в эпителии для секреторной функции дифференцированных просветных эпителиальных клеток (Cunha et al.,1987; Prins and Putz, 2008). , следовательно, современная модель индукции простаты связана с активацией AR с помощью тестикулярных андрогенов в мезенхиме урогенитального синуса, которые в свою очередь ведут к продукции и/или активации паракринных сигналов, которые действуют на урогенитальный эпителий, чтобы индуцировать почкование простаты (Cunha, 2008; Thomson, 2008). Такие паракринные индуктивные сигналы были обозначены andromedins, но качественные особенности кандидатов andromedins остаются неясными (Tenniswood, 1986; Thomson, 2008). Наши результаты подтверждают, что каноническая передача сигналов Wnt от мезенхимы может не действовать как настоящие andromedins непосредственно, но может действовать кооперативно с др. мезенхимными сигналами во время индукции и специфкации простаты. Эта интерпретация также согласуется с наблюдением, что индуцибельная избыточная экспрессия β-catenin в эпителии урогенитального синуса недостаточна, чтобы индуцировать экспрессию Nkx3.1 или формирование зачатка простаты (Mehta et al., 2013). Мезенхимные сигналы, которые могут кооперировать с канонической передачей сигналов Wnt, могут включать FGF10, который экспрессируются в урогенитальной мезенхиме и необходим для образования простаты, но не сам по себе, по-видимому, представляет зависимый от пола диморфный сигнал (Lu et al., 1999; Thomson and Cunha, 1999; Donjacour et al., 2003; Pu et al., 2007; Thomson, 2008).

Наконец эпителиально-мезенхимные взаимодействия, которые являются критическими для почкования простаты и морфогенеза протоков во время органогенеза находятся , скорее всего, в беспорядке во время прогрессирования опухоли простаты, что было подтверждено исследованиями профилирования экспрессии генов (Schaeffer et al., 2008; Pritchard et al., 2009). Напр., способность канонической передачи сигналов Wnt, обеспечивающая коммуникации между эпителиальными и мезенхимными клетками и регуляцию экспрессии Nkx3.1, может предоставить информацию о механизмах, как каноническая передача сигналов Wnt может быть активирована в устойчивой к кастрации раковой опухоли простаты (Kypta and Waxman, 2012). Повышенная экспрессия Wnt16b в микроокружении опухоли увеличивает резистентность к лечению опухолей простаты у человека (Sun et al., 2012). Следовательно, понимание функции канонического пути Wnt в нормальном развитии простаты может пролить свет на нарушение регуляции этого критического сигнального пути при туморогенезе простаты.