Посещений:
РОМБОМЕР 4

Экспрессия трансгенов

A Gal4/UAS system for conditional transgene expression in rhombomere 4 of the zebrafish hindbrain
Seong-Kyu Choe, Mako Nakamura, Franck Ladam, Letitiah Etheridge, Charles G. Sagerstrom
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 6, pages 1125–1132, June 2012

Background: The zebrafish is well established as a model organism for the study of vertebrate embryogenesis, but transgenic lines enabling restricted gene expression are still lacking for many tissues. Results: We first generated the hoxb1a(β-globin):eGFPum8 line that expresses eGFP in hindbrain rhombomere 4 (r4), as well as in facial motor neurons migrating caudally from r4. Second, we generated the hoxb1a(β-globin) Gal4VP16um60 line to express the exogenous Gal4VP16 transcription factor in r4. Lastly, we prepared the UAS(β-actin):hoxa3aum61 line where the hoxa3a gene, which is normally expressed in r5 and r6, is under control of Gal4-regulated UAS elements. Crossing the hoxb1a(β-globin):Gal4VP16um60 line to the UAS(?-actin):hoxa3aum61 line drives robust hoxa3a expression in r4. We find that transgenic expression of hoxa3a in r4 does not affect hoxb1a expression, but has variable effects on migration of facial motorneurons and formation of Mauthner neurons. While cases of somatic transgene silencing have been reported in zebrafish, we have not observed such silencing to date, possibly because of our efforts to minimize repetitive sequences in the transgenic constructs. Conclusion: We have generated three transgenic lines that will be useful for future studies by permitting the labeling of r4-derived cells, as well as by enabling r4-specific expression of various transgenes. Developmental Dynamics 241:1125–1132, 2012. © 2012 Wiley Periodicals, Inc.
Многие работы на эмбрионах рыбок данио связаны с микроинъекциями мРНК или антисмысловых олигонуклеотидов, чтобы модулировать функцию генов, но довольно быстро было установлено, что временная природа таких подходов ограничивает пригодность некоторых подходов, и что методы для непосредственных манипуляций с зародышевой линией рыбок данио также необходимы. Поскольку разработка таких инструментов первоначально сдерживалась развитием технологий в др. областях, но недавно достигнуты значительные успехи. В частности, внесение трансгенов, которые первоначально страдали от низкой величины интеграции и высокой степени мозаицизма, было существенно улучшено благодаря разработке базирующейся на транспозоне (Tol2) техники (Kawakami et al.,2000,2004). В самом деле, для этой цели система Tol2 теперь позволяет генерировать трансгенные линии, готовые для решения многих биологических вопросов. Первоначально большинство усилий было направлено на получение репортерных линий рыбок данио, экспрессирующих маркеры, такие как GFP в различных тканях, Но сравнительно недавно успехи трансгенеза были сконцентрированы на генерации линий, делающих возможной зависимую от условий экспрессию генов. Такая кондиционная экспрессия генов достигается благодаря использованию промоторов, которые могут быть активированы в ответ на специфические внешние стимулы (напр., тепловой шок) или будут активными только в специфических тканях. Оба эти подхода успешно используются на рыбках данио (e.g., Higashijima et al.,1997; Scheer et al.,2002). Кондиционная экспрессия трансгена в дальнейшем была улучшена c помощью двухсоставных систем (напр., Cre/Lox и Gal4/UAS), где тканеспецифическая "driver line" используется для контроля экспрессии генов в "reporter lines." Эти системы делают возможным как временной, так и пространственный контроль экспрессии генов и также делают возможным множественное использование линий, так что одна линия драйвер может быть использована для контроля нескольких разных репортерных линий (и наоборот).
Система Gal4/UAS использует дрожжевой Gal4 транскрипционный фактор, который активирует транскрипцию генов под контролем UAS (upstream activator sequence) промоторных элементов. Система Gal4/UAS впервые была использована на дрозхофиле (Fischer et al.,1988; Brand and Perrimon,1993), но она также начала использоваться на мышах (e.g., Ornitz et al.,1991; Matsumoto et al.,2004; Iyer et al.,2005; Ovchinnikov et al.,2008). За счет избирательного использования промоторов, трансгенные линии могут быть созданы с тканеспецифическим паттерном экспрессии Gal4. Эти тканеспецифические Gal4 линии затем скрещивали с трансгенными линиями, где интересующие гены были помещены под контроль UAS. Поскольку этот подход нуждается в первоначальных инвестициях по генерации множественных линий, он имеет преимущества благодаря "mixing and matching," так что любая Gal4 линия может быть скрещена с любой линией UAS и разные линии оказываются пригодными для всего сообщества исследователей. Первоу использованию системы Gal4/UAS на рыбках данио предшествовала разработка базирующегося на Tol2 трансгенеза и привело к довольно неэффективной экспрессии, а также к редким событиям интеграции (Scheer and Campos-Ortega,1999). Эффективность экспрессии впоследствии былк улучшена за счет использования Gal4VP16, слияния между белком Gal4 и сильным доменом активации транскрипции белка 16 из простого вируса герпеса, а также за счет использования конструкции UAS, содержащей 14 повторов элемента UAS. Поскольку эти модификации улучшили экспрессию при временном использовании (Koster and Fraser,2001), то были созданы стабильные линии с использованием Gal4VP16/14xUAS , обнаруживающие мозаичную (variegated) экспрессию, возможно в результате включения множественных трансгенных копий, которые в дальнейшем стали предметом замалчивания (e.g., Sagasti et al.,2005). Для минимизации мозаичного эффекта технология Gal4/UAS недавно была интегрирована с систомой Tol2 транспозона, которая увеличивала частоту одиночных инсерций и тем самым минимизировала эффекты замалчивания. Т.к. Tol2-обеспечиваемый Gal4/UAS трансгенез сегодня используется успешно разными группами для отлавливания генов и энхансеров, а также для генерации тканеспецифичных Gal4 драйвер-линий (Davison et al.,2007; Scott et al.,2007; Asakawa et al.,2008; Distel et al.,2009), то имелись сообщения и о мозаичных эффектах и замалчивании трансгенов в этой системе (Goll et al.,2009; Akitake et al.,2011). Несмотря на это, мы решили, что досточное количество информации может быть получено от предыдущих попыток Gal4/UAS трансгенеза у рыбок данио, что облегчает использование Gal4/UAS инструментов для исследования специфических тканей у эмбрионов рыбок данио.
Нашей целью стало создание Gal4/UAS инструментов для анализа развития заднего мозга у рыбок данио и здесь мы сообщаем о трансгенных линиях, предназначенных для анализа развития ромбомера 4 (r4) . Мы впервые идентифицировали фрагмент в 1.0-kb из промотора hoxb1a рыбок данио и продемонстрировали, что он достаточен для управления экспрессией GFP в r4 у стабильных трансгенных Tg(hoxb1a-βglobin:eGFP)um8 эмбрионов, suggesting that this promoter fragment contains all required regulatory elements. We next established a transgenic line where this 1.0-kb fragment drives expression of the Gal4VP16 transcription factor Tg(hoxb1a-βglobin:Gal4VP16)um60. Мы установили, что экспрессия Gal4VP16 ограничена r4 у Tg(hoxb1a-βglobin:Gal4VP16)um60 эмбрионов и установили, что этот ограниченный r4 Gal4VP16 может трансактивировать экспрессию GFP с временно внесенной UAS:GFP плазмиды. Наконец, мы описали происхождение UAS:Hoxa3a трансгенной линии Tg(UAS:hoxa3a)um61 и продемонстрировали, что Tg(hoxb1a-βglobin:Gal4VP16)/Tg(UAS:hoxa3a)um61 эмбрионы обнаруживают сильную экспрессию hoxa3a в r4. Эта эктопическая экспрессия нарушает образование Mauthner нейронов в r4 и мешает миграции лицевых двигательных нейронов из r4, но не влияет на экспрессию hoxb1a в r4. Мы не наблюдали какого-либо мозаицизма (variegation) или замалчивания этих трансгенов, несмотря на то, что линия Tg(hoxb1a-βglobin:eGFP)um8 прошла 6 генераций. Мы полагаем, что отсутствие молчания возможно связано с использованием нами двухсоставной системы, где Gal4VP16 драйвер и UAS репортер находятся в разных линиях, а также благодаря использованию уменьшено количества UAS элементов в линии UAS.

DISCUSSION


Недавние успехи в трансгенезе у рыбок данио облегчили создание трансгенных линий, но количество таких линий, доступных для анализа какой-либо специфической ткани, ограничено. Мы описали создание трех трансгенных линий для анализа заднего мозга рыбок данио. Линия hoxb1a(β-globin):eGFPum8 управляет экспрессией eGFP в ромбомере 4 (r4) заднего мозга рыбок данио, а также миграцией лицевых двигательных нейронов из r4 в каудальную часть заднего мозга. мРНК eGFP впервые обнаруживается в r4 на ст. 10hpf (Fig. 2G) и флюоресценция eGFP обнаруживается на ст. 13hpf (Fig. 2J). Это начало экспрессии запаздывает по сравнению с экспрессией hoxb1a с эндогенного промотора приблизительно на 2 ч. Линия hoxb1a(β-globin):Gal4VP16um60 управляет экспрессией экзогенного транскрипционного фактора Gal4VP16 в r4 приблизительно с той же самой кинетикой, что наблюдается для eGFP (Fig. 3D). Наконец, трансген UAS(β-actin):hoxa3aum61 не экспрессируется у эмбрионов рыбок данио, пока не будет скрещен с линией hoxb1a(β-globin):Gal4VP16um60, в которой ген hoxa3a начинает эктопически экспрессироваться в r4. Эти линии были использованы, т.к. они позволяли маркировать клетки r4 cells, используя hoxb1a(β-globin):eGFPum8 линию и позволили форсировать r4-экспрессию любого UAS-контролируемого трансгена путем скрещивания с hoxb1a(β-globin):Gal4VP16um60. Кроме того, скрещивания UAS(β-actin):hoxa3aum61 линии с др. Gal4 линиями позволило управлять экспрессией hoxa3a в любом количестве тканей. Мы отметили совпадение с меченными порциями заднего мозга мышей, недавно описанными (Makki and Capecchi,2010), но в которых использовали др. hox промотор (hoxa1, эквивалентный hoxb1b рыбок данио), следовательно, не ограничено r4. Очевидно, что меченные мышиные линии также показывают задержку относительно экспрессии эндогенного промотора, подтверждая, что это может быть общим свойством трансгенных репортерных линий.
Мы установили, hoxb1a(β-globin):Gal4VP16um60/UAS(β-actin):hoxa3aum61 эмбрионы экспрессируют эктопически hoxa3a в r4 , как и ожидалось. Отметим, что эта эктопическая экспрессия не влияет на экспрессию hoxb1a, но оказывает варьирующие эффекты на образование Mauthner нейронов и миграцию nVII лицевого двигательного нейрона. Это может быть результатом частичной респецифкации r4 после экспрессии hoxa3a, но эту гипотезу необходимо подтвердить дополнительными экспериментами. Наши результаты отличаются от недавно описанных, что управление экспрессией hoxb3 в r4 мышей осуществляется за счет использования r4-специфичесского энхансера гена hoxb2 (Wong et al.,2011) и что наблюдается потеря экспрессии hoxb1 а также аномальный нейрогенез в r4. Поскольку возможно, что различия между этими исследованиями обусловлены разными активностями hoxa3a в противовес hoxb3, мы полагаем, что , скорее всего, различия во времени начала экспрессии трансгена объясняют разные эффекты на экспрессию hoxb1a. В особенности потому. что наша система базируется на инициальной экспрессии Gal4VP16, которая затем трансактивирует hoxa3a, эктопическая экспрессия hoxa3a не инициируется в r4 до тех пор, пока не будет транскрибирован hoxb1a.
Сообщалось, что Gal4/UAS трансгенез у рыбок данио страдает от соматического молчания, очевидно обусловленного метилированием ДНК из трансгенного локуса (Goll et al.,2009). Это молчание проявляет себя потерей экспрессии трансгена в последующих генерациях и как варьирующая экспрессия у индивидуальных эмбрионов. Поскольку мы наблюдали экспрессию типа "соль и перец" hoxb1a(β-globin):eGFPum8 трансгена, это, по-видимому, ограничено более ранними стадиями развития и в дальнейшем "filled in" так, что согласуется с экспрессией, наблюдаемой по всему домену экспрессии eGFP. Мы интерпретировали это как представление стохастического начала экспрессии eGFP скорее, чем молчание и пришли к заключению, что мы не наблюдаем замалчивания в какой-либо из наших линий. Хотя мы не можем исключить возможность, что молчание станет очевидным в последующих генерациях, также возможно, что некоторые свойства наших трансгенных конструкций делают их менее чувствительными к молчанию. В частности, мы использовали несколько подходов, чтобы минимизировать повторяющиеся последовательности в наших трансгенных линиях. Во-первых, мы использовали систему Tol2, которая скорее всего продуцирует инсерции единственной копии, по сравнению с не-Tol2 подходами, которые могут приводить к инсерции множественных concatamerized трансгенов в один локус. Во вторых, поскольку предыдущие исследователи часто использовали "self-reporting" Gal4/UAS системы, в которых Gal4VP16-драйвер и UAS-репортер присутствовали в одной и той же плазмиде, мы разделили их по двум разным плазмидам и использовали их для получения драйвер и репортерной линий. В-третьих, поскольку UAS конструкции с 10 или 14 повторенными UAS элементами были использованы ранее, мы использовали UAS репортер, содержащий 5 UAS элементов. Сходноое заключение было недавно сделано Goll с сотр. в более системном исследовании (Akitake et al.,2011). В самом деле, c помощью прямого сравнения замалчивания репортерных линий, содержащих 4 или 14 UAS элементов, эти исследователи установили, что меньшее количество UAS элементов коррелирует с более низкими уровнями молчания и более низкими уровнями метилирования ДНК трансгенного локуса. Это подтверждает генеральную концепцию, что минимизация повторяющихся элементов важна для избегания соматического молчания трансгенов у рыбок данио.