Развитие почек начинается с (E)10.5 дня эмбриогенеза у мышей, при этом выросты зачатков мочеточников из Вольфовых протоков в лежащую поверх метанефрическую мезенхиму (rev. Little and McMahon, 2012). В ответ на индукционные сигналы от зачатков мочеточников, метанефрическая мезенхима конденсируется в виде плотной шапочки клеток предшественников нефронов вокруг кончиков уретрического зачатка, тогда как веточки от уретрического зачатка формируют собирающую систему. Во время нефрогенеза предшественники нефронов обладают способностью к самообновлению и к дифференцировке в pretubular агрегаты, которые в свою очередь подвергаются мезенхимно-эпителиальному переходу, чтобы постепенно сформировать ранние почечные пузырьки, похожие на запятую тельца, S-образные тельца и в конечном итоге функциональные нефроны (Saxen and Sariola, 1987; Self et al., 2006; Kobayashi et al., 2008).

Дефекты нефрогенеза и ветвления уретрического зачатка приводят к врожденным аномалиям почек мочевых путей (CAKUT). При показателе в 1:400 (Pope et al., 1999; Rumballe et al., 2010), CAKUT представляет один из наиболее частых врожденных дефектов у человека и является основной причиной почечной недостаточности у детей. Эти плейотропные нарушения представлены множественными почечными фенотипами, включая агенез, гипоплазию и дисплазию почек, ассоциированные с обструктивными или refluxive аномалиями мочеточников (Toka et al., 2010). CAKUT , как полагают, имеют разные генетические источники (Weber, 2012), пока молекулярный патогенез CAKUT не совсем понятен. Дефицит нефронов является характерными признаком CAKUT (Puddu et al., 2009). Фактически, количество нефронов варьирует даже в нормальных рамках от 11000 до 19000 у мышей (Merlet-Benichou et al., 1999), и от 200000 до 1.8 миллиона у людей (Hughson et al., 2003). Низкий вклад нефронов внутри этих нормальных пределов, как полагают, бессимптомный в ранней жизни, ассоциирует с гипертензией, начинающейся у взрослых (Mackenzie and Brenner, 1995; Walker et al., 2012), ведущей причине коронарной сердечной болезни, инсультам и почечной недостаточности в Сев. Америке (Tedla et al., 2011). Несмотря на фундаментальную важность вклада нефронов в здоровье и болезни, идентифицировано лишь небольшое число молекулярных механизмов, лежащих в основе морфогенеза нефронов.

Ген Wilms' Tumour Suppressor-1 (WT1) кодирует ядерный транскрипционный фактор, связывающий ДНК и РНК, который играет важную роль во время нефрогенеза, частично благодаря своим эффекторам генам мишеням. Однако эндогенные гены мишени, которые опосредуют функцию WT1 во время развития почек, в основном неизвестны. Ранее мы использовали анализ локализации по всему геному Wt1 ChIP-chip в почечной ткани эмбрионов E18.5 мышей в качестве способа идентификации новых генов развития почек, которые могли бы действовать ниже Wt1, чтобы контролировать нефрогенез in vivo (Hartwig et al., 2010). Мы идентифицировали все три члена Sry-related high-mobility group (HMG) Box (Sox)-C подсемейства-Sox4, Sox11 и Sox12-в качестве кандидатов генов мишеней для Wt1 с помощью ChIP-chip. Члены семейства генов Sox, как было установлено, играют ведущие регуляторные роли во множестве онтогенетических процессов, включая формирование дорсо-вентрального паттерна (Chen et al., 2012), стволовость (Avilion et al., 2003; Masui et al., 2007; Wang et al., 2012), самцовую дифференцировку (Koopman et al., 1991; Wagner, 1994), нейрогенез (Bylund et al., 2003; Taranova et al., 2006; Bhattaram et al., 2010; Bergsland et al., 2011; Mu et al., 2012), кардиальный тракт оттока, B-лимфоциты (Schilham et al., 1996) и развитие спинного мозга (Shim et al., 2012), а также скелетогенез (Akiyama and Lefebvre, 2011). Однако, SOX функция в развивающихся почках в основном неизвестна.

Sox гены млекопитающих отнесены к 8 подгруппам (A-H), исходя из филогенетической гомологии их HMG box ДНК-связывающего домена. SOX белки из разных подгрупп обладают частичным сходством (менее 46%) в своём ДНК-связывающем домене и не обнаруживают сходства вне этого домена. Напротив, члены подгруппы обладают высокой степенью сходства внутри и вне ДНК-связывающих доменов, поэтому часто обнаруживают функциональное перекрывание в тканях, где они совместно экспрессируются. Поэтому все три члена подсемейства SoxC-Sox4, Sox11 и Sox12-обнаруживают перекрывающиеся паттерны экспрессии во многих тканях во время эмбрионального развития, подтверждая генетическую избыточность внутри этого подсемейства (Dy et al., 2008; Hoser et al., 2008). В данном исследовании мы охарактеризовали паттерн экспрессии в развитии почек трех SoxC генов и показали, что обнаруживается строгая экспрессия Sox4 в предшественниках нефронов и происходящих из них нефрогенных структурах, тогда как Sox11, по-видимому, преимущественно экспрессируется в дифференцирующихся нефрогенных структурах во время развития почек. Чтобы начать наши исследования функции SoxC во время нефрогенеза, мы устраняли функцию Sox4 в предшественниках нефронов и в их клеточных производных (Sox4^nephron- mice), используя известную Six2Cre-EGFP трансгенную линию (Kobayashi et al., 2005, 2008). Постнатальные Sox4^nephron- почки обнаруживали достоверное уменьшение количества нефронов. Sox4^nephron- мыши обнаруживали пониженную экспрессию nephrin в подоцитах на ст. P7, у них возникали тяжелые с секрецией белков (proteinacious) повреждения почек в течение 2-х недель после рождения, приводя к абсолютной почечной недостаточности. В целом наши результаты продемонстрировали важную потребность в Sox4 для нормального развития почек и подкрепили роль Sox4 в развитии почечных клубочков и/или в поддержании клубочков у взрослых in vivo.

Наше наблюдение снижения вклада нефронов у Sox4^nephron- мышей демонстрирует важную роль Sox4 в нефрогенезе in vivo. Однако тяжесть с ранним началом proteinuric повреждений клубочков, наблюдаемая у постнатальных Sox4^nephron- мышей не легко объяснить уменьшением числа нефронов, поэтому предполагается участие Sox4 в развитии подоцитов и/или поддержании подоцитов у взрослых. Учитывая сложность и плохую изученность взаимодействий между подоцитами, эндотелием, mesangium и базальной мембраной клубочков, вполне возможно, что альтерации в экспрессии генов или морфологии подоцитов могут вызывать вторичные реакции в этих типах клеток, которые будут в дальнешем усиливать повреждения почечных клубочков. Чтобы оценить, регулирует ли Sox4 развитие гломерул и/или их поддержание, мы осуществляли непрямую иммунофлюоресценцию ключевых гломерулярных маркеров в Sox4^nephron- почках на ст E17.5 и P7 (Fig. 6). На ст. E17.5, Sox4^nephron- гломерулы не обнаруживали альтераций в экспрессии ранних гломерулярных маркеров, включая белки гломерулярных базальных мембран nidogen (Fig. 6A vs. B) и β1 integrin (data not shown), гломерулярные мезангиальные маркеры, включая NG2 chondroitan sulfate (Fig. 6E vs. F), desmin и PDGF-R (data not shown), endothelial protein PECAM-1 (Fig. 6I vs. J), белки щелевых мембран подоцитов nephrin (Fig. 6M vs. N) и podocin (Fig. 6Q vs. R), или ядерный маркер подоцитов Wt1 (Fig. 6U vs. V). Однако на ст. P7, Sox4^nephron- гломерулы обнаруживали специфическое снижение экспрессии nephrin, тогда как экспрессия podocin, а также др. маркеров эндотелия, мезангия и базальной мембраны оставалась нормальной. Nephrin является крупным трансмембранным белком сверхсемейства immunoglobulin (Ig) и ключевым структурным компонентом щелевой мембраны подоцитов (Tryggvason et al., 2006). Регулярные интервалы между соседними ножными (foot) отростками подоцитов поддерживаются с помощью адгезивных взаимодействий между nephrin и др. белками сверхсемейства Ig, экспрессируемых на противопоставленных ножных отростках подоцитов. Потеря или аномальная функция nephrin ведет к протеинурии, обусловленной потерей щелевой диафрагмы и устранением ножных отростков подоцитов (Jones et al., 2009; New et al., 2013). Наши результаты демонстрируют снижение экспрессии nephrin на ст. P7 в Sox4^nephron- гломерулах, подтверждающей, что потеря экспрессии nephrin может частично лежать в основе наблюдаемого гломерулярного фенотипа у P16 Sox4^nephron- мышей и указывает на роль Sox4 в регуляции экспрессии nephrin.

Nephrin является транскрипционной мишенью для WT1 (Wagner et al., 2004). Поэтому потеря экспрессии nephrin в Sox4^nephron- почках может быть вторичной по отношению к снижению экспрессии WT1 в Sox4^nephron- подоцитах, подтверждая роль Sox4 в регуляции WT1 в подоцитах. Важно, что пониженные количества Wt1⁺ подоцитов в Sox4^nephron- мальпигиевых тельцах могут отражать пониженные количества подоцитов у этих мышей, подтверждая, что аберрантная экспрессия nephrin и повреждения гломерул могут быть частично приписаны потере подоцитов в Sox4^nephron- почках, подтверждая роль Sox4 в развитии подоцитов in vivo.

Итак, мы установили относительные количества и субклеточное распределение трех SoxC генов во время развития почек. Анализ постнатальных Sox4 мутантных мышей продемонстрировал важную потребность, по крайней мере, в одном из членов подсемейства SoxC для нефрогенеза in vivo, и подтвердил потенциальную роль Sox4 в развитии подоцитов и/или поддержании взрослых подоцитов. Дальнейшие исследования должны оценить, регулирует ли Sox4 транскрипционно экспрессию nephrin in vitro. Исследования по кондиционным делециям генов д. иметь целью устранение Sox4 в подоцитах, чтобы определить специфическую роль Sox4 в клоне подоцитов и оценить независимую роль Sox11 , а также комбинированную роль передачи сигналов Sox4/Sox11 во время развития почек in vivo.