Мы исследовали профили транскрипции одиночных N1-CKO и WT клеток сетчатки с помощью Affymetrix микромассивов, чтобы исследовать изменения в экспрессии генов, которые происходят в отсутствие Notch1 и как клетки переходят от состояния предшественника к состоянию нейрона. На ранних постнатальных стадиях большинство RPCs продуцируют постмитотические клетки, которые затем дифференцируются в функциональные нейроны в течение нескольких недель (Young, 1985b). Уровни передачи сигналов Notch1, скорее всего, считываются во время периода, когда митотические клетки продуцируют постмитотические клетки и устанавливаются судьбы этих клеток. Это ожидание базировалось на экспрессии РНК Notch1 с использованием гибридизации in situ (Lindsell et al., 1996; Bao and Cepko,1997), SAGE (Blackshaw et al., 2004), и микромассивов одиночных клеток (Trimarchi et al.,2008). Более того, исследования потеря функции, осуществленные в нескольких лаб. подтвердили роль Notch1 в делениях клеток (Dorsky et al., 1995; Henrique et al.,1997; Jadhav et al., 2006a; Nelson et al., 2007; Yaron et al., 2006). Наши предыдущие исследования электропортированных клеток в сетчатку на ст. P0 показали, что митотические клетки или клетки, выходящие из митоза, приобретают плазмиды (Matsuda and Cepko, 2004, 2007). Эти наблюдения вкупе с анализом размеров ретровирусных клонов (Fields-Berry et al., 1992) и исследованиями Young's по времени рождения (Young, 1985b), привели к заключению, что электропортация Cre мышам Notch1^fl/fl на ст. P0, и с анализом результатов на ст. P3, ведет к удалению Notch1 из этой переходной популяции клеток. Поскольку путь передачи сигналов Notch является мощным регулятором многих клеточных процессов, то он тонко регулируется, чтобы предупредить длительную активацию (Kopan and Ilagan, 2009). Напр., известно, что активированная форма рецептора, NICD, не накапливается или не задерживается в клетках благодаря последовательности PEST, которая направляет её на деградацию (Оberg et al., 2001). Исходя из этих наблюдений, мы ожидали, что скорость оборота белка Notch в клетках сетчатки будет довольно быстрой, скорее всего, быстрее, чем скорость, с которой ретинальные клетки приобретают свои разнообразные судьбы. В самом деле, транскриптомы клеток 13 N1-CKO, у которых определяли профили, подтвердили это ожидание. Большинство этих клеток теряло экспрессию Notch мишеней, прекращало деления и теряло гены предшественников, тогда как появлялись немногие клетки, по-видимому, находящиеся в процессе подавления этих генов. Более того, эти клетки экспрессировали ранние гены маркеры палочек (такие как Blimp1, Crx, Otx2), но не маркеры дифференцированных палочек (такие как rhodopsin), подтверждая. что потеря Notch1 не ускоряет драматически программу их дифференцировки. Однако, состояние этих клеток, по-видимому, далее подавляет путь развития палочек по сравнению с клетками WT, которые также подавляют гены мишени для Notch, но которые сохраняют экспрессию некоторых генов клеточного цикла и предшественников.

Используя этот беспристрастный метод профилирования одиночных клеток, мы идентифицировали большое количество генов, которые или активируются или подавляются в отсутствие Notch1. Когорта подавляемых генов включала регуляторы клеточного цикла или маркеры предшественников, некоторые из которых ещё не были оценены в отношении чувствительности к Notch1 (напр.,Fgf15, Cdc20, Crym). Активируемые гены включали известные регуляторы или маркеры развития фоторецепторов палочек, такие как NeuroD1, Math3, Rbp3 и Blimp1. Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы протестировать новые гены, чувствительные к Notch, идентифицированные в данном исследовании в отношении их роли в развитии сетчатки.

Большинство профилированных N1-CKO клеток было классифицировано как зарождающиеся фоторецепторы, используя Blimp1 в качестве маркера. Как было описано выше Blimp1 экспрессируется в клетках предшественниках палочек. Гены, чьи паттерны экспрессии были высоко скоррелированы с Blimp1, включают гены, как известно, экспрессирующиеся в палочках, таие как Math3, Rbp3 и Rax, помимо вновь идентифицированного гена, Epha8. Паттерн экспрессии Epha8 на ст. P3 подтверждает, что этот ген является прекрасным маркером ранних палочковидных фоторецепторов, подобно Blimp1. Будущие эксперименты определят его специфичность и выяснят, играет ли Epha8 функциональную роль в развитии сетчатки.

Анализ микромассивов одиночных клеток и гибридизация in situ диссоциированных клеток сетчатки с одновременным использованием зондов для двух генов, выявил, вновь возникшие постмитотические ретинальные клетки совместно экспрессируют гены маркеров амакринных и палочковидных клеток. Этот результат согласуется с идеей, что клетки могут проходить через пластическую фазу вскоре после выхода из клеточного цикла, во время которой они могут экспрессировать гены маркеры разных типов клеток. Альтернативно, совместная экспрессия маркеров двух типов клеток может указывать, что определенные локусы де-репрессируются, независимо от того, являются ли клетки всё ещё достаточно пластичными, чтобы выбрать более одной клеточной судьбы. Важно отметить, что совместная экспрессия маркеров палочковидных и амакринных клеток, по-видимому, не является артефактом метода профилирования одиночных клеток. Лишь определенные гены ко-экспрессируются и они те же самые, обнаруживаемые во множественных клетках. Если, напр., ко-экспрессия, результат загрязнения препаратов РНК одиночной клетки РНК из др. клетки, то следовало ожидать случайных паттернов ко-экспрессии, в противоположность генам, обнаруживаемых в таких профилях. Кроме того, многие клетки, которые выглядят более зрелыми, обладают более высокими уровнями специфических генов и что классификационные оценки, указывающие на более определенную судьбу, не ко-экспрессируют генов двух клеточных типов (Fig. 2).

Остается неясным, что за популяция клеток представлена клетками, которые ко-экспрессируют эти маркеры. Если большинство RPCs детерминировано давать стереотипическое потомство, совместная экспрессия генов амакринных и палочковидных клеток происходит в RPCs, которые будут давать палочковидные и амакринные клетки, затем только немногие одиночные клетки будут совместно экспрессировать гены маркеры амакринных и палочковидных клеток. Это предсказание базируется на данных Young's birthdating, поскольку амакринные клетки составляют лишь небольшой процент (1-2%) от потомства P0 RPC (Young, 1985b). Однако, большинство профилированных WT клеток в данном исследовании совместно экспрессируют гены маркеры амакринных и палочковидных клеток. Если существуют детерминированные субнаборы RPCs, которые продуцируют палочковидные и амакринные клетки, палочковидные и биполярные клетки или палочковидные и и клетки Мюллеровой глии, то одиночные клетки, совместно экспрессирующие гены палочковидных и биполярных клеток, также как и одиночные клетки, ко-экспрессирующие гены палочковидных и Мюллеровых клеток, следует ожидать. Фактически, гены Мюллеровой глии экспрессируются в большинстве P0 RPCs, хотя лишь небольшой процент потомства постнатальных RPCs (<10%) будет клетками Мюллеровой глии (Young, 1985b; Blackshaw et al., 2004; Roesch et al., 2008; Trimarchi et al., 2008). Одиночные WT клетки совместно экспрессируют гены маркеры, общие поздним RPCs и клеткам Мюллеровой глии, но не гены маркеры, эксклюзивные для клеток Мюллеровой глии. Кроме того, одиночные клетки не экспрессируют большинство известных маркеров биполярных клеток, это, скорее всего, из-за того, что эти гены не экспрессируются раньше ст. P3 (Kim et al., 2008). Может существовать активная репрессия большинства биполярных генов как результат активности Blimp1, который экспрессируется в этих клетках и, как было установлено, ингибирует судьбу биполярных клеток, скорее всего, посредством Chx10-обеспечиваемой репрессии (Brzezinski et al., 2010; Katoh et al., 2010). Такая репрессия может быть преходящей, т.к. экспрессия Blimp1 спадает позднее в течение первой постнатальной недели, когда многие биполярные клетки зарождаются и/или начинают дифференцироваться (Young, 1985b; Kim et al., 2008). Не смотря на это, однако, обнаруживается экспрессия Gnb3, биполярного гена в зрелой сетчатке, в большинстве N1-CKO клеток. Необходим дальнейший анализ этих генетических взаимоотношений, чтобы понять, как эти клетки выбирают свои судьбы и понять смысл совместной экспрессии генов маркеров двух разных типов клеток.

Интригующая возможность заключается в том, что совместная экспрессия разных генов маркеров представляет собой пластическую стадию, во время которой клетки переходят после выхода из клеточного цикла, когда они приобретают свои качественные особенности. Хотя только что возникшие постмитотические клетки, скорее всего, воспринимают факторы, детерминирующие судьбу, от клеток предшественников, на сегодня неизвестно, происходит ли детерминация клеточной судьбы в делящихся клетках предшественниках или в их постмитотических дочерних клетках. Интересно, что удаление Notch1 из только что возникших постмитотических клеток ведет к избыточной продукции палочек за счет др. типов клеток на постнатальной стадии, демонстрируя, что данные от этих сигнальных путей необходимы для спецификации судеб не-палочек даже после выхода из клеточного цикла (Mizeracka et al., 2013). Итак, данные микромассивов подкрепляют идею , что новые постмитотические клетки не заключают в себе выбора своей судьбы и что приобретение судьбы в не-палочковидные клетки является Notch1-зависимым процессом, которые может происходить в течение нескольких дней.