Посещений:
РАЗВИТИЕ СЕТЧАТКИ

Роль Lhx1 и Lhx5

The expression of LIM-homeobox genes, Lhx1 and Lhx5, in the forebrain is essential for neural retina differentiation
Junji Inoue, Yuuki Ueda, Tetsuya Bando, Taro Mito, Sumihare Noji, Hideyo Ohuchi
Development, Growth & Differentiation 2013. Volume 55, Issue 7, pages 668–675

Elucidating the mechanisms underlying eye development is essential for advancing the medical treatment of eye-related disorders. The primordium of the eye is an optic vesicle (OV), which has a dual potential for generation of the developing neural retina and retinal pigment epithelium. However, the factors that regulate the differentiation of the retinal primordium remain unclear. We have previously shown that overexpression of Lhx1 and Lhx5, members of the LIM-homeobox genes, induced the formation of a second neural retina from the presumptive pigmented retina of the OV. However, the precise timing of Lhx1 expression required for neural retina differentiation has not been clarified. Moreover, RNA interference of Lhx5 has not been previously reported. Here, using a modified electroporation method, we show that, Lhx1 expression in the forebrain around stage 8 is required for neural retina formation. In addition, we have succeeded in the knockdown of Lhx5 expression, resulting in conversion of the neural retina region to a pigment vesicle-like tissue, which indicates that Lhx5 is also required for neural retina differentiation, which correlates temporally with the activity of Lhx1. These results suggest that Lhx1 and Lhx5 in the forebrain regulate neural retina differentiation by suppressing the development of the retinal pigment epithelium, before the formation of the OV.


Рисунки к статье

Понимание детальных механизмов развития сетчатки важно для лечения болезней сетчатки, включая образование слоёв сетчатки (Eiraku et al. 2011). Глаза возникают из двухсторонних выпячиваний переднего мозга, наз. optic vesicle (OV). Постепенно дистальная часть OV начинает инвагинировать, чтобы сформировать оптический бокал с двумя слоями. Эти внутренний и наружный слои развиваются в нервную ткань, включая neural retina (NR) retinal pigmented epithelium (RPE) (Chow & Lang 2001).
Дифференцировка RPE зависит от воздействия внеклеточных сигналов, таких как молекулы transforming growth factor (TGF)-β, включая activin и bone morphogenetic proteins (BMPs), из периокулярной мезенхимы (Hyer et al. 1998; Fuhrmann et al. 2000; Muller et al. 2007). Эти сигналы, как полагают, способствуют спецификации RPE путем индукции экспрессии microphthalmia-associated transcription factor (Mitf), который участвует в приобретении и поддержании качественных особенностей RPE (Martinez-Morales et al. 2004; Horsford et al. 2005). Одновременно, Otx2, который индуцируется с помощью Mitf, также необходим для спецификации RPE (Crossley et al. 2001; Martinez-Morales et al. 2001; Martinez-Morales et al. 2003). Кроме того, поверхностная эктодерма, которая граничит с OV, продуцирует некоторые количества сигналов fibroblast growth factor (FGF), которые наделяют проспективными NR характеристиками дистальную область OV (Pittack et al. 1997; Hyer et al. 1998; Nguyen & Arnheiter 2000; Chow & Lang 2001; Kurose et al. 2004; Kurose et al. 2005). FGF сигналы затем усиливают активность экспрессии гена Chx10, который репрессирует Mitf и индуцирует NR к тому, чтобы она подверглась нормальной спецификации в типы ретинальных клеток (McFarlane et al. 1998; Nguyen & Arnheiter 2000; Vogel-Hopker et al. 2000; Rowan et al. 2004; Horsford et al. 2005; Martinez-Morales et al. 2005). Взаимодействие между Mitf и Chx10 обеспечивает различия между NR и RPE (Muller et al. 2007).
В данном исследовании мы сфокусировались на LIM классе гомеодоменовых транскрипционных факторов, Lhx1 и Lhx5 (Fujii et al. 1994; Tsuchida et al. 1994; Sun et al. 2008) . Ранее нами было показано, что Lhx1 и Lhx5 экспрессируются в пограничной области между передним мозгом и оптическими пузырьками, тогда как исследования по избыточной экспрессии подтвердили, что Lhx1 и Lhx5 способствуют развитию NR (Kawaue et al. 2012). Однако, фенотипы RNA interference (RNAi) в отношении Lhx1 оказались противоречащими и точное время экспрессии Lhx1, необходимое для дифференцировки нейральной сетчатки не прояснилось. Более того, RNAi для Lhx5 ранее не было осуществлено. Здесь мы продемонстрировали, что новый метод электропортации, с помощью которого можно вносить больше RNAi векторов ДНК в эмбрион, обеспечивает тем самым устойчивый эффект молчания Lhx1/Lhx5. Мы установили, что замалчивание экспрессии Lhx5, самое раннее на ст. Hamburger and Hamilton's (HH) 8, ингибирует образование NR, приводя к превращению региона NR в пигментную пузырек-подобную ткань.

Discussion


Lhx1 и Lhx5 являются LIM-гомеодоменовыми (LIM-HD) транскрипционными факторами (Taira et al. 1994; Shawlot & Behringer 1995; Hobert & Westphal 2000; Poche et al. 2007; Suga et al. 2009). Ранее мы показали, что LIN-11 класс LIM-HD факторов, Lhx1 и Lhx5 может индуцировать экспрессию маркеров дифференцировки NR и индуцировать возникающие клетки OV для образования NR (Kawaue et al. 2012). В данном исследовании, после Lhx1-RNAi или Lhx5-RNAi, наблюдаются фенотипы маленьких глаз на оперированной стороне. Кроме того, эти маленькие глаза сильно пигментированы по сравнению с лазом противоположной стороны. Гистологический анализ выявил, что область NR после Lhx1-RNAi имеет единичный слой пигментной сетчатки, который отличается от нормальной NR. Напротив, NR область после Lhx5-RNAi всё ещё выглядит как псевдо мультислойная сетчатка с пигментацией. Мы проверяли, превращает ли Lhx1 или Lhx5 RNAi качественные характеристики клеток NR в клетки с судьбой RPE, использовав маркер нейрональной дифференцировки Sox2 и HuC/D (Marusich et al. 1994; Hyer et al. 1998; Taranova et al. 2006;Ishii et al. 2009), и маркер дифференцировки RPE Otx2 (Crossley et al. 2001; Martinez-Morales et al. 2003; Nishihara et al. 2012). В глазах после RNAi, не выявлено ни Sox2, ни HuC/D белка в аутентичном NR регионе. Более того, Lhx1-RNAi индуцирует экспрессию Otx2. По сравнению с Lhx1-RNAi, минорный Otx2 белок обнаруживается в NR регионе после Lhx5-RNAi.

The earlier manipulation of embryos, a new electroporator and effective electrode placement enhanced the efficiency of in ovo RNAi


Исходя из паттернов начала и доменов экспрессии Lhx1 и Lhx5 (Kawaue et al. 2012), мы определили, что помещение анода диагонально катоду и осуществление электропортации как можно ранее на ст. HH 8 является оптимальным для супрессии экспрессии Lhx1 или Lhx5 (Fig. 1). Кроме того, современный electroporator с мульти-пульсовыми паттернами делает возможным более эффективное введение ДНК в эмбриональные клетки кур. Это показывает, что экспрессия Lhx1 в проспективной области переднего мозга может контролировать дифференцировку NR на ст. HH 8. Однако экспрессия Lhx1 после ст. HH 9 оказывает меньшее воздействие на дифференцировку NR.

Lhx5 patterns the NR before OV development


LIM-гомеобоксный ген Lhx5 играет роль в спецификации архитектуры переднего мозга (Sheng et al. 1997) и может способствовать нейрональной дифференцировке (Zhao et al. 1999). Поэтому мы сделали попытку определить, действительно ли Lhx5 играет роль в дифференцировке NR. В предыдущих сообщениях мы описали паттерн экспрессии Lhx5 (Kawaue et al. 2012). Базируясь на этих данных, мы осуществляли Lhx5-RNAi с помощью электропортации в тех же самых условиях, что и Lhx1-RNAi. Спустя 96 ч после электропортации, большинство эмбрионов имело маленькие глаза с избыточной пигментацией, как это обнаруживалось и при Lhx1-RNAi; однако морфология и характеристики маленьких глаз отличались от тех, что наблюдались у Lhx1-RNAi эмбрионов. В NR регионе Sox2 и HuC/D белки исчезали, но сетчатка не становилась однослойным пигментированным эпителием; однако псевдо многослойная сетчатка была видна в нейроэпителии. Более того, эктопический Otx2 белок обнаруживался только по периферии сетчатки. Мы полагаем, что это из-за того, что домен экспрессии Lhx5 крупнее, чем таковой Lhx1. Следовательно, Lhx5-RNAi может не обеспечивать эффект полного замалчивания как в случае Lhx1-RNAi и это, скорее всего, частично снижает экспрессию Lhx5 и может не приводить к полностью индуцированной дифференцировке NR. Вместо этого, остаточная мРНК Lhx5 может противодействовать действию внеглазной мезенхимы, которая формирует паттерн RPE (Fuhrmann et al. 2000). Хотя Lhx5-RNAi может быть в дальнейшем оптимизирован, это первое сообщение описывает, что нормальный уровень экспрессии Lhx5 в переднем мозге необходим для развития NR зрительного зачатка.

Concluding remarks


Мы показали, что экспрессия Lhx1 и Lhx5 необходима для спецификации домена нейральной сетчатки в зрительном пузырьке. Поскольку Lhx1 индуцируется с помощью Lhx5 (Kawaue et al. 2012), то вполне понятно, что исход воздействия Lhx5-RNAi д. быть сходным с таковым Lhx1-RNAi. Возможно, что Lhx5 и Lhx1 влияют на дифференцировку NR путем индукции экспрессии диффундирующих факторов, таких как FGF (Vogel-Hopker et al. 2000; Martinez-Morales et al. 2005; Okamoto et al. 2009) и Wnt (Holliday et al. 1997). Впоследствии эти медиаторы могут индуцировать экспрессию ранних нейрональных транскрипционных факторов, таких как Sox2 и Chx10 (Pittack et al. 1997; Zhao et al. 2001; Taranova et al. 2006). Одновременно, RPE-специфические транскрипционные факторы, такие как Otx2 и Mitf, индуцируются с помощью TGF-β-подобных сигналов из внеглазной мезенхимы. В нормальном развитии глаз Chx10 и Mitf репрессируют любую др. экспрессию (Fuhrmann et al. 2000). Мы подтвердили, что Lhx5 необходим для развития NR и что уровень экспрессии Lhx5, необходимый для индукции дифференцировки NR более высокий, чем уровень ингибирования дифференцировки RPE. Однако диффундирующие медиаторы, которые обеспечивают связь между Lhx5/Lhx1 транскрипционными факторами и развитием NR пока неизвестны.