Нейральная сетчатка (NR) позвоночных представлена 6 принципиальными типами нейронов и клетками Мюллеровой глии. Во время развития клетки сетчатки генерируются из мультипотентных предшественников, которые инструктированы с помощью как внутренних, так и внешних факторов, чтобы формировать корректные типы и пропорции клеток. В ходе нейрогенеза дифференциальная экспрессия транскрипционных факторов является определяющим свойством для развивающихся клеток сетчатки, т.к. она они действуют во время детерминации клеточных судеб и терминальной дифференцировки (Livesey and Cepko,2001). Амакринные и горизонтальные клетки являются промежуточными нейронами сетчатки с тонко связанными путями развития (Poche and Reese,2009). Тела горизонтальных клеток располагаются в самом внутреннем ядерном слое (INL) и составляют только 3% от INL клеток у мышей (Jeon et al.,1998). Амакринные клетки, очень разнообразный класс с приблизительно 30 морфологически отличающимися подтипами, обнаруживаются во внутренней части INL, а также в слое ганглиолярных клеток (GCL), и в сетчатке мыши составляют приблизительно 40% клеток обоих этих слоёв (Jeon et al.,1998; MacNeil et al.,1999). Почти все амакринные клетки содержат или γ-aminobutyric acid (GABA) или glycine, ингибирующие нейротрансмиттеры, и ряд дополнительных нейротрасмиттеров и нейропептидов, расположенных в GABAergic амакринных клетках (Vaney,1990; Lam,1997).

Исследования по избыточности и недостаточности функции на разных животных моделях выявили ключевые факторы в транскрипционной иерархии, регулирующей развитие амакринных и горизонтальных клеток. Напр., Foxn4 необходим для генерации всех горизонтальных клеток и большинства амакринных клеток и располагается на вершине иерархии, активируя экспрессию нижестоящих факторов Math3 (Neurod4), NeuroD (Neurod1) и Ptf1a (Li et al.,2004; Fujitani et al.,2006). Math3/NeuroD двойные нокаутные (KO) мыши обнаруживают тяжелую потерю амакринных клеток, как это делают Ptf1a-нулевые мыши (Inoue et al.,2002; Fujitani et al.,2006; Nakhai et al.,2007). В горизонтальных клетках веточки пути Ptf1a позитивно регулируют экспрессию Prox1, который специфически необходим для генеза горизонтальных клеток, и Lim1 (Lhx1), который необходим для миграции и дифференцировки горизонтальных клеток (Dyer et al.,2003; Fujitani et al.,2006; Poche et al.,2007). Позиционирование и морфология горизонтальных клеток сходным образом повреждаются при потере транскрипционного фактора цинковые пальчики Sall3, который необходим для поддержания экспрессии LIM1 в горизонтальных клетках (de Melo et al.,2011). Нижестоящие гены спецификации ранних амакринных клеток, дополнительные факторы, включая Barhl2, Bhlhb5 (Bhlhe22) и Isl1, регулируют развитие амакринных субпопуляций (Feng et al.,2006; Elshatory et al.,2007b; Ding et al.,2009). Хотя многое известно о ранних регуляторах спецификации клеток сетчатки, ретиногенез не завершается после генерации этих типов клеток сетчатки и главные регуляторы, контролирующие последующее образование слоёв и мозаичное распределение популяций клеток сетчатки, неизвестны.

Транскрипционные факторы activating protein-2 (AP-2) являются онтогенетически важным семейством генов, которые, как было установлено, играют важные роли в развитии глаз (West-Mays et al.,1999; Dwivedi et al.,2005; Pontoriero et al.,2008; Bassett et al.,2010). Сегодня семейство включает 5 членов, наз. Tcfap2a - Tcfap2e (кодирующих AP-2α, β, γ, δ, ε) у мышей (Eckert et al.,2005). Ранее мы показали, что белки AP-2α и AP-2β экспрессируются в развивающихся и зрелых амакринных клетках сетчатки мышей в INL и GCL и мы также выявили транскрипты Tcfap2c (AP-2γ) и Tcfap2d (AP-2d δ) в эмбриональной и взрослой сетчатке мышей (Bassett et al.,2007). Tcfap2c, по-видимому, экспрессируется в виде паттерна, сходного с таковым Tcfap2a и Tcfap2b, тогда как Tcfap2d, наиболее дивергентный член семейства AP-2, был в основном ограничен GCL (Bassett et al.,2007). Сходным образом, в развивающейся сетчатке кур AP-2d δ экспрессируется в субнаборе ганглиолярных клеток и не обнаруживает перекрывания с экспрессией AP-2α и AP-2β (Bisgrove and Godbout,1999; Li et al.,2008).

Чтобы исследовать потенциальную прирожденную роль AP-2α в ретиногенезе, мы ранее получили вызываемые условиями KO Tcfap2a в развивающейся сетчатке ("Re-AP-2α" mice; Bassett et al.,2007). У Re-AP-2α мышей, не обнаруживаются очевидные дефекты сетчатки, это указывает на то, что сам по себе AP-2α не является в действительности обязательным для развития NR. Мы пришли к выводу, что потеря AP-2α может компенсироваться др. членами семейства AP-2, наиболее вероятными кандидатами являются AP-2β и/или AP-2γ. Причиной данного исследования стало изучение потенциально излишней роли Tcfap2a, Tcfap2b и Tcfap2c в развитии NR, с помощью детального анализа экспрессии и генерации двойных Tcfap2a/b мутантных модельных мышей, которых изучали вплоть до гибели на постнатальный день 0 (P0). Мы показали, что помимо амакринных клеток, AP-2α и AP-2β также ко-экспрессируются в развивающихся горизонтальных клетках. Экспрессия AP-2γ является ограничивающим фактором, который частично отличается от AP-2alpha; /β -иммунопозитивной популяции. Tcfap2a/b-дефицитная сетчатка обнаруживает дефекты как амакринных, так и горизонтальных клеток, которые не выявляются после делеции каждого из членов семейства в отдельности, демонстрируя тем самым критическую роль активности AP-2 в развитии этих типов клеток.

Discussion

Транскрипционные факторы AP-2 возникают в качестве ключевых регуляторов морфогенеза глаз у некоторых видов, включая человека (Gestri et al.,2009; Dumitrescu et al.,2011; Milunsky et al.,2011). В данной работе мы исследовали роль множественных членов семейства AP-2 в нейрогенезе сетчатки мышей и установили важность их для амакринных и горизонтальных клеточных клонов. Мы показали, что AP-2α и AP-2β обнаруживают сильно перекрывающийся паттерн экспрессии в постмитотических амакринных и горизонтальных клетках. Экспрессия AP-2γ выявлена в развивающихся и зрелых амакринных клетках в популяции, которая только частично перекрывается с клетками, экспрессирующими AP-2^-/- клетками. Делеция как Tcfap2a, так и Tcfap2b из развивающейся сетчатки вызывала поразительную потерю горизонтальных клеток и дефектное развитие горизонтальных и амакринных клеток.

Expression Patterns of AP-2 Proteins in Amacrine and Horizontal Cells

Предыдущие исследования на мышах и курах показали, что 4 из 5 известных членов семейства AP-2 (AP-2α, AP-2β, AP-2γ и AP-2d δ) экспрессируются в развивающейся сетчатке и что три из них (AP-2α, AP-2β и AP-2γ) присутствуют в типах клеток в INL, тогда как AP-2d δ ограничивается RGCs (Bisgrove and Godbout,1999; Zhao et al.,2003; Bassett et al.,2007; Trimarchi et al.,2007; Li et al.,2008). Мы выяснили паттерны экспрессии AP-2α и AP-2β в горизонтальных клетках сетчатки мышей (Figs. 1, 2). Хотя оба члена семейства экспрессируются в развивающихся горизонтальных клетках, но экспрессия AP-2α снижается вскоре после рождения и только белок AP-2β сохраняется в зрелых горизонтальных клетках, находка, которая совпадает с данными по сетчатке кур (Bisgrove and Godbout,1999; Edqvist et al.,2008). Мы также показали, что в развивающейся и взрослой сетчатке, значительно выше пропорция клеток, совместно меченных по AP-2α и AP-2β по сравнению с клетками меченными в отдельности AP-2α или AP-2β (Fig. 2), демонстрируя тем самым их существенное перекрывание и поддерживающую компенсацию одного белка другим. Недавно были исследованы паттерны экспрессии TFAP2A и TFAP2B в плодной и зрелой сетчатке человека, они сильно напоминали таковые в сетчатках кур и мышей (Li et al.,2010). Т.о., AP-2α и AP-2β являются ключевыми маркерами амакринных и горизонтальных клеток в сетчатке птиц и млекопитающих и они обнаруживают перекрывающиеся роли в развитии обоих типов клеток.

Наш анализ пространственно-временной экспрессии белка AP-2γ в развивающейся сетчатке мышей показал, что подобно AP-2α и AP-2β, этот член семейства экспрессируется в постмитотических амакринных клетках GABAergic и glycinergic классов (Figs. 3, 4). Поскольку огромное большинство клеток, экспрессирующих какой-либо из этих трех членов семейства AP-2, были Ki67-негативными (Supp. Fig. S1A), то Ki67 иммунореактивность была обнаружена в очень небольшом проценте AP-2-позитивных клеток. Однако низкие уровни белка Ki67 были описаны в молчащих клетках (Bullwinkel et al.,2006) и наши данные должны отражать присутствие Ki67, вообще-то временно, в постмитотических AP-2-позитивных нейронах. В отличие от AP-2α и AP-2β, экспрессия AP-2γ инициируется позднее и не является маркером развивающихся горизонтальных клеток (Fig. 3). Мы отметили, что клетки, экспрессирующие AP-2γ не образуют обычной полосы в развивающемся INL вплоть до ст. позднего эмбриогенеза, а значительная пропорция AP-2γ-иммунопозитивных амакринных предшественников разбросана в наружном слое нейробластов на ранних постнатальных стадиях. Этот паттерн экспрессии, в комбинации с поздним началом экспрессии AP-2γ, подтверждает, что он может экспрессироваться в поздно зарождающихся амакринных клетках по сравнению с AP-2α и AP-2β. Эта идея подтверждается недавними доказательствами, показавшими, что финальная позиция тел амакринных клеток коррелирует с датой рождения, зародившиеся самыми ранними амакринные клетки (такие как cholinergic подтип) располагаются в GCL или внутренней части INL, тогда как поздно зарождающиеся амакринные клетки обнаруживаются более в направлении наружной части сетчатки (Voinescu et al.,2009). В согласии с этой находкой, AP-2γ не был обнаружен в рано зарождающихся cholinergic амакринных клетках, тогда как AP-2α и AP-2β экспрессировались именно в этом подтипе (Fig. 4). Двойное иммуномечение с помощью анти-AP-2γ и анти-AP-2β (Fig. 5) также подчеркивает тот факт, что AP-2γ-позитивные амакринные клктки частично отличаются от пространно расположенной AP-2α/β-позитивной популяции, особенно во взрослой сетчатке, где менее 4% AP-2γ и/или AP-2β-позитивных популяций перекрываются (Fig. 5). Этот результат подтверждается изучением профилей генной экспрессии, которые были получены от индивидуальных развивающихся клеток сетчатки. Из 6 профилированных амакринных клеток все экспрессировали Tcfap2b, пять экспрессировали Tcfap2a, и только одна экспрессировала Tcfap2c (Trimarchi et al.,2007).

Requirement for Tcfap2a/b in Horizontal Cell Development

Мы показали здесь, что подобно AP-2α, AP-2β экспрессируется в постмитотических переходных клетках во время ретиногенеза (Fig. 1). Паттерны пространственной и временной экспрессии AP-2α и AP-2β хорошо скоррелированы с дифференцировкой амакринных и горизонтальных клеток (Young,1985). В противоположность амакринным клеткам, которые безусловно присутствуют в мутантной Tcfap2a/b сетчатке, горизонтальные клетки теряются (Fig. 7). Мы оказались неспособны выявить экспрессию некоторых маркеров горизонтальных клеток, включая ранние маркеры LIM1 и PROX1. Мы заподозрили, что редкое появление LIM1-позитивных горизонтальных клеток в периферических частях сетчатки мутантов Tcfap2a/b может быть результатом не полной обусловленной Cre эксцизии Tcfap2a, это подтверждается тем фактом, что мы обнаружили горизонтальные клетки в центральной части сетчатки у мутантов Tcfap2a/b, где активность α-Cre уменьшена (Supp. Fig. S3). Мы также обнаружили LIM1-позитивные клетки в сетчатке эмбрионов в отсутствие интактного аллеля Tcfap2b и в присутствии телько одного интактного аллеля Tcfap2a или в отсутствии интактных аллелей Tcfap2a и в присутствии только одного интактного аллеля Tcfap2b (not shown). Следовательно, одиночная функциональная копия Tcfap2a или Tcfap2b, по-видимому, до некоторой степени восстанавливает горизонтальные клетки. Итак, эти результаты подтверждают, что Tcfap2a и Tcfap2b необходимы для детерминации или поддержания всей популяции горизонтальных клеток. Причина, лежащая в основе отсутствия горизонтальных клеток в Tcfap2a/b мутантной сетчатке неизвестна. Принимая во внимание, что горизонтальные клетки составляют лишь приблизительно 0.2% от всех клеток сетчатки у мышей (Ajioka et al.,2007), трудно установить или эти клетки принимают альтернативную судьтбу или первоначально генерируются, но быстро гибнут в результате апоптоза. Учитывая их экспрессию в постмитотических клетках, мы склоняемся к идее, что AP-2 белки не участвуют в детерминации судеб клеток сетчатки, а скорее участвуют в их дифференцировке или жизнеспособности. Специфическая роль AP-2α/β в развитии горизонтальных клеток может быть прояснена в экспериментах с Tcfap2a/b-нулевыми клетками, а также в исследованиях с избыточной функцией.

Impaired Amacrine Cell Development in Tcfap2a/b-Deficient Retinas

Tcfap2a и Tcfap2b экспрессируются в glycinergic и GABAergic амакринных клетках и также совместно экспрессируются с маркерами многих др. меньших субпопуляций амакринных клеток, включая cholinergic (ISL1-позитивные, SOX2-позитивные), NR4A2-позитивные, CALB2-позитивные и AII (DAB1-позитивные амакринные клетки (Bassett et al.,2007; Trimarchi et al.,2007; Cherry et al.,2009). В отличие от концентрирующихся в вентрикулярной половине эмбриональной сетчатки, подобно ранним факторам детерминации амакринных клеток, таким как FOXN4 или PTF1A (Li et al.,2004; Fujitani et al.,2006), AP-2α и AP-2β скорее экспрессируются во вновь сгенерированных амакринных переходных клетках, когда они приближаются к презумптивному INL, и оба белка сохраняются в амакринных клетках в течение всего постнатального развития и у взрослых. Перед их гибелью на ст. P0, мы оценивали разные популяции амакринных клеток у Tcfap2a/b мутантов и ограничились более рано рождающимися GABAergic типами. мы отметили измененные паттерны окрашивания ранних GABAergic маркера BHLHB5, холинэргических (ISL1, SOX2) маркеров и AP-2? (Fig. 8). Эти измененные паттерны окрашивания демонстрируют аномальное расположение амакринных клеток, подтверждая, что миграция и последующее мозаичное образование могут меняться при потере AP-2. Мутанты Tcfap2a/b погибают приблизительно на ст. P0, и в этой ранней временной точке мы были неспособны определить, меняются ли достоверно количества BHLHB5-позитивных и AP-2?-позитивных амакринных клеток у мутантов по сравнению с контролем (data not shown). В конечном итоге генерация специфичных для сетчатки кондиционных Tcfap2a/b-дефицитных модельных мышей, которые выживают после рождения позволит исследовать финальное значение делеции Tcfap2a/b на дифференцировку и количества амакринных клеток и определить, может ли потеря Tcfap2a/b постоянно влиять на морфологию и/или расположение амакринных клеток или возможно задерживать дифференцировку.

AP-2 and Neural Development

Хотя все пять членов семейства AP-2 экспрессируются в специфических регионах эмбриональной ЦНС, их прирожденные роли в развитии тканей, происходящих из нейроэктодермы изучены недостаточно. In vitro исследования показали, что трансфекция нейроэктодермальных клеток c помощью Tcfap2a, или клеток нервного гребня c помощью Tcfap2b, вызывает дифференцировку нейронов (Paggi et al.,2001; Hong et al.,2008). Tcfap2a,как было установлено, регулирует миграцию gonadotropin-releasing hormone нейронов (Orso et al.,2009), которые подвергаются активным перемещениям от носовой плакоды в гипоталамус во время развития (Cariboni et al.,2007). Данная работа дополняет ограниченное число исследований in vivo, которые выявили клеточно автономную роль для AP-2 в нейрогенезе ЦНС млекопитающих (Hong et al.,2008; Feng et al.,2009; Pinto et al.,2009; Hesse et al.,2011; Schmidt et al.,2011). В нервной ткани, где экспрессия и функция AP-2 белков была изучена в деталях, они оказались не широко распространенными, а скорее обнаруживали специфическую для типов клеток экспрессию в ограниченных субнаборах нервных предшественников или в постмитотических развивающихся нейронах. Сюда включена экспрессия AP-2α, AP-2β и AP-2γ в клоне амакринных и горизонтальных клеток сетчатки, AP-2γ экспрессия в апикальных (радиальная глия) предшественниках коры головного мозга (Pinto et al.,2009), и экспрессия AP-2ε в выходных нейронах (митральные и tufted клетки) обонятельных луковиц (Feng et al.,2009). В регионах головного мозга и обонятельных луковиц белки AP-2 необходимы для управления формированием или дифференцировкой определенных типов нейронов, тем самым наделяя нейроны качественными особенностями или нижестоящими характеристиками, такими как правильные морфология или расположение. Сюда входит и потребность в AP-2γ для спецификации базальных предшественников из апикальных предшественников (и последующей продукции слоёв II/III пирамидальных нейронов) в зрительной коре (Pinto et al.,2009) и роль AP-2ε в упорядочивании и выростах дендритов выходных нейронов обонятельных луковиц (Feng et al.,2009). В добавок к этим исследованиям AP-2α и AP-2β были также замечены своим участием в развитии норадренергических нейронов в заднем мозге мышей и рыбок данио (Holzschuh et al.,2003; Hong et al.,2008), а AP-2d δ необходим для выживания клеток задней части среднего мозга (Hesse et al.,2011). Более того, функциональное перекрывание членов семейства AP-2 недавно было описано в развивающейся периферической нервной системе, где AP-2α и AP-2β выполняют частично перекрывающиеся роли в выживании симпатических нейронов,происходящих из нервного гребня (Schmidt et al.,2011). Принимая во внимание раннюю гибель, ассоциированную с потерей трех AP-2 генов, изученных в данной работе (Schorle et al.,1996; Zhang et al.,1996; Moser et al.,1997; Auman et al.,2002; Werling and Schorle,2002), тканеспецифические нокаутные мыши могут предоставить способ для изучения онтогенетических ролей членов семейства Tcfap2 в определенных регионах нервной системы in vivo и было бы интересно сравнить их функции в сетчатке с функциями в лр. нервных тканях.

Это исследование предоставило информацию о роли Tcfap2a, Tcfap2b и Tcfap2c в ретиногенезе, выявив их перекрывающиеся и уникальные паттерны экспрессии в развитии популяций амакринных и горизонтальных клеток и выявив избыточную потребность в Tcfap2a и Tcfap2b в развитии амакринных и горизонтальных клеток. В будущих исследованиях важно будет изучить результаты избыточности функции Tcfap2 в сетчатке, а также значение делеции Tcfap2c в сетчатке или в отдельности или в комбинации с др. членами семейства AP-2. Было бы также важно расширить исследования избыточности AP-2α и AP-2β в постнатальный период, чтобы проанализировать морфологию, расположение и размеры популяций спектра подтипов амакринных клеток, а также оценить зрительную функцию. Несмотря на это наше данное исследование продемонстрировало, что транскрипционные факторы AP-2 необходимы для специфических аспектов нейрогенеза сетчатки, расширив их роль как регуляторных молекул в отношении как глазного, так и нейрального развития.