miRNAs CONFER ROBUSTNESS TO DEVELOPMENTAL AND PHYSIOLOGICAL PROCESSES

Feedback and Feedforward Loops Provide Biological Robustness

Удивительным свойством онтогенетических и физиологических процессов является то, что они чрезвычайно воспроизводимы, даже в условиях генетической в внешнесредовой изменчивости (Barkai and Shilo,2007; Herranz and Cohen,2010). Биологическая устойчивость к нарушениям исходных предпосылок (robustness) является собственно врожденной у всех живущих организмов, это обеспечивает стабильность. Концепция биологической устойчивости означает способность биологических систем сохранять свои функции несмотря на эндогенные и экзогенные пертурбации (Kitano,2004; Silva-Rocha and de Lorenzo,2010). Следует подчеркнуть, что robustness не только влияет на способность системы амортизировать (buffer) пертурбации для поддержания фенотипической стабильности, но и также вносит вклад в достижение предсказуемых и воспроизводимых ответов, делая возможными фенотипические переключения эффективными независимо от пертурбаций (Freeman,2000; Kitano,2004; Ebert and Sharp,2012). Если принять во внимание биологические системы, то шумы или вариации могут иметь разные источники, включая стохастические изменения в экспрессии генов (напр., в транскрипции, трансляции и деградации РНК или белка), а также внешнесредовые флюктуации (Raser and O'Shea,2005).

Среди механизмов объясняющих устойчивость биологических сетей в присутствии петель обратных и упреждающих петель (Freeman,2000; Hartman et al.,2001; Kitano,2004; Graham et al.,2010; Osella et al.,2011; Pelaez and Carthew,2012). Биоинформационный анализ показывает, что определенные петли или кругообороты (circuits), которые составляют сложные генные регуляторные сети, возникают более часто, чем ожидается на базе случайности; эти возвратные цепи были названы сетевыми мотивами ("network motifs"). Интересно, что петли обратной и упреждающей связи были найдены в качестве сетевых мотивов у разных организмов, от бактерий до человека (Milo et al.,2002; Shen-Orr et al.,2002; Alon,2007).

Обратная связь может быть определена как способность системы модифицировать свою реакцию путем мониторинга самой себя (Freeman,2000). В зависимости от общих признаков взаимодействий, петли обратной связи могут быть позитивными или негативными. Одиночная негативная обратная связь возникает, когда сигнал ограничивает сам себя путем индукции своего собственного ингибитора (Fig. 1A), и обычно она связана с ответами, вызывающими буфферизацию (Becskei and Serrano,2000; Freeman,2000). В обоюдных или двойных негативных петлях обратной связи сигнал репрессирует свой собственный репрессор (Fig. 1B), обеспечивая устойчивость (robustness) путем стабилизации экспрессии генов в одном состоянии, это может вносить вклад в бистабильность (Ebert and Sharp,2012; Pelaez and Carthew,2012). Позитивная обратная связь возникает, когда сигнал умножает самого себя или клеточную реакцию, которую он запускает (Fig. 1C), и обеспечивает robustness c помощью гарантии исхода типа "всё-или-ничего", часто приводя к бистабильной системе (Kitano,2004; Graham et al.,2010; Herranz and Cohen,2010).

Упреждающие (feedforward) петли состоят, по крайней мере, из трех элементов. Вышестоящий фактор регулирует ген мишенть посредством двух параллельных путей: один непосредственный и др. опосредованный. В непосредственном пути вышестоящий фактор регулирует третий компонент петли, который в свою очередь регулирует ген мишень (Fig. 1D,E). В зависимости от признаков двух путей, упреждающие петли могут быть подразделены на две категории: последовательные и непоследовательные петли. В последовательном паттерне свойство прямого пути то же самое, что и общее свойство опосредованного пути (Fig. 1D), тогда как при непоследовательной структуре свойства прямого и непрямого путей противоположны (Fig. 1E). Каждое из трех взаимодействий в упреждающих петлях может быть позитивным или негативным, что делает возможной 8 конфигураций (4 последовательные и 4 непоследовательные) (Mangan and Alon,2003). В самом деле, в зависимости от конфигурации, эти петли могут обладать разными свойствами и функциями, включая задержку или ускорение реакции и генерацию пульсо-подобной динамики (Mangan and Alon,2003; Alon,2007). Упреждающие петли могут обеспечивать устойчивость (robustness) посредством разных механизмов. Они могут глушить воздействие шумов на экспрессию гена мишени, усиливая тем самым устойчивость сети (Shen-Orr et al.,2002; Hornstein and Shomron,2006; Wu et al.,2009a; Osella et al.,2011). В непоследовательной упреждающей сети флюктуации вышестоящего фактора не связаны с финальным результатом активности гена мишени, поскольку промежуточный компонент непрямого пути петли будет компенсировать изменения входящего сигнала (Ebert and Sharp,2012). Т.о., лишь, когда вышестоящий фактор достигает определенных уровней, он будет индуцировать изменения в экспрессии гена мишени (Pelaez and Carthew,2012). Последовательные упреждающие петли могут также увеличивать устойчивость циркуита, активируя или ингибируя, чрезмерную экспрессию нижестоящего фактора (Ebert and Sharp,2012; Pelaez and Carthew,2012).

miRNA-Containing Circuits Contribute to the Robustness of Biological Systems

Геномный анализ выявил, обратные и упреждающие петли, которые содержат miRNAs также являются повторяющимися сетевыми мотивами в крупных сетях генов (Tsang et al.,2007; Martinez et al.,2008; Re et al.,2009), так что miRNAs могут обеспечивать биологическую устойчивость путем участия в этих петлях (Hornstein and Shomron,2006; Wu et al.,2009a; Herranz and Cohen,2010; Osella et al.,2011; Pelaez and Carthew,2012). miRNAs это небольшие (приблизительно в 22 нуклеотида) некодирующие однонитчатые РНК, которые регулируют экспрессию генов после транскрипции. Они обычно синтезируются c помощью RNA polymerase II, и затем подвергаются последовательным превращениям c помощью двух комплексов, содержащих Drosha и Dicer, чтобы быть в конечном итоге включенными в RNA-induced silencing complex (RISC). Зрелые miRNA позволяют RISC комплексу распознавать мишени мРНК благодаря комплементарности последовательностей, обычно обнаруживаемых в 3'-untranslated region (3'UTR) (Kim,2005; Yeom et al.,2006; Jaubert et al.,2007; Inui et al.,2010). Обычно miRNAs способствуют деградации и/или ингибированию трансляции своих мРНК мишеней (Djuranovic et al.,2011).

Становится всё более ясным, что зависимая от miRNA репрессия трансляции белка обычно сдержанная, с типичным снижением активности не более чем на 50% (Baek et al.,2008; Selbach et al.,2008). Более того, в целом нокаут индивидуальных miRNA животных не вызывает драматических фенотипических отклонений в контролируемых лабораторных условиях (Li and Carthew,2005; Miska et al.,2007; Li et al.,2009; Alvarez-Saavedra and Horvitz,2010). Это иногда обозначается как парадокс miRNAs: miRNAs обладают высокой степенью эволюционной консервации и пока большинство из них, по-видимому, не играют существенной роли в жизнеспособности клеток и организма. Интересно, что несмотря на эту кажущуюся нокаутную "очевидную нормальность" во многих случаях они обнаруживают важные фенотипические отклонения при определенных стрессовых условиях (van Rooij et al.,2007; Li et al.,2009; Leung and Sharp,2010; Mendell and Olson,2012).

Характерный пример miRNA , гарантирующий устойчивость во время развития Drosophila melanogaster, это miR-7, которая участвует во взаимосвязанных петлях образных и упреждающих связей, участвующих с дифференцировке фоторецепторов из из ретинальных клеток предшественников (Fig. 2) (O'Neill et al.,1994; Rebay and Rubin,1995; Gabay et al.,1996; Xu et al.,2000; Rohrbaugh et al.,2002; Li and Carthew,2005; Li et al.,2009). Эта сложная сеть была смоделирована математически, это позволило предсказать её поведение в качестве бистабильной системы (Graham et al.,2010). Удивительно при униформных лабораторных условиях мутантные по miR-7 мухи обнаруживали нормальную дифференцировку фоторецепторов, но если эти мутантные личинки подвергали действию флюктуирующих температурных условий, то обнаруживались аномалии дифференцировки фоторецепторов (Li et al.,2009; Pelaez and Carthew,2012). Следовательно, как вычислительные, так и экспериментальные доказательства подтверждают роль miR-7 в обеспечении устойчивости сети, которая контролирует дифференцировку клеток сетчатки.

Если полагать, что биологическая robustness обычно ассоциирована с фенотипической стабильностью, онтогенетические и физиологические реакции на стрессы также д. быть воспроизводимы и сильны. Далее мы обсудим регуляцию гипоксической реакции c помощью miRNAs. Мы покажем, что miRNAs участвуют в позитивной и негативной петлях обратной связи, а также в упреждающих петлях, которые, скорее всего, обеспечивают устойчивость транскрипционных ответов на гипоксию и ангиогенез как целостного процесса.

miRNAs PARTICIPATE IN NEGATIVE AND POSITIVE FEEDBACK LOOPS THAT REGULATE HIF-α EXPRESSION

Транскрипционная реакция на гипоксию в основном обеспечивается семейством транскрипционных факторов называемых hypoxia-inducible factors (HIF) (Maxwell et al.,1993; Wang and Semenza,1993,1995; Majmundar et al.,2010). HIF непосредственно регулируют экспрессию генов, участвующих в адаптации к гипоксии, снижению потребления кислорода и улучшению поставки кислорода в клетки путем модификации метаболизма, усиления эритропоэза, васкулогенеза, ангиогенеза и расширения сосудов помимо прочих механизмов (Semenza,2007; Lisy and Peet,2008). HIF является ?/? гетеродимером (Wang et al.,1995), в котором ? субъединица является постоянной, а ? субъединица негативно регулируется кислородом. Регуляция HIF-α осуществляется на разных уровнях, включая деградацию протеосом (Huang et al.,1998; Maxwell et al.,1999), рекрутирование транскрипционных коактиваторов (Hewitson et al.,2002; Lando et al.,2002) и субклеточную локализацию (Kallio et al.,1998).Регуляция стабильности HIF-α белка является наиболее важным механизмом контроля активности HIF. При нормоксии два prolyl остатка в HIF-α гидроксилируются в реакции, катализируемой c помощью специфической prolyl hydroxylases, обозначаемых PHD1, PHD2 и PHD3, которые используют молекулярный кислород и 2-oxoglutarate в качестве ко-субстрата и Fe(II) в качестве кофактора. После гидроксилирования, HIF-α полиубиквитинируется и деградирует на 26S протеосоме. Поскольку PHDs используют дикислрод в качестве ко-субстрата в каталитических реакциях, при гипоксии HIF-α не гидроксилируется, стабилизируется и накапливается в ядре, способствуя транскрипции гена мишени (Jaakkola et al.,2001; Bruick,2003).

Широкий набор miRNAs связан с транскрипционным ответом на гипоксию. Имется обширный, всё увеличивающийся список miRNAs, регулируемых c помощью гипоксии, или позитивно или негативно, при разных экспериментальных условиях (Kulshreshtha et al.,2008; Loscalzo,2010; Bussolati et al.,2012; Du et al.,2012; Fang et al.,2012; Guo et al.,2012; Voellenkle et al.,2012). Др. miRNAs являются независимыми от гипоксии, но способны негативно регулировать HIF; сюда входят miR-107, miR-17-92 и miR-519c, чья экспрессия индуцируется c помощью p53, c-myc и hepatocyte growth factor (HGF), соотв. (Taguchi et al.,2008; Cha et al.,2010; Yamakuchi et al.,2010). Третья группа miRNAs это те, которые регулируются c помощью гипоксии, которая может в свою очередь регулировать HIF, участвуя или в негативных или позитивных петлях обратной связи. Разные примеры петель обратных связей, содержащих miRNAs, регулирующие экспрессию HIF будут обсуждены ниже.

Bruning с сотр. продемонстрировали на клетках Caco-2 , подвергнутых воздействию продолжительной гипоксии, что HIF-1 индуцирует miR-155, которая в свою очередь репрессирует экспрессию HIF-1α, путем непосредственного соединения с 3'UTR его мРНК (Fig. 3A). Эта одиночная негативная петля обратной связи, в которой HIF-1α индуцирует свой собственный ингибитор, создает ряд ограничений активности HIF-1α в клетках, подвергнутых длительным периодам гипоксии (Bruning et al.,2011).

В качестве примера miRNA, участвующей с петле двойной негативной обратной связи, которая регулирует экспрессию HIF-1α , выступает miR-20b (Lei et al.,2009) (Fig. 3B). В H22 клетках рака печени после воздействия гипоксии уровни miR-20b снижаются HIF-1-зависимым способом, тогда как miR-20b непосредственно воздействует на мРНК HIF-1α , регулируя негативно его трансляцию. Т.о., в то время как при нормоксии уровни miR-20b высокие и репрессируют HIF-1α, при гипоксии накопление HIF-1α ведет к ингибированию экспрессии miR-20b, и дальнейшему увеличению уровней HIF-1α .

miR-210 рассматривается как прототипическая индуцируемая гипоксией miRNA, как было установлено, существенно активируется в разных типах клеток при низком напряжении кислорода, HIF-зависимым образом (Chan and Loscalzo,2010; Huang et al.,2010; Gorospe et al.,2011). В клетках HEK 293A cells, miR-210 соединяется с 3'UTR glycerol-3-phosphatedehydrogenase1-like (GPD1L) мРНК и подавляет её трансляцию (Kelly et al.,2011). Независимо от своей дегидрогеназной активности GPD1L способна увеличивать активность PHD, приводя к усилению протеосомной деградации HIF-1α (Fig. 3C). Следовательно, при нормоксии, при которой активность HIF-1α супрессирована, низкие уровни miR-210 приводят к высокой экспрессии GPD1L, это индуцирует активность PHD, усиливает деградацию HIF-1α. При гипоксии, HIF-1α , индуцируя экспрессию miR-210, приводя к снижению уровней GPD1L. Это, в свою очередь, усиливает ингибирование активности PHD, повышает уровни HIF-1α белка. Т.о., miR-210 участвует в позитивной петле обратной связи, в которой HIF-1 индуцирует экспрессию miR-210 , которая , в свою очередь, косвенно увеличивает стабильность белка HIF-1α .

miR-210 индуцируется на поздних стадиях прогрессирования рака лёгких (Puissegur et al.,2011). В клетках A549 лёгочной аденокарциномы субъединица D succinate dehydrogenase complex (SDHD), которая является звеном цепочки транспорта электронов, является др. bona fide мРНК мишенью для miR-210 . miR-210 индуцируется гипоксией зависимым от HIF-1 способом, приводя к ингибированию экспрессии SDHD. Как следствие молчание SDHD, succinate накапливается в клетках, ингибируя активность PHD, это приводит к дальнейшей стабилизации HIF-1α (Fig. 3D). Эти находки подтверждают, что miR-210 является частью др. позитивной петли обратной связи, регулирующей HIF-1α косвенно посредством SDHD.

Мы обсудили примеры miRNAs, которые участвуют в петлях обратной связи, которые регулируют реакцию на гипоксию. Мы обнаружили зависимость от типа петли обратной связи, которые используются, miRNAs могут или вносить вклад в восстановление исходного паттерна экспрессии или усиливать новую программу экспрессии (Leung and Sharp,2010; Mendell and Olson,2012). Если miRNA участвует в одиночной негативной петле обратной связи (e.g., Fig. 3A), то она будет стремиться восстановить исходное состояние системы, провоцируя десенсибилизирование реакции (Pelaez and Carthew,2012). С др. стороны, двойные негативные (e.g., Fig. 3B) или позитивные (e.g., Fig. 3C and D) петли обратной связи усиливают активацию реакции на гипоксию. Т.о., miRNAs, участвующие в одиночной негативной, двойной негативной или позитивной петлях обратной связи могут обеспечивать устойчивость (robustness) к гипоксической реакции за счет разных молекулярных механизмов.

miRNAs PARTICIPATE IN THE REGULATION OF HIF-DEPENDENT ANGIOGENESIS

Крупные организмы с размерами превышающими границы диффузии кислорода, развили системы доставки посредством транспорта кислорода к разным тканям. У насекомых, таких как Drosophila, транспорт кислорода осуществляется посредством системы трахей, сложной сети разветвленных канальцев, которые достигают каждой ткани тела. Сходным образом у позвоночных кислород транспортируется кровотоком посредством сосудов, которые проникают во все органы и ткани (Dunwoodie,2009; Fraisl et al.,2009). Образование и ремоделирование сосудов осуществляется посредством разных механизмов: васкулогенез это процесс формирования de novo кровеносных сосудов из клеток сосудистых предшественников; ангиогенез определяется как генерация новых капилляров из предсуществующих сосудов (Rey and Semenza,2010). Гипоксия является важным стимулом для васкулогенеза и ангиогенеза (Simon and Keith,2008), а HIF непосредственно индуцирует транскрипцию vascular endothelial growth factor (VEGF), центрального игрока в обоих этих процессах (Forsythe et al.,1996). Удивительно, роль HIF в ангиогенезе значительно более широкая, т.к. он контролирует зависимую от гипоксии экспрессию наиболее критических ангиогенных факторов, включая stromal-derived factor 1 (SDF1), angiopoietin 1 и 2 (ANGPT1 и ANGPT2), placental growth factor (PGF) и platelet-derived growth factor B (PDGFB) (Kelly et al.,2003; Ceradini et al.,2004; Rey and Semenza,2010). Важно, что ангиогенез у взрослых может быть в некоторых случаях физиологическим (напр., при росте скелета, в менструальном цикле и при беременности) или при др. патологических процессах, таких как туморогенез и ишемическая болезнь (Shi,2009; Lu and Kang,2010; Chung and Ferrara,2011).

Растут доказательства, подтверждающие, что специфические miRNAs участтвуют в разных аспектах ангиогенной реакции, от пролиферации и миграции эндотелиальных клеток до морфогенеза ангиогенных врастаний (Wu et al.,2009b). Важно, что некоторые miRNAs являются проангиогенными, тогда как др. обладают анти-ангиогенными эффектами. Полный анализ miRNAs, которые регулируют ангиогенез находится вне задач данной статьи, см. др. (Wang and Olson,2009; Staszel et al.,2011). Несмотря на это важно подчеркнуть, что не было установлено, нуждается ли регуляция ангиогенеза c помощью большинства этих miRNAs иили зависит от HIF.

Как упоминалось выше, miR-20b и HIF-1 задействованы в двойной негативной петле обратной связи, в которой оба фактора ингибируют экспрессию др. др. Заслуживает внимание, что miR-20b не только подавляет трансляцию HIF-1α, но и также непосредственно целенаправленно воздействует на VEGF (Lei et al.,2009). Т.о., при гипоксии, HIF-1 увеличивает экспрессию VEGF посредством как прямого, так непрямого пути. С одной стороны, HIF-1 непосредственно индуцирует транскрипцию VEGF (Forsythe et al.,1996), а с др. стороны, н ингибирует экспрессию miR-20b, устраняя тем самым репрессию, оказываемую этой miRNA на VEGF. Этот второй циркуит, использующий HIF-1, miR-20b и VEGF, определяется как последовательная (coherent) упреждающая петля (Fig. 4A). Следовательно, взглянув на картину в целом, выявляется сеть, состоящая из двух взаимосвязанных петель: coherent упреждающей петли и двойной негативной петли обратной связи, которые взаимодействуют, скорее всего, обеспечивая устойчивость ангиогенного процесса.

В CNE клетках экспрессия miR-20a is подавляется при гипоксии, преимущественно HIF-1-зависимым способом; эта miRNA, в свою очередь, непосредственно ингибирует трансляцию VEGF (Hua et al.,2006) (Fig. 4B). Т.о., coherent упреждающая петля, по-видимому, действительно возникает, в ней HIF-1 непосредственно индуцирует транскрипцию VEGF (Forsythe et al.,1996) и одновременно уменьшает репрессию, осуществляемую c помощью miR-20a, косвенно усиливая экспрессию VEGF.

Т.о., miRNA-обеспечиваемые упреждающие петли, участвующие в регуляции ангиогенеза, могут быть дополнительным способом обеспечения устойчивости в ответ на гипоксию. Появление механизмов устойчивости, контролирующих ангиогенез, является критическим для предупреждения начала процесса в ответ на слабые или нестойкие гипоксические стимулы и, наоборот, чтобы гарантировать своевременную и воспроизводимую реакцию при длительных гипоксических условиях.

PERSPECTIVES

In the present article, we have proposed that miRNA-containing feedback and feedforward loops regulating HIF-α expression and angiogenesis can enhance robustness of the hypoxic response. Even though bioinformatic analyses have demonstrated that these loops can provide robustness, it is important to take into account that properties of the network motifs are not exclusively dependent on qualitative interactions. Quantitative parameters, such as stoichiometry of the components and kinetics of the interactions in the loop, also determine the functionality of these motifs (Graham et al.,2010; Pelaez and Carthew,2012). The context in which the network operates can also be critical, since circuits do not act in isolation (Ebert and Sharp,2012). Therefore, experimental and computational evidence will be extremely relevant to confirm an actual role of miRNAs in conferring robustness to the hypoxic response.

The regulatory role of miRNAs in complex networks is only beginning to be understood. These small RNAs have unique properties as gene expression regulators, and studying their involvement in interlocked circuits and complex networks will help us to further understand their biological functions. One of the most important roles of miRNAs may be to provide robustness to the networks they are involved in, regulating many different biological processes, the hypoxic response being one of them.

Robustness of the hypoxic response: Another job for miRNAs?Ana Laura De Lella Ezcurra, Agustina P. Bertolin, Mariana Melani, Pablo WappnerDevelopmental Dynamics Special Issue: Special Focus on Developmental Biology in Latin America Volume 241, Issue 12, pages 1842–1848, December 2012

Robustness of the hypoxic response: Another job for miRNAs?
Ana Laura De Lella Ezcurra, Agustina P. Bertolin, Mariana Melani, Pablo Wappner
Developmental Dynamics Special Issue: Special Focus on Developmental Biology in Latin America Volume 241, Issue 12, pages 1842–1848, December 2012