Спецификация формы и функции эпителиальных клеток происходит на трех разных уровнях. На тканевом уровне, когда предопределяется организация клеток внутри эпителиальных слоёв (клеточная геометрия или топология) и происходят дельнейшие специализации и морфогенез (Lecuit and Lenne, 2007; Zallen and Blankenship, 2008). На клеточном уровне, когда ремоделирование специфичного для эпителия цитоскелета из actin запускает образование высоких, удлиненных клеток как часть процесса эпителиальной поляризации (Mege et al., 2006). На молекулярном уровне, стабильные межклеточные адгезии предопределяют рекрутирование сигнальных и структурных белков в места адгезий между соседними клетками (Braga, 2002; Mellman and Nelson, 2008). Всё же во время эпителиальной спецификации остаются неизвестными пространственная и временная регуляция высоты клеток [трехмерной (3D) или удлиненной формы] приобретение клеточной геометрии [двумерная (2D) форма на тканевом уровне].
В эпителиальных слоях у Drosophila, Xenopus или Hydra, полностью дифференцированные клетки организуются как многоугольники, среди которых шестигранники (т.e. 6 соединений с соседними клетками) являются наиболее приемлемой геометрической формой клетки, оптимальной для упаковки и использования пространства (Farhadifar et al., 2007; Gibson et al., 2006). Такое упорядоченное полигональное распределение внутри эпителиальных слоёв испытывает влияние со стороны клеточной пролиферации и дифференцировки, таких как интеркаляции или тканевой рост за счет элонгации (Bertet et al., 2004; Blankenship et al., 2006; Farhadifar et al., 2007). Однако неизвестно, как полигональная форма клеток приобретается в первую очередь. Кроме того, такое полигональное распределение не было формально продемонстрировано в клетках млекопитающих (Farhadifar et al., 2007; Gibson et al., 2006).
На тканевом уровне полигональная форма клеток приобретается путем ремоделирования межклеточных контактов, а регуляция контрактильности в соединениях предопределяет аллокацию соседей внутри эпителиального слоя (Lecuit and Lenne, 2007; Zallen and Blankenship, 2008). На клеточном уровне перестройки цитоскелета, необходимые для поляризации эпителия, инициируются за счет сборки определенных адгезивных структур, в частности, E-cadherin-обеспечиваемые межклеточные контакты (Braga, 2002; Mege et al., 2006). Сборка E-cadherin в важных межклеточных контактах запускает реорганизацию располагающихся по окружности тонких пучков, которые формируют характерные F-actin кольца по периферии эпителиальных клеток (Mege et al., 2006; Zhang et al., 2005).
В клетках млекопитающих myosin II располагается в соединениях и периферических пучках (Ivanov et al., 2007; Shewan et al., 2005; Watanabe et al., 2007) и его функция важна для стабилизации соединений (Hildebrand, 2005; Ivanov et al., 2007; Smutny et al., 2010). Стабильность тонких пучков (Weber et al., 2007) или их повышенная контрактильность (Zhang et al., 2005) коррелирует по времени с полным удлинением латерального домена или с переходом от кубовидной к столбчатой форме (Widmann and Dahmann, 2009).
Неожиданно, молекулярные механизмы, посредством которых межклеточные адгезии регулируют ремоделирование актина и контрактильные события в эпителии оказались недостаточно изучены. Мы полагаем, что приобретение удлиненной формы клеток и полигональное распределение в эпителиальных слоях регулируются белками ROCK. ROCK это serine-threonine киназный эффектор из малой GTPase Rho и одного из наиболее охарактеризованных регуляторов контракций myosin II (Jaffe and Hall, 2005). Однако их специфическая функция во время спецификации формы эпителиальных клеток не были исследованы.
ROCK белки фосфорилируют myosin regulatory light chain (MRLC), активируя тем самым её функцию, чтобы стимулировать сокращения (Vicente-Manzanares et al., 2009). С др. стороны, ROCK может также фосфорилировать myosin phosphatase (MYPT)-связывающую субъединицу (по треонину 696 и 850). Фосфорилирование по T696 ведет к инактивации MYPT и к неспособности дефосфорилировать MRLC (Ito et al., 2004). Точные функциональные последствия фосфорилирования MYPT по T850 неясны, но оно может регулировать прикрепление MYPT к актиновым филаментам (Ito et al., 2004).
Два разных ROCK белка, ROCK1 и ROCK2, обнаруживают высокий уровень идентичности и перекрывающиеся субстраты, это согласуется с их способностью сотрудничать и замещать один др. (Vicente-Manzanares et al., 2009). В недавних работах было показано, что белки ROCK обладают также и различающимися ролями (Riento et al., 2005; Samarin et al., 2007; Yoneda et al., 2005). ROCK1 важен для поддержания стрессовых волокон в фибробластах (Yoneda et al., 2005) и эпителиальных клетках, ROCK2 необходим для включения миозина II в соединения (Yamazaki et al., 2008) и для тубулогенеза (Wozniak et al., 2003).
Здесь мы установили, что после сборки соединений, ROCK1 и ROCK2 оказываются необходимы для соотв. элонгации латерального домена и для распределения тонких пучков вдоль Z-оси. Важно, что снижение фосфорилирования MRLC и MYPT в отсутствие ROCK белков также воздействует на ремоделирование соединений и становление геометрической формы клеток поперек эпителиальных слоёв. Полученные данные строго показывают, что ROCK1 и ROCK2 выполняют кооперативную роль в элонгации клеток, а также в геометрическом распределении в эпителиальном монослое.
Discussion
Мы исследовали временное и функциональное взаимодействие между элонгацией клеточной формы и геометрической клеточной формой во время эпителиальной дифференцировки. Сокращения миозина выполняют хорошо известную роль в обоих процессах; пока молекулярные механизмы, которые регулируют контрактильность во время дифференцировки формы эпителиальных клеток не были охарактеризованы. Мы установили, что ROCK1 и ROCK2 необходим для элонгации латерального домена и для соотв. полигонального распределения, которое предопределяет геометрический порядок в эпителиальных слоях. Эти новые специфичные для эпителия функции ROCK имеют важное значение для динамической регуляции формы эпителиальных клеток во время развития и морфогенетических процессов.
Впечатляющий фенотип, когда ROCK ингибирован с помощью соединения Y27632, кератиноциты в этом случае имеют более короткий латеральный домен. Истощение или по ROCK1 или по ROCK2 нарушает клеточную элонгацию кератиноцитов в одинаковой степени, это указывает на компенсацию между ROCK1 и ROCK2 в этом процессе. Участие ROCK белков в зависимом от соединения ремоделировании цитоскелета и элонгации латерального домена ранее не было известно. Мы полагаем, что поскольку соединения собираются поперек монослоя, то соотв. ROCK-зависимая регуляция контракции и компакции тонких пучков в направлении соединений может помочь стабилизировать латеральный домен и контакты между соседними клетками.
Впервые мы показали, что полигональное распределение, способствующее шестигранникам, приобретается быстро после образования межклеточных контактов и что эпителиальная топология у млекопитающих сходна с таковой эпителия Drosophila, Xenopus или Hydra (Farhadifar et al., 2007; Gibson et al., 2006). Интересно, что вследствие истощения ROCK1/ROCK2 в кератиноцитах человека, нарушенное распределение геометрической клеточной формы указывает на то, что, по-видимому, затрагивается ряд соединений на клетку. Правда небольшие, одинаковые в 10-15% отклонения в распределении геометрических форм обнаруживаются также в установившемся монослое после митозов (Gibson et al., 2006) или во время интеркаляций эпителии зародышевого диска Drosophila (Zallen and Zallen, 2004). Однако ни пролиферация, ни паттерн формирующие передачи сигналов не были использованы в нашем исследовании; только межклеточные контакты индуцировались спустя 60 мин. Т.о., генерация полигональной формы клеток и смещение соседей в нашей модели являются прирожденными свойствами соединений, независимо от эпителиальной дифференцировки или пролиферации.
В данной клетке динамика соединений регулирует его полигональность клеточной формы и количество соседних клеток, которые оказывают выраженное влияние на глобально ре-структуирование и направленный рост ткани (Bertet et al., 2004; Blankenship et al., 2006; Classen et al., 2005; Farhadifar et al., 2007; Zallen and Zallen, 2004). Мы установили, что значительное натяжение клеток против каждой из соседних происходит, чтобы (i) поляризовать индивидуальные клетки соотв. по всему монослою и (ii) приобрести наиболее энергетически подходящую клеточную форму и количество соседей (Gibson et al., 2006; Zallen and Zallen, 2004), скорее всего, с помощью перестройки (re-wiring) соединений между соседними клетками. Интересно, что в отсутствие ROCK белков, описываемые дефекты в элонгации клеток и геометрическом порядке распределения не возникают в результате тяжелых пертурбаций соединений или пучков. Поскольку рекрутирование E-cadherin в межклеточные контакты не нарушено, наши данные указывают на то, что ROCK белки оперируют нижестоящим образованием кластеров E-cadherin.
Наши данные позволяют полагать, что без ROCK белков, соединения могут быть более ломкими при действии механических стрессов, т.е. противостоящих сил натяжения от соседних клеток Liu et al. (2010). В отсутствие ROCK1 и ROCK2, неспособность кератиноцитов активировать контрактильный аппарат может ослаблять реакции на растяжение от соседних клеток, приводя к дефектам ремоделирования соединений и нарушая расположение соседей в монослое. Кроме того, ROCK-зависимое фосфорилирование субстратов в соединениях (Jaffe and Hall, 2005; Mege et al., 2006; Vicente-Manzanares et al., 2009) может вносить вклад непосредственно в их стабильность. Т.о., тот же принцип, что управляет топологией клеток у Drosophila, оперирует также в эпителиальных клетках млекопитающих. Необходим дальнейший анализ, чтобы оценить до какой степени регуляторные механизмы у мух и человека сходны в отношении ремоделирования и контрактильности соединений.
Интересно, что общие уровни F-actin в тонких пучках не нарушены существенно в отсутствие ROCK белков, это указывает, что остаточные уровни ROCK белков достаточны, чтобы поддерживать тонкие пучки в кератиноцитах. Альтернативно, поскольку ROCK ингибитор Y27632 демонтирует тонкие пучки, то др. киназы могут вносить вклад в гомеостаз тонких пучков (Davies et al., 2000). Т.о., ROCK1 и ROCK2 могут регулировать ремоделирование тонких пучков, но не их поддержание в эпителии.
Механистически, мы продемонстрировали, что путем образования кластеров кадгериновых рецепторов на кусочках, два ключевых регулятора сокращений, MRLC и MYPT, фосфорилируются зависимым от ROCK способом. Вполне допустимо, что т.к. тонкие пучки являются предсуществующей популяцией актина в отсутствие межклеточных соединений (Zhang et al., 2005), то вызываемое соединениями фосфорилирование MRLC может быть необходимо не только, чтобы сдерживать, но также достаточно, чтобы индуцировать пространственную ре-локализацию предсуществующих тонких пучков в направлении соединений (скорее, чем биогенеза новых пучков). Альтернативные механизмы, такие как связывание в пучки, фосфорилирование тяжелой цепи миозина (Vicente-Manzanares et al., 2009) или др. Rho эффекторов (Jaffe and Hall, 2005) могут действовать совместно с ROCK во время уплотнения тонких пучков.
Мы полагаем, что соотв. уровни фосфорилирования и правильное расположение массивов тонких пучков вдоль Z-оси являются критическими для поддержания притягивания/отталкивания от соседних клеток. Натяжение подлежащего кортикального цитоскелета и/или соотв. уплотнение тонких пучков могут помочь поддерживать кадгериновые рецепторы на месте, напр., при снижении скорости их интернализации или ограничении латеральной диффузии комплексов (Mellman and Nelson, 2008; Warner and Longmore, 2009). Предсказания, проистекающие из наших результатов, это что ROCK1 и ROCK2-зависимое фосфорилирование может быть необходимым для поддержания адгезивных cadherin контактов во время ремоделирования вновь формируемых соединений в состоянии динамического равновесия после клеточного деления и во время морфогенеза.
Полученные данные имеют значение для рада др. процессов, в которых имеет место взаимодействие между межклеточной адгезией и контракциями. Вызываемое натяжением ремоделирование соединений и подлежащего цитоскелета было описано ранее при направленном исключении апоптических и опухолевых клеток из слоёв эпителия (Hogan et al., 2009; Slattum et al., 2009), формировании паттерна канала улитки у млекопитающих (Yamamoto et al., 2009), интеркаляции и апикальных сужений у Drosophila (Lecuit and Lenne, 2007; Zallen and Blankenship, 2008), определении границ между соседними компартментами (Landsberg et al., 2009; Monier et al., 2010) или искривлении и инвагинации эпителиальных слоёв (Bertet et al., 2004; Franke et al., 2005; Ivanov et al., 2008). Новая специфичная для эпителия функция ROCK, идентифицированная здесь подчеркивает важность ROCK для ремоделирования тонких пучков, которое может вносить вклад в описанные процессы развития.
Итак, мы продемонстрировали, что геометрический порядок эпителиальных слоёв млекопитающих является внутренне присущим свойством соединений, независимо от сигналов дифференцировки или пролиферации. Во время спецификации эпителия мы идентифицировали ROCK1 и ROCK2 в качестве ключевых регуляторов уплотнения тонких пучков, что делает возможным увеличение высоты латерального домена. Итак, ROCK функции на уровне единичной клетки важны для генерации кубовидной морфологии (3D shape or elongated lateral height) и геометрической топологии, благоприятствующей гексогональной форме клеток
(2D cell shape).
