Экспрессия cEbf2 и cEbf3 генов в латеральных половинках сомитов указывает на возможную роль латеральных тканей в регуляции этих генов. Отделение сомитной мезодермы от латеральных тканей с помощью латерального барьера ведет к устранению маркера латеральной части сомита, Sim1 (Dietrich et al. 1997). Подобно Sim-1, та же самая операция приводит к полному подавлению экспрессии cEbf2 и cEbf3. Итак, индукция и поддержание cEbf2 и cEbf3 в основном зависят от латеральных тканей.

Предыдущие исследования показали, что активация латеральных сомитных программ зависит от членов семейства передачи сигналов Bmp, особенно Bmp4, высвобождаемого латеральной пластинкой мезодермы (Tonegawa et al. 1997; McMahon et al. 1998; Dockter 2000; Christ et al. 2004). В соответствии наши результаты экспериментов по эктопической экспрессии генов показали, что происходящие из латеральной пластинки Bmp4 сигналы контролируют индукцию и поддержание экспрессии cEbf2 и cEbf3 генов в сомитах. Наши результаты также показали, что экспрессия генов cEbf2 и cEbf3 пропорциональна концентрации BMP4. BMP4 не только способен активировать cEbf2 и cEbf3, но и также восстанавливать их экспрессию после отделения латеральной пластинки мезодермы от сомитной мезодермы. Верхняя часть нервной трубки и лежащая поверх эктодерма являются двумя дальнейшими источниками сигналов Bmp4, обозначенных здесь как дорсальные Bmp4 (Monsoro-Burq & Le Douarin 2000; Monsoro-Burq 2005). Этот дорсальный Bmp4 вряд ли оказывает регуляторный эффект на экспрессию cEbf2 и cEbf3 по следующим причинам: (i) удаление эктодермы и/или нервной трубки не меняет экспрессии cEbf2 и cEbf3 (Appendix S2); и (ii) дорсальные Bmp4 сигналы затрагивают только наиболее дорсальные клетки склеротома, которые располагаются между эктодермой и дорсальной частью нервной трубки и не могут оказывать эффектна остальные клетки склеротома (Sela-Donenfeld & Kalcheim 2002). Следовательно, cEbf2 и cEbf3 гены, которые экспрессируются латерально в склеротоме, в основном регулируются с помощью Bmp4 из латеральной мезодермы. В подтверждение этого мнения, др. Bmps, происходящие не из латеральной пластинки, такие как, Bmp7, который экспрессируется в дорсальной части нервной трубки и дорсальной части губы дермамиотома, неспособен регулировать экспрессию генов cEbf2 и cEbf3.

Возможно, что др. молекула из хорды необходима, чтобы противодействовать BMP4 и тем самым ингибировать экспрессию cEbf3 более медиально. Прекрасным геном кандидатом, удовлетворяющим этим критериям является Noggin, поскольку он является медиальным сигналом, секретируемым из хорды (McMahon et al. 1998) , и действует или синергично с Shh, чтобы активировать медиальные сомитные маркеры, такие как Pax1 (Dockter 2000; Dockter & Ordahl 2000) или сам по себе, чтобы ингибировать эффект латерализации латеральных мезодермальных сигналов, особенно BMP4 (Tonegawa et al. 1997; Capdevila et al. 1998; Tonegawa & Takahashi 1998). В соответствии с этим, избыточнапя экспрессия Noggin в латеральной пресомитной мезодерме приводит к полной потере cEbf2 и cEbf3. В целом, хотя ингибирование BMPs c помощью инъекций Noggin индуцирует образование клеток склеротома, такие клетки неспособны экспрессировать гены cEbf2 и cEbf3. Это указывает на то, что сигналы Bmp являются критическими для индукции и поддержания экспрессии обоих этих генов и качественных характеристик клеток, экспрессирующих эти гены.

Профиль экспрессии cEbf2 и cEbf3 , выявляемый c помощью in situ гибридизации, строго подтверждает их функциональное участие в дифференцировку склеротома и некоторых аспектов морфогенеза позвоночных. Во время ранней ст. развития перед формированием сомитов, гены cEbf2 и cEbf3 обеспечивают латеральный паттерн вокруг первичной полоски и Гензеновского узелка. После сомитогенеза оба гена продолжают обнаруживаться латеральнее в вентральной сомитной ткани (предшественник склеротома) и соседнем соматоцеле незрелых сомитов. После эпителиально-мезенхимного перехода (EMT), два куриных cEbf гена экспрессируются в латеральной порции склеротома зрелых сомитов. Это означает, что латеральные части склеротома могут быть идентифицированы раньше, до EMT, по экспрессии cEbf2 и cEbf3. В соответствии с этим латеральная экспрессия в сомите,была установлена, для мышиного Ebf2,3 и лягушачьих xEbf2, 3 (Dubois et al. 1998; Kieslinger et al. 2005). Позднее, совпадение появления нейральных структур в передней половине склеротома, выявляется новая экспрессия cEbf2 и cEbf3 в DRG, вокруг аксонов спинальных нервов, тогда как более ранняя экспрессия в латеральной части склеротома становится ограниченной областью склеротома вокруг проксимальных частей ребер и тонкой пластинкой нейральных дуг позвонков, за исключением остистых отростков. Следовательно, экспрессия в склеротоме генов cEbf2 и cEbf3 может быть подразделена на скелетогенную (на периферии позвонков и проксимальных частей ребер) экспрессию и нейрогенную (в DRG и вокруг спинальных нервов). Скелетогенная экспрессия начинается раньше в скелетогенных склеротомальных клетках предшественниках и поддерживается в надхрящнице зачатков костей позвоночной дуги и проксимальных часте ребер. Однако нейрогенная экспрессия стартует позднее и после образования DRG и спинных нервов, т.е. они экспрессируются в специфицированных нейрональных клетках, но не в их предшественниках. Сходным образом, предыдущие исследования отмечали позднюю экспрессию разных членов Ebf генов в DRG и вокруг спинальных нервов (Garel et al. 1997; Bally-Cuif et al. 1998; Garcia-Dominguez et al. 2003).

Предыдущие исследования показали, что медио-латеральная ротация (ML) 'gntkbfkmys[ сомитов ведет к развитию нормальных сомитов (Christ & Wilting 1992; Ordahl & Le Douarin 1992). Это подтверждает, что вновь сформированные сомиты ещё недетерминированы вдоль ML оси, и что детерминация медиального и латерального компартментов сомитов происходит после образования сомитов в ответ на внешние сигналы. Хотя медиальная и латеральная части сомита морфологически непрерывные структуры, существенный прогресс был достигнут в идентификации регуляторных каскадов, которые контролируют формирование ML паттерна этой ткани. Роль осевых структур в формировании медиального паттерна сомита в основном обеспечивается c помощью передачи сигналов Noggin и Shh, которые регулируют экспрессию медиальных сомитных маркеров, таких как Pax1 (Hirsinger et al. 1997; Tonegawa et al. 1997). С др. стороны, Bmp4 из латеральной мезодермы способствует латерализации сомитов посредством индукции латеральных маркеров, таких как Sim1 (Pourquie et al. 1996). Однако, кстати, нет определенной работы, изучающей молекулярные характеристики ML склеротома, которые бы делали отличающимися предшественники тела, ножки и нейральной дуги позвонков и проксимальных частей ребер. Пионерское исследование показало, что склеротом амниот горизонтально подразделен на медиальный и латеральный домены, благодаря регионализованной экспрессии медиальных маркеров, таких как Pax1 (Johnson et al. 1994), Nkx3.1 (Kos et al. 1998) и латерального маркера Sim1 (Pourquie et al. 1996; Cheng et al. 2004). Однако эти исследования не согласуются с точным местом экспрессии Sim1: одно исследованияе показало, что Sim1 чёткий латеральный дермамиотомный (hypaxial) маркер(Cheng et al. 2004), тогда как др. означает Sim1 как маркер для латеральной части (дермамиотом и склеротом) (Pourquie et al. 1996). Эти конфликтующие интерпретации обусловлены изменениями в экспрессии Sim1 со временем. ' Экспрессия в латеральной части склеротома Sim1 обнаруживаетя только у эмбрионов кур на ст. , но отсутствует на последующих стапдиях развития. Напротив, Sim1 остается в латеральном дермамиотоме вплоть до поздних стадий. Неразрешенными вопросами остаются: как клетки предшественников медиального и латарельного склеротома сегрегируют и как формируются самостоятельные медиальные и латеральные скелетные компоненты позвоночного столба.

Мы установили, что домены экспрессии cEbf2 и cEbf3 молекулярно определены латеральной частью склеротома и позднее вокруг хрящевых зачатков позвонковых дуг, следовательно, они могут формировать настоящий латеральный компартмент, перед латеральным подразделением осевых скелетных компонентов. В отличие от Sim1, cEbf3 может действовать как специфический маркер для латерального домена склеротома. Подтверждает этом мнение то, что экспрессия cEbf3 инициируется в латеральном домена crPSM и затем продолжается в вентралатеральной части SI-III. После созревания сомитов экспрессия, cEbf3 оказывается ограниченной латеральным доменом склеротома. В отличие от Sim1, экспрессия cEbf3 сохраняется в латеральной части склеротома вплоть до поздних стадий и никогда не сдвигается в латеральную часть дермамиотома. Латеральный домен склеротома, как было установлено, индуцируется c помощью сигналов от латеральной мезодермы (Bmp4 and Bmp2) и ингибируется c помощью сигналов от комплекса хорда + вентральная пластинка нервной трубки (Noggin) (Pourquie et al. 1995, 1996; Sela-Donenfeld & Kalcheim 2002). В самом деле, экспрессия cEbf3 в этом домен также индуцируется c помощью сигналов Bmp4 и репрессируется c помощью Noggin. Экспрессия cEbf3 продолжается в латеральном домене вплоть до хондрогенеза, при этом она создает прообраз конечных латеральных компонентов позвонков, нейральной дуги и проксимальных частей ребер. cEbf3 является уникальным маркером латеральной части склеротома.

cEbf2 также экспрессируется в латеральной части склеротома, но не столь специфичен как cEbf3. Экспрессия cEbf2 полностью перекрывается с cEbf3 в латеральной части склеротома и распространяется слегка в центральную часть склеротома. Латеральная часть склеротома слегкка расширяется к центральной порции склеротома. Это может объяснить различные реакции двух генов на эктопическое воздействие в медиальной части Noggin и может указывать на необходимость в BMP, происходящего из не латеральной пластинки, чтобы инициировать и поддерживать эту экспрессию. В соответствии с этим BMP, необходимый для инициации экспрессии cEbf2, не из латеральных тканей после имплантации Noggin между нервной трубкой (NT) и PSM полностью подавляет cEbf2. BMP, происходящий не из латеральной пластинки, может быть также необходим вместе с BMP, происходящим из латеральной пластинки, чтобы поддерживать экспрессию cEbf2 в сомитах после эктопической инсерции noggin между NT и эпителиальным сомитом, слегка подавляя его экспрессию. Более того, маловероятно, что эктодерма или NT источником этого BMP, происходящего из не латеральной пластинки, т.к. удаление эктодермы или NT не влияет на экспрессию cEbf2.

Существует сильное сходство между экспрессией Ebf2, 3 у млекопитающих и птиц, при этом у кур (this study) и мышей (Mella et al. 2004; Kieslinger et al. 2005) экспрессируются в латеральных доменах склеротома. Это подтверждает общую эволюционно законсервированную роль этих генов с формировании паттерна латерального домена сомитов. У анамниот, xenopus xEbf2,3 и у рыбок данио zEbf2,3 обнаруживают сходную экспрессию в латеральной части сомитов, как и амниот (Dubois et al. 1998). Более того у cephalochordate EBF у Amphioxus, AmphiCoe, экспрессируется в мезодерме в ламой латеральной части зрелых сомитов и в соседней латеральной мезодерме (Mazet et al. 2004). Это указывает на то, что у родоначальников позвоночных EBF экспрессирующие клетки первоначально располагались на участке, разделяющем латеральную сомитную и латеральную мезодерму. Это также может объяснить, почему cEbf2 и cEbf3 контролируются c помощью BMP4 из латеральной мезодермы.

Возможно, что cEbf2 и cEbf3 являются в основном маркерами латеральной части склеротома под контролем BMP4, или они являются функционально важными для формирования дужек позвонков и проксимальных частей ребер при скелетогенезе, запускаемом с помощью передачи сигналов BMP4. В подтверждение этой второй возможности, домен экспрессии cEbf2 и cEbf3 в надхрящнице завчатков костей дужек позвонков и проксимальных частей ребер, окружает домен как хондрогенных маркеров Sox9, Nkx3.2 , так и остеогенного маркера Runx2 (внутри прехондрогенных конденсатов и хрящевых структур всего позвоночника и проксимальных частей ребер) (Murtaugh et al. 1999, 2001; Zeng et al. 2002). Интересно, что экспрессия этих маркеров вместе с cEbf2 и cEbf3 регулируется с помощью BMP сигналов. Более того, cEbf2 гомолог у мышей, mEbf2,экспрессируется в надхрящнице, а его ингибирование ведет к потере Runx2 и костной массы (Kieslinger et al. 2005, 2010). Это означает, что экспрессия cEbf2 и cEbf3 может предшествовать экспрессии Sox9, Nkx3.2 и Runx2в сигнальном каскаде BMP, регулирующем скелетогенез.

In summary, the organization of cEbf2 and cEbf3 expressing cells in the lateral sclerotomal domains under the control of Bmp4 derived from the lateral mesoderm, indicates that these genes may exhibit a unique functional role during somite development and axial skeletogenesis.