Правильная полярность клеток существенна для собственно клеточных функций во многих типах клеток, включая эпителиальные клетки, нейроны и спермии. Прирожденная полярность микротрубочек обеспечивает полярность клеток, детерминируя направление перемещения пузырьков и др. грузов, исходя из предпочтительного перемещения базирующихся на микротрубочках двигательных белков. Во многих типах клеток плюс конец или быстро растущий конец микротрубочек расположен на периферии клетки в тесной близи к плазматической мембране. Такое расположение согласуется с поляризованным транспортом пузырьков к плазматической мембране по причине клеточного роста, доставки мембранных белков и высвобождения нейротрансмиттеров в нейронах помимо иных функций. Во время развития микротрубочки перестраиваются, чтобы приспособиться к клеточно-специфическим функциям в дифференцированном состоянии. Напр., эпителиальные клетки имеют сильно асимметричные мембранные домены, разделенные плотными соединениями. Чтобы приспособить доставку специфических грузов в эти различающиеся домены, цитоскелет из микротрубочек эпителиальныхы клеток перестраивается во время клеточной спецификации. Во время дифференцировки, базирующиеся на центросомах массивы радиальных микротрубочек трансформируются в параллельные пучки, лишенные связи с центросомой с минус концами или медленно растущими концами, ориентированными в направлении апикальной части мембраны, и плюс концами, направленными к в направлении базальной части мембраны. Такое расположение хорошо соответствует различным экзоцитическим и эндоцитическим путям, важным для собственно функции этого типа клеток (Musch, 2004).

Сперматогенез является прекрасным примером драматической перестройки микротрубочек, необходимого для продукции функционально дифференцированных клеток (Figure 1). Во время этого пути развития формируются структуры веретена во время двух последовательных раундов клеточного деления, чтобы дать в конечном итоге сперматиды, каждая из которых с гаплоидным содержанием ДНК. Сперматиды затем подвергаются поразительным изменениям в клеточной архитектуре, включая образование акросомы и жгутика, удлинения и конденсации ядра и удаление избыток цитоплазмы, чтобы сформировать сперматозоиды, которые могут эффективно доставлять генетический материал в ооцит во время оплодотворения. Точное исполнение и регуляция этого сложного пути важно, т.к. нарушение любой из ступеней может делать организм бесплодным или приводить к аномальному потомству.

Cell division

Mitosis

Образование и регуляция веретена в сперматогониях, предшественниках спермиев, сходны с теми, что наблюдаются в митозах соматических клеток (Barton and Goldstein, 1996; Endow, 1999; Gatlin and Bloom, 2010; Roof et al., 1992; Sharp et al., 2000; Walczak and Heald, 2008). Сбока и функционирование веретена управляются действием многочисленных молекулярных моторов, направленных как к минус, так и плюс-концу. Направленный к минус-концу мотор dynein/dynactin локализован на кинетохоре, где он предназначается для движения хромосом в направлении полюсов во время телофазы и к центромере, где он помогает связыванию веретена и астральных микротрубочек (Echeverri et al., 1996; Quintyne et al., 1999). Dynein/dynactin также необходим для удаления checkpoint белков из кинетохора в начале анафазы (Ozaki et al., 2011). Динамика микротрубочек, регулируемая с помощью деполимеризующих кинезинов, также участвует в перемещениях хромосом в направлении полюсов (rev. Ems-McClung and Walczak, 2010).

Класс моторных белков kinesin-14 обеспечивает фокусировку микротрубочек на центросоме благодаря их комбинированной способности перемещаться в направлении минус концов микротрубочек и соединять поперечно микротрубочки (Endow et al., 1990; McDonald and Goldstein, 1990). Двигательная активность подсемейства kinesin-5 обеспечивает баланс внутренним силам, продуцируемым подсемейством моторов kinesin-14 благодаря их способности связывать поперечно антипараллельны микротрубочки и двигаться в направлении плюс концов микротрубочек (Heck et al., 1993; Sawin et al., 1992). Члены моторов подсемейства kinesin-7 располагаются на кинетохоре и важны для собственно выравнивания хромосом в метафазной пластинке (Yen et al., 1991). Деполимеризующие кинезины, члены подсемейства kinesin-13, также расположены на кинетохоре, где их активность управляет перемещением хромосом к полюсам во время телофазы и они важны для обнаружения ошибок прикрепления микротрубочек к хромосомам (Wordeman and Mitchison, 1995). Chromokinesins, члены подсемейств или kinesin-4 или kinesin-10, ассоциированы с плечами хромосом и выполняют множественные функции в митозах, включая конденсацию хромосом, организацию веретена, расположение хромосом и цитокинез (rev. Mazumdar and Misteli, 2005). Члены подсемейства kinesin-6 необходимы для сборки центрального веретена и цитокинеза (Zhu et al., 2005).

Базирующийся на актине молекулярный мотор myosin II выполняет несколько ролей в цитокинезе, включая контроль округления клеток в профазе и осуществления важной двигательной активности по сжатию активнвых филамент во время телофазы. Недавние данные демонстрируют, что помимо этих важных функций myosin II участвует в позиционировании веретена и кариокинезе (rev. Matsumura et al., 2011). Активность Myosin II в цитокинезе, как и в др. примерах клеточной подвижности, регулируется с помощью обратимого фосфорилирования белка из ассоциированных с ним легких цепей и рассмотрена в недавнем обзоре (Matsumura, 2005).

Обратимое фосфорилирование белка является также основным способом регуляции активности базирующихся на микротрубочках моторов в митозах. Aurora B киназа фосфорилирует членов подсемейства kinesin-13, снижая тем самым их полимеризующую активность, и является важной для коррекции ошибок соединения микротрубочек с кинетохором (rev. Moore and Wordeman, 2004; Walczak and Heald, 2008). PLK1, polo-like kinase-1, также фосфорилирует mitotic centromere-associated kinesin (MCAK), члена подсемейства kinesin-13, но вызывает обратную по сравнению с фосфорилированием Aurora активацию MCAK's деполимеризирующей активности скорее, чем инактивиацию (Zhang et al., 2011). Члены подсемейства kinesin-5 биполярных plus-end моторов могут быть фосфорилированы как по их головному, так и хвостовому домену с помощью Wee1 гомолога и p34(cdc2) киназ, соотв., чтобы регулировать ассоциацию этих моторов с dynactin или микротрубочками (Blangy et al., 1997; Garcia et al., 2009).

Dynein/dynactin также регулируется с помощью обратимого фосфорилирования, прежде всего за счет фосфорилирования с dynein's ассоциированных промежуточных цепей (Huang et al., 1999; Whyte et al., 2008). Фосфорилирование промежуточных цепей dynein регулирует поставку dynein на кинетохоры, а состояние фосфорилирования этого мотора отражает статус прикрепления микротрубочек к веретену (Whyte et al., 2008).

Малый guanosine triphosphate (GTP)-связывающий белок Ras-related nuclear protein (Ran) участвует в др. возможном способе регуляции митотических моторных белков (rev. Walczak and Heald, 2008). Такого типа регуляция базируется на градиенте Ran-GTP, устанавливающемся с помощью связанного с хроматином Ran-GEF (guanine nucleotide exchange factor) RCC1, который нагружает на малую GTPase Ran GTP, приводя к высокой концентрации Ran-GTP вблизи хромосом. Помимо этого оказываются эффекты на др. белки, включая факторы сборки веретена, высокая концентрация Ran-GTP вблизи хромосом соединяется с MCAK, тем самым стимулируя образование веретена in vitro (Ems-McClung et al., 2004). Недавние данные выявили дополнительную и уникальную роль Ran и importins по доставке белков в первичные ерснички позвоночных (Fan et al., 2011).

Meiosis

Хотя митотические и мейотические веретена функционально сходны, они могут отличаться по одному отличительному аспекту: некоторые подклассы мейотических веретен самоорганизуются без нужды в центросомах и , следовательно, имеют отличающиеся потребности в активности молекулярных моторов (rev. Compton, 1998). Образование и стабильность веретена без центриоли зависит от отлавливания микротрубочек кинетохорами, связывания в пучки антипараллельных микротрубочек кинетохорами, от связывания антипаралльных микротрубочек с помощью членов подсемейства kinesin-5 и фокусирования микротрубочек из параллельных микротрубочек с помощью цитоплазматического dynein и подсемейства kinesin-14. Такие веретена могут также зависеть от пути Ran в своей сборке и поддержании, чем их аналоги, происходящие из центросом (Kalab et al., 2006). В мышиных ооцитах веретено образуется из множественных центров, организующих микротрубочки, присутствующих в ооплазме ооцита, тогда как в сперматоцитах грызунов миниатюрное веретено с парными центросомами формируется вне ядерной мембраны (Kallio et al., 1998; Schatten et al., 1986). После разрыва ядерной оболочки веретено сперматоцита собирает хромосомы и удлиняется вследствие разделения хромосом. Регуляция функции мейотического веретена в отношении активности микротубулярных моторов и динамики микротрубочек сходна с таковой, описанной для митозов.

Spermiogenesis

Как только гаплоидные зародышевые клетки продуцируются с помощью мейоза, они начинают удлиняться и вступают в процесс клеточной трансформации, необходимы для формирования зрелых сперматозоидов, способных переносить генетический материал в ооцит в результате оплодотворения. Микротрубочки участвуют в нескольких важных событиях этого процесса, включая элонгацию ядра, перераспределение и уменьшение цитоплазмы, и развитие жгутика.

Nuclear elongation

Вскоре после образования округлых сперматид формируется акросома и уплощение вдоль одного полюса ядра, сопровождаемые движениями ядра, чтобы прирдти в контакт с плазматической мембраной. В округлых сперматидах микротрубочки первоначально расположены случайно в цитоплазме без видимой центросомы (Moreno and Schatten, 2000). Происходит увеличение микротрубочек вокруг ядра и это предвещает образование манжетки, уникальной базирующейся на микротрубочках структуры, которая в конечном итоге окружает ядро непосредственно дистальнее акросомы (Wolosewick and Bryan, 1977). Манжетка является временным собранием, образующимся в ранних сперматидах и она полностью распадается на составляющие к моменту созревания спермия. Поскольку манжетка образуется в то время, когда ядро становится компактным и меняет форму, то предполагается, что это помогает выбору оптимальной организации ядра (Cole et al., 1988; Meistrich et al., 1990). Помимо манжетки, базирующаяся на актине структура. наз. acroplaxome, как полагают, находится под акросомой, чтобы передавать силы, продуцируемые актиновыми кабелями в клетки Сертоли, чтобы тем самым удлинить ядро сперматиды (Kierszenbaum et al., 2003a).

Подобно микротрубочкам веретена белки молекулярных моторов ассоциируют с микротрубочками манжетки; однако из-за отсутствия подходящей системы культивирования, лежащие в основе молекулярные механизмы, использующие моторные белки для сборки, функционирования и разборки манжетки пока не изучены. Цитоплазматический dynein ассоциирует с микротрубочками манжетки и с ядерной мембраной сперматиды (Hall et al., 1992; Yoshida et al., 1994). Кинезиновые моторы, как было установлено, находятся на манжетке (Hall et al., 1992; Saade et al., 2007; Wang et al., 2010; Yang and Sperry, 2003). Ориентация микротрубочек манжетки неясна; однако, присутствие плюс-конец связывающего белка CLIP-170 и его субфрагмента CLIP-50 в околоядерном конце подтверждает, что плюс концы микротрубочек располагаются в этой структуре (Akhmanova et al., 2005; Tarsounas et al., 2001). Подтверждением этой идеи является находка, что γ-tubulin, маркер центросомы, где находятся минус концы микротрубочек, отсутствует в околоядерном кольце манжетки сперматиды (Fouquet et al., 1998).

Cytoplasmic redistribution

Расположение манжетки вдоль ядра между апикальным и дистальным аспектом сперматиды подтверждает роль этой структуры в перераспределении цитоплазматического содержимого, необходимого для её удаления перед образованием спермия. Термин intramanchette transport (IMT) был предложен для отражения сходства между этого типа транспортом и intraflagellar transport (IFT), который также обеспечивается с помощью базирующихся на микротрубочках белков молекулярных моторов (rev. Kierszenbaum, 2002a). Явные различия между этими двумя формами транспорта заключаются в том, что IFT обеспечивается почти исключительно по микротрубочкам, тогда как и микротрубочки и актиновые филаменты поддерживают в манжетке IMT (Figure 1). Вместе с базирующимися на микротрубочках моторами kinesin и dynein, которые обнаруживаются в манжетке, предполагаются и мощные везикулярные перемещения, базирующиеся на актине молекулярный мотор myosin Va также обнаруживается в acroplaxome ив манжетке развивающихся сперматид (Kierszenbaum et al., 2003b; Hayasaka et al., 2008). Манжетка, как полагают, поддерживает IMT белки, предоставляющие путь для белков, имеющих целью развивающиеся центросому и жгутик (Kierszenbaum, 2002a). Эти белки включают элементы из протеосом (Bao et al., 2010; Rivkin et al., 1997; Rivkin et al., 2009); Ran GTPase и их партнёров по связыванию (Kierszenbaum et al., 2002; Bao et al., 2011); компоненты жгутиков, включая Sak57, Spag4 и ODF1 (Shao et al., 1999; Tres and Kierszenbaum, 1996) и IFT белки (Kierszenbaum et al., 2011; Sironen et al., 2010; Taulman et al., 2001).

Flagellar formation

Биогенез, структура и регуляция жгутиков и реснички спермия и др. типов клеток стали предметами многочисленных обзоров (Blair and Dutcher, 1992; Goodenough, 1989; Goodenough and Heuser, 1985; Silflow and Lefebvre, 2001; Walczak and Nelson, 1994). Однако, важным успехом последних лет взаимосвязанное нарушение роста ресничек и жгутиков посредством IFT, при этом любое увеличение массива генетических нарушений у человека прежде всего обусловливается нарушением пути передачи сигналов hedgehog осуществляемой в первичной ресничке (rev. D'Angelo and Franco, 2009; Tobin and Beales, 2009; Waters and Beales, 2011). Разнообразие симптомов, испытываемых затронутыми индивидами, включает обратную лево-правостороннюю асимметрию, дефекты в развитии костей и головного мозга, полидактилию, поликистозную болезнь почек, дегенерацию сетчатки и бесплодие.

Точная роль пути передачи сигналов hedgehog в сперматогенезе млекопитающих изучена недостаточно; однако устранение desert hedgehog, изоформы, экспрессируемой клетками Сертоли, во всех тканях Sertoli cells, во всех тканях ведет к специфичной для самцов стерильности (Bitgood et al., 1996). Составляющие сигнального пути hedgehog обнаруживаются в сперматогенных клетках, включая членов семейства Gli, patched-1 (PTCH1), smoothened (SMO), fused (STK36, также известного как Drosophila Fu) и супрессора fused (SUFU) (Kroft et al., 2001; Morales et al., 2009; Persengiev et al., 1997; Szczepny et al., 2006).

Недавно обнаружен ранее не охарактеризованный белок, названный testis leucine-rich repeat (TLRR, также известный как lrrc67) в ассоциации с центросомой развивающихся зародышевых клеток самцов мышей (Wang and Sperry, 2008, 2011; Wang et al., 2010). Интересно, что TLRR был идентифицирован как предполагаемый член цилиома (ciliome) и обогащен в тканях, обладающих ресничками и/или жгутиками (Li et al., 2004; McClintock et al., 2008). Локализация TLRR в сперматидах, а также его экспрессия в сетчатке и обонятельном эпителии, подтверждает роль этого белка в биогенезе ресничек и жгутиков (Wang and Sperry, 2011). TLRR обладает сайтом связывания protein phosphatase-1 (PP1) и, по-видимому, PP1 является регуляторным белком. Недавние фосфопротеомные исследования с использованием мышей, нулевых по специфичной для тестисов изоформе PP1, PP1γ2, идентифицировали тубулин в качестве потенциальной мишени для PP1γ2 в семенниках, указывая на возможную связь между TLRR и перестройкой микротрубочек в спермиогенезе (Henderson et al., 2010).

Post-translationally modified tubulin in spermatid structures

Tubulin является предметом для многочисленных типов пост-трансляционных модификаций, включая фосфорилирование, glutamylation, detyrosination и glycylation, которые могут изменять его функцию в микротубулярных структурах, где они обнаруживаются (reviewed in Luduena, 1998).Модифицированный tubulin дифференциально экспрессируется в зародышевых клетках самцов, отражая разнообразие функций микротубулярных структур в этих клетках (Fouquet et al., 1994; Kann et al., 2003). Тубулин аксонемы медленно модифицируется благодаря acylation, polyglutamylation и detyrosination (Kann et al., 2003; Mary et al., 1997; Mochida et al., 1999; Plessmann and Weber, 1997; rev. Kierszenbaum, 2002b). Monoglycylated tubulin распределен в виде градиента в аксонеме с наивысшей концентрацией в основании, тогда как polyglycylated tubulin также распределяется в виде градиента, но вместо этого наивысшая концентрация обнаруживается на кончике жгутика (Kann et al., 1998). Polyglutamylated tubulin также дифференциально распределяется в аксонеме и является важным для подвижности жгутика (Gagnon et al., 1996; Huitorel et al., 2002; Kann et al., 2003). Важность polyglutamylation для функции спермия была недавно подчеркнута в сообщении, что нулевые мутантные мыши по гену tubulin tyrosine ligase-like 1, имеют ракурсное сокращение жгутика с утолщением в средней части (Vogel et al., 2010).

Микротрубочки манжетки ацетилируются в большей степени, чем микротрубочки аксонемы (Mochida et al., 1999). Glutamylated и detyrosinated tubulin обнаруживаются как в манжетке, так и в аксонеме (Mochida et al., 1999). Др. отличием в модификации тубулина между манжеткой и аксонемой является glycylation, которая не обнаржуивается в манжетке (Kann et al., 1998). Помимо модификаций тубулина, уникальная изоформа тубулина, d-tubulin, обнаруживается в околоядерном кольце манжетки и во внутриклеточных мостиках, соединяющих сперматоцит и когорты сперматид (Smrzka et al., 2000; Kato et al., 2004).

Поскольку модификации ассоциируют с более стабильными микротрубочками, то такие изменения могут предоставлять дополнительную стабильность базирующимся на микротрубочках массивам в сперматидах (Luduena, 1998). Кроме того, активность молекулярных моторов может испытывать влияние со стороны модифицированного состояния подложки микротубулярной решетки (Dunn et al., 2008; Peris et al., 2009; Rosenbaum, 2000). Недавно переход от de-tyrosinated к acetylated тубулину, как было установлено, совпадает с приобретением полярности в культивируемых эпителиальных клетках (Quinones et al., 2011). Это дает дополнительное доказательство важной роли модификаций тубулина в становлении клеточной полярности.

Conclusions

Spermatogenesis is an excellent model system for study of the acquisition of polarity during differentiation. As in many developmental pathways, microtubule rearrangement plays a central role in this process. Molecular motors power changes in the cellular structure observed during mitosis and meiosis and are regulated in the same manner as in somatic cells. Particularly striking, however, are the changes in cell architecture that accompany spermiogenesis, the last phase of spermatogenesis. Briefly, the acrosome forms and flattens along the spermatid nucleus, the nucleus moves to contact the plasma membrane, the sperm flagellum forms, the microtubule manchette surrounds the nucleus, chromatin compacts, the nucleus elongates and cellular contents are reorganised and finally discarded prior to sperm release. The precise purpose and molecular mechanism of manchette function are not known; however, this structure contains both microtubule- and actin-based molecular motor proteins. As in other developmental pathways, tubulin modification accompanies cell polarisation during spermatogenesis including phosphorylation, glutamylation, detyrosination and glycylation. Such tubulin modifications may stabilise spermatid microtubule structures and regulate the binding and therefore the activity of molecular motor proteins. Further understanding of cytoskeletal reorganisation, particularly focused on the proteins associated with the manchette and their role in flagellar biogenesis, will provide insight into the common and testis-specific molecular mechanisms underlying cell polarisation during development.

The dynamic cytoskeleton of the developing male germ cell Ann O. Sperry Biology of the Cell Volume 104, Issue 5, pages 297–305, May 2012

The dynamic cytoskeleton of the developing male germ cell
Ann O. Sperry
Biology of the Cell Volume 104, Issue 5, pages 297–305, May 2012