Хотя сетчатка является сложной структурой, многие болезни наружной сетчатки могут быть приписаны дегенерации относительно простого эпителиального монослоя: retinal pigment epithelium (RPE). Хотя RPE не является определенно частью сетчатки он является важной поддерживающей тканью, участвующей в циклических преобразованиях ретинола, транспорте питательных веществ, продукции факторов роста и фагоцитозе ломких фоторецепторов (PR) outer segments (OSs). Большинство работ в последнее время сконцентрировано на замещении этого монослоя, первоначально с помощью аутологиченого источника клеток и сравнительно недавно с использованием стволовых клеток. Использовав как embryonic stem cells (ESCs) , так и induced pluripotent stem cells (iPSCs), нескольким группам исследователей удалось осуществить дифференцировку в клетки. которые обладали многими характеристиками и морфологическим сходством с клетками RPE. Этот подход связан с обширным хирургическим опытом рутинной ретинальной хирургии и развитием навыков экспериментальной ретинальной хирургии. Это сделало стволовые клетки, происходящие из RPE, идеальными кандидатами для трансплантации в сетчатку для лечения дегенеративных болезней. Сюда входят болезни, такие как связанная с возрастом age-related macular degeneration (AMD), Stargardt's disease (STGD) and retinitis pigmentosa (RP), для которых сегодня нет лечебных средств.

Сегодня проходят несколько клинических испытаний в фазе I с использованием терапии, базирующейся на стволовых клетках, для лечения болезней сетчатки и т.о., глаза стали одним из первых органов для целенаправленной регенеративной медицины. Результаты этих испытаний ожидаются с нетерпением не только, чтобы посмотреть, является ли терапия стволовыми клетками пригодным подходм, но и также чтобы оценить иммунную толерантность терапии стволовыми клетками. Альтернативный подход с использованием дифференцированных стволовых клеток для замещения дегенерировавшей ткани непосредственно это трансплантации лишь частично дифференцированных стволовых клеток или даже самих стволовых клеток, которые могли бы продуцировать трофические факторы, которые бы восстанавливали погибающие клетки и восстанавливали функцию. В соответствии с этим стволовые клетки,происходящие из ткани пупочного канатика, плодные стволовые клетки и аутологичные стволовые клетки, происходящие из костного мозга, трансплантировали в глаза в попытке поддержать здоровье сетчатки при AMD.

A brief overview of stem cells

Стволовые клетки обладают способностью дифференцироваться в несколько типов клеток, но они также способны к неограниченному самообновлению в своем недифференцированном состоянии. Стволовые клетки могут быть классифицированы в соответствии с их потенциалом: т.е. шоаниц типов клеток, в которые они могут дифференцироваться. Омнипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в эмбриональные и внеэмбриональные ткани, плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью формировать только эмбриональные ткани (эктодерму, мезодерму и энтодерму), и мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в ограниченное количество типов клеток, диктуемое степенью предварительной дифференцировки.

Cтволовые клетки могут быть также классифицированы в соответствии со своим происхождением. У человека ESCs происходят их внутренней клеточной массы бластоциста на 5-день у преимплантационных эмбрионов и являются плюрипотентными (Thomson et al., 1998). Плодные стволовые клетки происходят из плодных тканей и рассматриваются как мультипотентные. Взрослые стволовые клетки также были охарактеризованы для большинства основных органов, включая глаза (Singhal et al., 2012). Богатый источник взрослых стволовых клеток это костная ткань, которая содержит как haematopoietic stem cells (HSCs) , так и mesenchymal stem cells (MSCs), располагающиеся в костном мозге и строме, соотв. Ткань пупочного канатика др. источник мультипотентных стволовых клеток, которые превращаются в разыне типы клеток.

Терапевтическое использование стволовых клеток базируется на разных стратегиях, наиболее хорошо известной является заместительная клеточная терапия. Здесь стволовые клетки дифференцируются в желательный тип клеток, которые затем доставляются в поврежденную ткань для интеграции и восстановления функции. Альтернативный метод осуществляется посредством паракринного эффекта, причем трансплантированные стволовые клетки секретируют трофические факторы, которые заставляют приютившую их ткань самовосстанавливаться и пролиферировать (Baglio et al., 2012). Кроме того, имеются некоторые доказательства, что стволовые клетки могут сливаться с индивидуальными уже имеющимися клетками для восстановления функции (Ying et al., 2002).

Retinal disease candidates for stem cell-based regeneration

Сетчатка является идеальной мишенью для терапии стволовыми клетками по ряду причин. Глаз легко доступен и существует изобилие хирургических экспертиз, имеющих дело с сетчаткой, которые облегчаются прозрачной роговицей. Эта прозрачность также является целью клинической оценки после вмешательства и позволяет документацию с помощью фотографирования и др. изобразительных средств. Барьер между кровью и сетчаткой обеспечивает определенную степень иммунного преимущества в здоровом глазу, но оказывают ли какую-нибудь пользу трансплантаты больному глазу ещё предстоит определить. Более того, многие болезни сетчатки хорошо охарактеризованы.

Сетчатка сложная многослойная ткань, которая передает информацию световой энергии и превращает её в электрическую энергию, которая передается в головной мозг, чобы строить изображения видимого окружения. Расположенный в виде наиболее наружного слоя сетчатки, это ретинальный пигментный эпителий (RPE, Fig. 1), поддерживающая ткань для с высоким метаболизмом PRs наружной сетчатки. Свет превращается в электричество внутри PRs. Отсюда информация передается внутрь посредством биполярных клеток и ,наконец, в ганглиолярные клетки, которые образуют синапсы в superior colliculus и доставляют информацию ретинотопическим способом. Fig. 1.

Нормальный RPE это поляризованный монослой, который происходит из нейроэпителия передней части нервной пластинки развивающегося эмбриона. Это высоко метаболически активный слой клеток с многочисленными и разнообразными функциями, который действует. чтобы поддерживать слой хрупких PR клеток. первичные функции RPE включают транспорт питательных веществ, рециклинг ретинола, продукцию пигмента и фагоцитоз колбочек и палочек в OSs. Поляризованный RPE секретирует pigment epithelium-derived growth factor (PEDF) со своей апикальной стороны и vascular endothelial growth factor (VEGF) со своей базальной стороны. Плотные соединения между соседними клетками формируют гемато-ретинальный барьер и каждая клетки прикреплена к мембране Bruch's (Strauss, 2005).

PR и ассоциированные ретинальные связи, в самом деле, сложная система, которая трудна для воссоздания посредством регенеративной медицины. Значительно более пригодной мишенью является RPE (Strauss, 2005). Существует несколько болезней, которые затрагивают RPE, приводя к повреждениям RPE (Fig. 1B) потере зрения (AMD, STGD и RP).

Age-related macular degeneration

Связанная с возрастом макулярная дегенерация ведущая причина необратимой слепоты после 55 лет (de Jong, 2006). Повреждения в макулярной области центральной части сетчатки результат потери центрального зрительного поля (Fig. 2A,B). Продвинутая AMD может быть охарактеризована как сухая (geographic atrophy, GA) или влажная (choroidal neovascularization, CNV), исходя из отсутствия или присутствия, соотв., жидкости в макуле. Почти две трети после 80 лет обнаруживают, по крайней мере, ранние признаки AMD. Только в Великобритании известно полмиллиона людей с с поздней AMD и 1.75 миллионов в США, подчеркивая существенное бремя болезни, которая д. удвоиться в последующие 10 лет (Owen et al., 2012; Friedman et al., 2004). Более того, как только диагностируется поздняя AMD в одном глазу, то более чем у 42% пациентов разивается поздняя AMD на др. глазу, и12% становятся слепыми в течение 5 лет (Jager et al., 2008). Fig. 2.

AMD сложное дегенеративное заболевание с полигенным наследственным компонентом (Haines et al., 2005; Churchill et al., 2006). Оно возникает как результат хронического, низкой степени воспаления центральной части наружной сетчатки, которая ведет к дегенерации RPE и её базальной мембраны, мембраны Bruch's (Jager et al., 2008) (Fig. 1B). В нормальных условиях, каждая клетка RPE ответственна за фагоцитоз миллионов PR OS (Sparrow et al., 2010). Со временем неполное переваривание каждой из фагосом наступает накопление липосомного белка lipofuscin, который токсичен для клеток RPE. Кроме того, Bruch's мембрана удваивается в толщину между возрастом в 10 и 90 лет, замедляя импорт питательных веществ и экспорт отходов из RPE, и ослабляя способность RPE слипаться со своей базальной мембраной (de Jong, 2006). В случае сухой AMD, это постепенное изнашивание RPE ведет к последующей потере PR в макуле. При влажной AMD, происходит накопление жидкости как результат нежелательной неоваскуляризации мембран, врастающей из хороидного сплетения через Bruch's мембрану и RPE в субретинальное пространство и в конечном итоге через сетчатку. Неоваскуляризация управляется присутствием избытка VEGF на апикальной стороне RPE, это способствует росту фенестрированных, протекающих капилляров, что ведет к накоплению жидкости. Изредка эти ломкие сосуды вызывают кровизлияния в макулу, что может приводить к рубцам (Jager et al., 2008).

Stargardt's disease

Stargardt's болезнь является наследственным заболеванием сетчатки. Это наиболее распространенная причина макулярной болезни у детей с показателем 1:10000 живорожденных, и она присутствует в первой и второй декаде жизни. Болезнь прогрессирует, приводя к слепоте у взрослых в результате исчезновения центрального зрения (Fig. 2A,B). Клиническая картина это появление желтых пятен в макулярном регионе, что соответствует аномальной закладке ненужного пигмента lipofuscin в PRs, и затем в RPE, после фагоцитоза PR (Walia and Fishman, 2009). Наиболее распространенная форма болезни это STGD1, которая является аутосомно рецессивной. Она вызывается мутациями в гене ABCA4 (Allikmets et al., 1997), который кодирует белок транспортера, обычно экспрессирующийся на PR OSs. Менее распространенными формами STGD являются: STGD3, вызываемая мутациями в гене ELOVL4 (Zhang et al., 2001), кодирующем белок, участвующий в продукции жирных кислот в PRs; и STGD4, вызываемая дефектами в гене PROM1, который кодирует трансмембранный гликопротеин для PR (Yang et al., 2008). Хотя имеются обильная информация и ценные исследования молекулярной генетики STGD, на сегодня неизвестно лечение этой болезни.

Retinitis pigmentosa

Пигментный ретинит означает группу наследуемых дегенераций сетчатки, которая затрагивает в основном системы зрительных палочек. Известно более 100 определенных генетических мутаций, которые ведут к RP, и он может наследоваться как доминантный, рецессивный и Х-сцепленный признак. Он обладает чрезвычайно вариабельным клиническим течением, большинство пациентов обращается с проблемами ночной слепоты и прогрессирующей потерей периферического поля зрения, приводящего к туннельному зрению (Fig. 2C), которое часто ведет к слепоте (Hartong et al., 2006). Во многих случаях, RP прогрессирует, вовлекая центральное поле зрения. Классическая клиническая картина это пигментные отложения по периферии сетчатки. 1 из 4000 затронутых людей, имеет наиболее распространенный субтип RP, обусловленный мутациями в гене, кодирующем rhodopsin, и это объясняет 30% аутосомно доминантных случаев. Хотя многие RP мутации кодируют гены в PRs, многие субтипы RP начинаются с первичной неспособности RPE. RPE-специфичные гены RPE65 (Hamel et al., 1994) и MERTK (Gal et al., 2000), среди многих др., также участвуют в RP и могут быть идеальными мишенями для замещения стволовыми клетками, происходящими из RPE.

Retinal transplantation in AMD: proof of principle

Сегодня отсутствует лечение, которое могло бы устранить сухую AMD, хотя пищевые добавки с определенными витаминами и антиоксидантами, как было установлено, замедляют прогрессирование (Age-Related Eye Disease Study Research Group, 2001). В случае влажной AMD, инъекции в стекловидное тело анти-VEGF агентов могут стабилизировать болезнь, удерживая снижение остроты зрения у 90% индивидов с субтипом влажной AMD (Martin et al., 2011; Rosenfeld et al., 2006). Однако, такое лечение дорогостоящее и часто применяется, чтобы хоть как-то достичь положительного эффекта. Более того, долговременные побочные эффекты и потенциальная польза этой новой терапии ещё не выяснены.

В отсутствие доступного эффективного лечения для любого из типов AMD, были опробованы некоторые хирургические подходы для обращения патологии в последние 20 лет. Хирургическая техника сначала была разработана для осуществления субмакулярной хирургии для удаления неоваскуляризованных мембран и гемморагий. В обзоре (Giansanti et al., 2009) указывается, что субмакулярная хирургия оказывается безуспешной при влажной AMD и поскольку все эти процедуры требуют устранения стекловидного тела, приводят к ускорению катаракт, отсоединения сетчатки и пролиферативной vitreoretinopathy.

Принимая во внимание, что болезненный RPE является главным компонентом AMD, были предприняты попытки замещения RPE макулы, или путем перемещения макулы на здоровую часть периферии или путем трансплантации нового RPE под макулу. Источниками RPE клеток, которые были использованы в этих процедурах, включали ротированную на ножке створку периферического RPE-choroid, аутологичного свободного трансплантата RPE-choroid, слоёв плодного RPE и клеточной суспензии периферических частей RPE (Binder et al., 2007; da Cruz et al., 2007; Chen et al., 2009; van Zeeburg et al., 2012). При последнем подходе, одним из основных недостатков является отсутствие гарантии, что клеточная суспензия сможет сначала прикрепиться к больной мембране Bruch's membrane (Tsukahara et al., 2002). Более того, эти клетки, которые прикрепляются часто не образуют желательного монослоя, который необходим для оптимальной функции RPE, и они вместо этого собираются в клубочки или розетки (Vugler et al., 2008) или подвергаются anoikis (Tezel et al., 2004), форме апоптоза, специфичного для клеток, зависимых от прикрепления, которые отсоединены от их обычного внеклеточного матрикса.

Макулярные транслокации и RPE трансплантации сложные, длительные и затратные процедуры, которые часто требуют дальнейших хирургических вмешательств для устранения осложнений, таких как незапланированное отсоединение сетчатки, катаракты и двойное зрение. Маловероятно, что эти процедуры смогут подтвердить рентабельность в борьбе с огромным количеством AMD. Дальнейшим ограничением аутологичных трансплантатов RPE является трудность получения достаточного материала для адекватной репопуляции всей макулы. Более того, клетки должны быть собраны того же самого возраста, что и замещаемые клетки. Подсчитано, что макула содержит 60000 RPE клеток, которые потенциально нуждаются в замещении. Чтобы преодолеть это, необходимо разработать новые технологии получения и умножения RPE клеток in vitro , или для использования паракринных эффектов стволовых клеток стволовых клеток для запуска омоложения.

Potential sources of cells to treat retinal disease

Идеальной клеточной терапией для регенерации RPE должны стать высокая эффективность, низкое количество промахов, воспроизводимость рангов фенотипов и отсутствие иммуносупрессии. Предпочтительно, чтобы ткань легко размножалась, нуждалась в низкой скорости сбора урожая и в небольшом количестве этических вопросов. Это также должно мало стоить и требовать небольших ресурсов, и как культивирование, так и трансплантация ткани не должны быть технически трудными для исполнения. Потенциальный источник таких клеток для клеточной терапии AMD д. быть широкого ранга и включать как плюрипотентные стволовые клетки, так и мультипотентные стволовые клетки плодных и взрослых тканей.

Human embryonic stem cells

Первым результатом восстановления зрительной функции с помощью ESCs приматов (путем замещения монослоя RPE) стало из cynomolgus обезьян ESC-производный RPE, трансплантированный в Royal College of Surgeon крысам (RCS rat, see Box 1), приемлемой животной модели AMD (Haruta et al., 2004). С этого момента описаны два основных подхода для размножения RPE-подобных клеток из ESCs человека (hESCs), или спонтанны или направленный. Первый метод делает возможным избыточный рост колоний стволовых клеток, которые ведут в результате к спонтанной дифференцировке RPE клеток после удаления fibroblast growth factor (FGF) из культуральной среды (Klimanskaya et al., 2004; Lund et al., 2006; Vugler et al., 2008). После нескольких недель развиваются пигментированные области клеток, из которых выделяют RPE-подобные клетки. Спонтанная дифференцировка в RPE-подобные клетки также может быть достигнута с использованием эмбриоидных тел в суспензии, которые помещают в виде слипчивых колоний всреду нейральной дифференцировки (Meyer et al., 2009).

Box 1. The RCS rat

The Royal College of Surgeons (RCS) rat is a commonly used animal model for retinal pigment epithelium (RPE) diseases, including age-related macular degeneration (AMD), and is phenotypically characterised by the build up of phagosomes on Bruch's membrane, akin to AMD. These rats harbour a mutation in their Mertk gene (D'Cruz et al., 2000), which encodes MERTK, a transmembrane tyrosine kinase that is expressed in the RPE and plays a role in the signal transduction pathway involved in the phagocytosis of rod outer segments (OSs). In the healthy retina, the stacked phospholipid discs of the rod OSs are renewed at the base by 10% each day. As the discs travels towards the RPE, they generate toxic reactive oxygen species owing to their environment of rapid metabolism and high UV light. These increasingly unstable OS discs are phagocytosed in a circadian rhythm by the RPE. This event is facilitated by adhesion through the apically expressed ?V?5 integrin protein and subsequent transduction to initiate the phagocytosis process via MERTK.

Экстраполяция данных из RCS крыс на людей затруднительна. Крысы имеют значительно более низкую плотность колбочек и полностью лишены макулы. Кроме того, RCS крысы имеют молодую мембрану Bruch's, не склонную к AMD патологии. В самом деле, эксперименты, в которых отсоединение сетчатки у RCS крыс вызывали с помощью соляного раствора, давали восстановление некоторых визуальных реакций у этих крыс, преимущественно за счет 'очистки' от дебриса из комплекса RPE/Bruch's (Sauve et al., 2002).

Блее направленный подход может быть достигнут путем блокирования путей передачи сигналов Wnt и Nodal с помощью dickkopf 1 (DKK1) и left-right determination factor (LEFTY) (Ikeda et al., 2005), соотв. Альтернативные методы включают последовательную инкубацию с nicotinamide и затем с activin A (Idelson et al., 2009). Хотя урожай и скорость были выше при направленных методах дифференцировки RPE, может оказаться более благоприятным использование более спонтанных методов. Экзогенные факторы, использованные для управления стволовыми клетками, пути снижение нейрального и глазного поля дорогостоящие, как и ассоциированные техники культивирования клеток и труды. Более того, факторы, такие как DKK1 и LEFTY часто происходят из бактериальных и животных источников, которые могут добавлять сложность к регуляторным процессам терапии человека.

Человеческие ESC, происходящие из RPE, по-видимому, воспроизводят очень близко морфологию и функцию эндогенной ткани. Анализ hESC, произошедших из RPE, растущего в качестве монослоя выявил рисунок из гексогональных клеток с апикальными микроворсинками и меласомными гранулами, содержащими пигмент (Fig. 3). Более того, hESC, происходящие из клеток RPE , обладают полярностью с правильной апикальной ориентацией Na+K+ATPase и экспрессируемых белков, ассоциированных с плотными соединениями (Vugler et al., 2008). Анализ экспрессии генов и белков в hESC, происходящих из RPE in vitro показал экспрессию белков, участвующих в цикле преобразований ретинола, а также в экспрессии RPE65, белка, специфичного для клеток RPE. Кроме того, hESC, происходящие из клеток RPE, экспрессируют PAX6 на уровнях, сходных с клетками плодного RPE (Klimanskaya et al., 2004); более того, PEDF преимущественно секретируется с их апикальной поверхности, а белок 1 плотных соединений (ZO1) экспрессируется только их клеточными границами (Zhu et al., 2011). Наконец, наблюдался фагоцитоз при исследовании in vitro и после трансплантации в глаза RCS крыс (Carr et al., 2009; Idelson et al., 2009; Vugler et al., 2008), подтверждая, что эти клетки, в самом деле, похожи на RPE. Fig. 3.

C целью переведения этих исследований на клинические испытания, hESC, происходящие из RPE, трансплантировали в субретинальное пространство RCS крыс и, как было установлено, замедляют дегенерацию PRs, улучшают зрительную функцию и поддерживают объективные показатели электрической активности сетчатки (Lu et al., 2009; Lund et al., 2006; Vugler et al., 2008). Чтобы оценить надежность hESC, происходящих из RPE, они были также трансплантированы в NIH III мышей, которые были иммунодефицитны и лишены естественных киллеров клеток и зрелых T и B клеток (Lu et al., 2009). Эти мыши обычно обладали пониженной способностью защиты от инфекции и борьбы с раком и поэтому были идеальными кандидатами для оценки образования опухолей. Из45 животных, которые получали трансплантат, ни одно не дало тератом и не обнаруживало каких-либо доказательств дисплазии в течение их жизни. Это обнадёживает, хотя с осторожностью нужно подходить к экспериментам, поскольку др. группы сообщили об образовании опухолей у более 50% мышей, получивших hESC, происходящие из нейральных предшественников, трансплантированных в пространство под сетчаткой (Arnhold et al., 2004). В этом случае, однако клетки нейральных предшественников лишь частично дифференцировались и т.о., могли быть более туморогенными, чем окончательно дифференцированные hESC, происходящие из клеток RPE. Хотя RPE может быть культивирован и размножен in vitro (Salero et al., 2012), в здоровой макуле человека он в целом постмитотический. Поскольку плюрипотентные стволовые клетки, происходящие из клеток RPE, обладают многими структурными и функциональными свойствами нативного RPE, ожидается, что они не будут пролиферировать, особенно, если трансплантированы в их натуральный монослой.

Итак, hESC, происходящие из клеток RPE оладают многими характеристиками нативного RPE, включая морфологию, полярность, фагоцитоз, плотные соединения и циклические превращения ретинола. После трансплантации животным, моделирующим AMD, hESC, происходящие из клеток RPE могут восстанавливать зрительные параметры и могут представлять собой идеальный источник для клеточной терапии AMD.

Предварительные результаты клинических испытаний суспензии из диссоциированных hESC, происходящих из клеток RPE, трансплантированных двум индивидам (одному с сухой AMD и одному с STGD) были сообщены в 2012 Advanced Cell Technology (ACT), California, USA (Schwartz et al., 2012). Клетки, полученные ACT и наз. MA09-hRPE, инъецировали в пространство под макулу после удаления стекловидного тела. Спустя 4 мес. после трансплантации не обнаружено признаков образования тератом и потери зрения у каждого из индивидов. Было предположено, что новая пигментация вблизи места инъекции у пациента с STGD доказывает функциональность RPE . Больше результатов ожидается от этого multicentre испытания (см. Table 1 результатов этого и др. испытаний с использованием стволовых клеток при болезни сетчатки).

Table 1.

Clinical trials using stem cells for retinal disease that are currently registered on WHO clinical trial register

ESC, производные клеток RPE, обнаруживают морфологию и важные функции нативного RPE, и могут быть идеальным источником клеток для трансплантации. Этот источник, однако, этически спорен; поэтому, др. типы стволовых клеток, рассматриваемые в качестве пригодных для репарации сетчатки при AMD и др. дегенерациях сетчатки. Хотя замещение дегенерируемого RPE является подходящей стратегией, когда этот слой оказывается потерянным при более ранних формах болезни и неспособности простого восстановления, но всё ещё присутствующий, RPE может быть достаточным для устранения патологии.

Human foetal stem cells

Стволовые клетки плода происходят из широкого круга эмбриональных и внеэмбриональных тканей и рассматриваются как отличающиеся от стволовых клеток взрослых и ESCs (Pappa and Anagnou, 2009). Недавно плодные нейральные стволовые клетки человека были выделены в результате энзиматической диссоциации ткани головного мозга от абортированных плодов (16-20 недель беременности). Стволовые клетки были идентифицированы по их экспрессии маркера клеточной поверхности CD133 и были умножены в условиях культивирования клеток, которые были оптимизированы для культуры нервных клеток, чтобы вызывать образование розеток. Будучи диссоциированными, эти суспензии нейрализованных плодных стволовых клеток были инъецированы в пространство под сетчатку RCS крысам (McGill et al., 2012), где они выживали и мигрировала по всей сетчатке прочь от места инъекции. Базовые визуальные паттерны и гистология сетчатки улучшались, хотя точный механизм репарации неизвестен, поскольку трансплантированные клетки не приобретали ретинальную морфологию и не экспрессировали маркеров сетчатки. Эти клетки, меченные HuCNS-SC, были разработаны Stem Cells Inc. (Newark, CA, USA). Недавно, Stem Cells, в сотрудничестве Retina Foundation of the Southwest (Dallas, TX, USA), начали клинические испытания, первоначально на 16 пациентах с сухой AMD, используя инъекции под сетчатку стволовых клеток. Результаты ожидаются.

Human umbilical tissue-derived stem cells

Ткань пупочного канатика человека обладает мультипотентными стволовыми клетками, которые считаются стволовыми клетками взрослых. Такие стволовые клетки могут быть получены из пупочного канатика донора с помощью ферментативного переваривания и могут быть умножены в культуре клеток. Суспензии из стволовых клеток, происходящих из ткани пупочного канатика (hUTSCs), инъецировали под сетчатку у 80 RCS крыс (Lund et al., 2007),это давало лучшие исходы в терминах зрительных параметров по сравнению с контролем. Наблюдаемый механизм репарации, как полагают, паракринный, т.к.hUTSCs не меняли своей морфологии и секретировали высокие уровни brain-derived neurotrophic factor, который, как известно, улучшает жизнеспособность нейронов. Основываясь на этих находках, Janssen Research and Development (Philadelphia, PA, USA), исследовательский отдел Johnson and Johnson, начал клинические испытания линии клеток hUTSC, названные CNTO 2476, на индивидах с сухой AMD. Эти клетки доставляли с помощью катетеров через белую фиброзную часть склер и сосудистой хороидной ткани в пространство под сетчатку. Пока не опубликованы результаты испытаний этой фазы I/II.

Bone marrow-derived HSCs

У мышей было показано, что эндогенные HSCs мигрируют в пространство под сетчатку в поврежденной сетчатке (Li et al., 2006), преимущественно, чтобы инициировать репарацию. Аллогенные, происходящие из костного мозга HSCs (BMHSCs) доставлялись с помощью хвостовой вены мышей вскоре после экспериментально вызванного повреждения сетчатки (Atmaca-Sonmez et al., 2006). Эти экзогенные клетки, как было установлено, мигрируют в сетчатку, пролиферируют и экспрессируют RPE65 (специфичный для RPE белок). Эта экспрессия RPE белка подтверждает, что эти трансплантированные клетки реагируют соответствующим образом на свою новую нишу; однако, экспрессия только RPE65 не показательна в смысле приобретения функции RPE. RPE клетки обладают типичной морфологией и многими важными функциями, которые необходимы, чтобы охарактеризовать трансплантированные клетки как клетки, которые являются жизнеспособными замещениями в RPE. Одна группа (Otani et al., 2004) продемонстрировала улучшение зрительных параметров у мышей, моделирующих RP после инъекции в стекловидное тело таких BMHSCs. У людей, инъекции в стекловидное тело BMHSCs у трех индивидов с RP продемонстрировали отсутствие побочных эффектов, хотя зрительные параметры в этих случаях не улучшались достоверно (Siqueira et al., 2011). Таже самая группа сегодня использует эту терапию на субъектах с AMD и сосудистыми ретинопатиями, обе из них результат ишемии в сетчатке. В Калифорнии др. группа создана для испытаний с использованием инъекций в стекловидное тело аутологичных BMHSCs для лечения закупорки вены сетчакти, после проведения ими исследований на животных, которые показали безопасность процедуры (Park et al., 2012).

Bone marrow-derived MSCs

Происходящие из костного мозга MSCs (BMMSCs) также рассматриваются источником для клеточной терапии болезней RPE. Эти клетки инъецировали под сетчатку мышам, моделирующим RP (Arnhold et al., 2007), после чего морфология RPE и PR улучшалась. BMMSCs были также инъецированы в субретинальное пространство RCS крыс (Lu et al., 2010), где они вызывали реверсию снизившихся зрительных параметров. Интерсно, что у RCS крыс, BMMSCs не обнаруживают отличий в жизнеспособности трансплантата независимо от иммуносупрессии, подтверждая, что мезенхимные клетки потенциально менее иммуногенные, чем аллогенные стволовые клетки из др. источников.

Future applications and directions

Регенеративная терапия, базирующаяся на стволовых клетках может стать стандартным способом лечения большого числа тяжелых дегенераций сетчатки, но пока всё ещё далека от повседневной клинической практики. Хотя первые из клинических испытаний помогают ответить на наиболее злободневные вопросы об эффективности, остается множество вопросов, нуждающихся в разрешении. Происходящие от эмбрионов стволовые клетки, по-видимому, способны формировать клетки со структурой и многими функциями RPE, но их источник этически спорный вопрос, как и в случае плодных, происходящих из головного мозга стволовых клеток. Современные методы трансплантации с использованием клеточных суспензий не подходят для превращения их в монослой, что, скорее всего, связано иммунным отторжением. Хотя аутологичные стволовые клетки, происходящие из костного мозга менее иммуногенны после трансплантации, необходимо посмотреть, могут ли любые их этих методов обладать потенциалом восстановления зрения. Задача на будущее, это разработка этически приемлемой терапии, которая будет восстанавливать зрение или путем трансплантации ткани сетчатки или путем индукции репарации сетчатки, без иммунологического отторжения.

Transplanting hESC-derived RPE as a monolayer

В попытке воссоздать естественную анатомию RPE, London Project to Cure Blindness (LPCB; London, UK) разработал hESC, происходящие из линии клеток RPE, которая может быть культивирована как монослой на тонком слое полимера (Carr et al., 2013). Этот подход имеет целью преодолеть дезорганизованный способ, с помощью которого RPE клетки прикрепляются к мембране Bruch's после инъекции в виде суспензии (Fig. 4). Пластиковый полимер также разработан, чтобы действовать как замена устаревшей, утолщенной мембраны Bruch's, он создает якорь для клеток, также предназначен для хирургической доставки. Клиническое испытание с этим участком трансплантата RPE сегодня проводятся в Лондоне. Fig. 4.

Using iPSCs

ESC-подобные клетки могут быть также сгенерированы из дифференцированных соматических клеток с помощью репрограммирования множественными факторами (Takahashi and Yamanaka, 2006; Fusaki et al., 2009; Warren et al., 2010; Kim et al., 2009). Вынужденная экспрессия 4-х транскрипционных факторов, Oct4, Sox2, Myc and Klf4, может репрограммировать эти клетки в ESC-подобные клетки с плюрипотентными качествами, наз. iPSCs. Др. группы достигли сходных результатов, используя др. комбинации транскрипционных факторов, таких как Oct4, Sox2, Nanog и Lin28, которые избегают использования известного протоонкогена Myc (Yu et al., 2007).

RPE был также получен из iPSCs (Buchholz et al., 2009; Carr et al., 2009; Hirami et al., 2009). Как и в случае с hESC, происходящими из RPE, существуют разные протоколы для генерации RPE-подобных клеток из iPSCs. Происходящие из iPSC клетки RPE формируют монослои, обладающие полярностью, формир4ующие плотные соединения, экспрессирующие витальные гены для визуального цикла и способные к фагоцитозу. Трансплантация происходящих из iPSC клеток RPE в RCS крыс продемонстрировала улучшение зрительной функции спустя 13 недель (Buchholz et al., 2009; Carr et al., 2009; Liao et al., 2010; Meyer et al., 2009; Osakada et al., 2009). Одна группа в Японии (Hirami et al., 2009) планирует клиническое испытание с использованием происходящих из iPSC клеток RPE для лечения AMD. Это будет первым клиническим испытанием с использованием iPSCs у человека.

Болезни, которые вызываются прежде всего дефектами одиночных генов, такие как STGD, представляют существенное затруднение для базирующейся на iPSC терапии. Это из-за того, что iPSCs , генерируемые от больных индивидов, а также их дифференцированное потомство всё ещё содержат вызывающую болезнь генетическую аномалию. Были разработаны стратегии получения генетически корректных iPSCs до дифференцировки и трансплантации. Проверка принципа этого подхода проведене Meyer с колл., которые скорректировали мутацию в гене, ornithine aminotransferase. который вызывает спиралеобразную (gyrate) атрофию у пациентов, происходящих из iPSCs (Meyer et al., 2011). Генетически скорректированные клетки затем дифференцировали в клетки RPE, как было установлено, обладают нормальными уровнями ornithine aminotransferase, по сравнению с нескорректированными линиями с gyrate атрофией родительсткими iPSC (Meyer et al., 2011). В случае AMD, генетические манипуляции могут быть необязательны, поскольку AMD это полигенное нарушение системного происхождения и поэтому коррекции одиночного гена не дадут тотального излечения. Более того, главный удар при AMD это износ с годами низкой степени системного воспаления и ожидается, что простого омоложения поврежденной ткани будет достаточно, чтобы 'повернуть часы вспять' и смягчить симптомы.

Базирующаяся на iPSC клеточная терапия предоставляет обнадеживающий путь для регенеративной медицины и может быть провозвестником персонализованной медицины. iPSCs также устраняют многие этические препятствия по сравнению с о стволовыми клетками из эмбрионов и кроме того, может быть нацелена на индивидов. Однако, имеются некоторые вопросы, которые д. быть полностью исследованы прежде, чем iPSCs смогут быть широко использованы в клинической практике. Хотя они рассматриваются как функциональный эквивалент для ESCs, iPSCs, как было установлено, обладают незначительными отличиями в экспрессии генов и в метилировании ДНК (Doi et al., 2009), поэтому необходимо с осторожностью экстраполировать базирующуюся на ESC терапию на iPSCs. Более того, имеются сообщения о точковых мутациях и вариациях копий генов в iPSCs (Gore et al., 2011), это ставит вопрос о возможно безопасности. Также наблюдалось, что хромосомные теломеры значительно короче в линиях iPSC по сравнению с нативным RPE (Kokkinaki et al., 2011). Длина теломер является маркером зарождения клетки, с более короткими теломерами связаны стареющие ДНК. Это указывает на то, что базирующейся на iPSC терапии суждена сохранность и может быть необходимо более одного терапевтического вмешательства. Наконец, имеется беспокойство, что аутологические iPSCs могут быть иммуногенны, хотя этот вопрос до некоторой степени разрешается в работе Araki с колл., которые показали, что этом может быть верным только для плюрипотентных iPSCs, а не для их окончательно дифференцированного потомства (Zhao et al., 2011; Araki et al., 2013; Guha et al., 2013). Альтернативный подход к использованию аутологичных iPSCs заключается в разработке банков недифференцированных клеток, которые могут быть дифференцированы в желаемый тип клеток и трансплантированы людям leukocyte antigen-matched реципиентам (Zimmermann et al., 2012).

C неизвестными долговременными эффектами связана потенциальная запущенная экспрессия генов известных прото-онкогенов, поэтому с осторожностью необходимо манипулировать прежде чем базирующаяся на iPSC терапия сможет быть экстраполирована в клиническую среду. Более того, цена терапии настоящими аллогенными iPSC, с использованием современных технологий, д. быть очень высока для осуществления этих вмешательств в крупном масштабе при заболеваниях, таких как макулярная дегенерация.

Transplantable PRs: using stem cells as a source

Гибель фоторецепторов при AMD и STGD происходит вследствие дисфункции больного RPE. По существу омоложение или замещение RPE прекрасная площадка для старта. Однако, когда теряются PRs возникающий в результате дефицит зрения делается постоянным.Это обычное проявление при далеко зашедшей AMD (wet or dry), STGD и RP. Для таких индивидов потенциальным шагом вперёд в восстановлении зрения является замещение дегенерировавших клеток PR. Это ценная стратегия при AMD , так как было показано, что ганглиолярные клетки могут выживать в сетчатке даже при тяжелой потере PR (Medeiros and Curcio, 2001). Однако, поиск подходящего источника таких трансплантабельных клеток это следующая ступень и ограничивающий фактор. Сетчатка плода является очевидным источником предшественников сетчатки, которые обладают потенциалом реинтегрировать в дегенерирующую сетчатку. Предшественники сетчатки, изолированные из ткани плода были трансплантированы в пространство под сетчатку у мышей и людей с потерей PR lи наблюдалось улучшение зрительного поведения у мышей (Humayun et al., 2000; MacLaren et al., 2006; Pearson et al., 2012; Radtke et al., 2004). Однако, как было установлено, (MacLaren et al., 2006) только жизнеспособные клетки, которые интегрировали в зрелую сетчатку и дифференцировались в функциональные палочковидные PRs были теми, которые уже были детерминированы к PR судьбе.

При переносе с мышиных моделей на человека встречаются два основных препятствия: во-первых, ограниченность доступности плодных тканей; и во-вторых, что эквивалентная эмбриональная стадия , пригодная для получения клеток, возникает только после 13 недель беременности, что ведет к существенным этическим затруднениям. Оба эти вопроса могут быть существенно смягчены при использовании плюрипотентных стволовых клеток. В 2006, Lamba et al. получили PRs из hESCs-, происходящих из эмбриоидных тел, растущих в культуральной среде для нейронов с добавлением IGF1, noggin (NOG) и DKK1 (Lamba et al., 2006). Сходные протоколы, некоторые из которых не содержат NOG для этого периода (Banin et al., 2006) или с добавлением LEFTY (Mellough et al., 2012; Meyer et al., 2011; Osakada et al., 2009) также были описаны и давали отличающиеся благоприятные исходы. Более того, PRs были также получены из мышиных и человеческих iPSCs (Hirami et al., 2009).

Недано было показано, что культивирование в условиях относительной гипоксии с добавлением DKK1, LEFTY, activin A и др. факторов значительно увеличивает выход PR из мышиных ESCs. Относительная гипоксия (2% O₂) наиболее близка к тканевой нормоксии in utero, следовательно, воспроизводятся условия эмбриогенеза, что может объяснить более высокий выход (Garita-Hernandez et al., 2013).

Несмотря на наблюдения, что трансплантации только PR могут восстанавливать зрительную реакцию у мышиных моделей простых заболеваний (MacLaren et al., 2006), чтобы подтвердить, что любой трансплантат PR при далеко зашедшей связанной с возрастом болезни, скорее всего, что замещение RPE также будет необходимо, чтобы воспроизвести здоровые условия. С этим согласуется то, что жизнеспособность предшественников PR увеличивается при совместном культивировании с hESC, происходящими из RPE (Zhu et al., 2011), подтверждая, что двойное замещение, скорее всего, наиболее подходящая стратегия. Более того, недавние разработки предусматривают формирование всего оптического бокала из мышиных ESCs (Eiraku et al., 2011) и hESCs (Nakano et al., 2012) при росте в качестве агрегатов клеток в условиях минимальной сренды. Такой источник стратифицированной нейральной сетчатки и RPE в одном комплексе может быть также потенциальным способом формирования двойных RPE/PR трансплантатов, которые могут быть использованы у индивидов на поздних стадиях болезни с тяжелой потерей нейральной части сетчатки и RPE.

Conclusions

Stem cell transplantation for retinal disease is currently transitioning from over a decade of preclinical research to phase I/II clinical trials. The results of these trials are keenly anticipated, not just regarding efficacy but also to elucidate the levels of immunosuppression required, the difference between RPE replacement and paracrine models, and to determine which delivery method is preferable. Further trials are expected to help determine whether an RPE suspension is adequate or whether an RPE monolayer is required to rescue retinal function. The transplantation of iPSC-derived RPE will be one of the first clinical applications of iPSCs and will help to define how immunogenic iPSCs are in comparison with hESCs. In addition, further preclinical research is under way to develop a source of PRs from stem cells that can be used for neural retinal replacement. The therapeutic application of stem cells for retinal disease has thus begun. Whether this approach will be an effective treatment is the first and most important issue to address.

Stem cells in retinal regeneration: past, present and future Conor M. Ramsden, Michael B. Powner, Amanda-Jayne F. Carr, Matthew J. K. Smart, Lyndon da Cruz and Peter J. Coffey Development 2013 Vol.140, 2576-2585.

Stem cells in retinal regeneration: past, present and future
Conor M. Ramsden, Michael B. Powner, Amanda-Jayne F. Carr, Matthew J. K. Smart, Lyndon da Cruz and Peter J. Coffey
Development 2013 Vol.140, 2576-2585.