Семейство генов leucine-rich repeat (LRR)-containing G-protein-coupled receptor 4/5/6 (Lgr4/5/6) было первоначально идентифицировано посредством скрининга in silico кДНК, которые кодируют белки с гомологией классу гликопротеиновых гормональных рецепторов G-protein-coupled receptors (GPCRs) (Hsu et al., 2000; Hsu et al., 1998; McDonald et al., 1998). Не смотря на интенсивные попытки de-orphanize эти рецепторы, чтобы расшифровать их функции in vivo? их эндогенные лиганды оставались неуловимыми более 10 лет. Стандартные подходы к нокауту генов были приспособлены для изучения функций Lgr4/5/6 у мышей. Эти исследования выявили множественные роли Lgr4/5/6 во время эмбрионального развития и для гомеостаза взрослых тканей (Barker and Clevers, 2010). Недавний взрыв интереса к этим рецепторам стал результатом идентификации их как маркеров стволовых клеток у взрослых с важной ролью в регуляции активности стволовых клеток в разных тканях взрослых (Barker et al., 2010; Barker et al., 2007; Jaks et al., 2008; Leushacke and Barker, 2012; Snippert et al., 2010a). Эта важная находка существенно улучшила наше понимание биологии эпителиальных стволовых клеток в многочисленных самообновляющихся тканях и также облегчила разработку новых методов культивирования и трансплантационных технологий, которые безусловно ускорят прогресс в направлении базирующейся на стволовых клетках терапии и персанолизированной медицины.

Lgr proteins: structure and evolution

Lgr белки это уникальный класс эволюционно законсервированных seven-transmembrane (7TM) рецепторов, характеризующихся крупным внеклеточным доменом (эктодоменом), который содержит множественные несовершенные копии доменов взаимодействия с белком leucine-rich повторов (Fig. 1A). Эктодомен обеспечивает связывание лиганда как обязательного условия для модуляции нижестоящих внутриклеточных сигнальных путей посредством гетеротримерных G-белков. Fig. 1.

Lgr семейство белков может быть подразделено на три основные группы (A, B и C), в соответствии с относительным количеством LRRs в их эктодомене, а также в соответствии с присутствием или отсутствием домена low-density lipoprotein receptor class A domain (LDLa) и структуры шарнирного региона, соединяющего 7TM регион с доменом LRR (Kajava, 1998; Van Hiel et al., 2012) (Fig. 1B). Типа A рецепторы с длинными шарнирными регионами и 7-9 LRRs в своем эктодомене, включают гликопротеиновые гормональные рецепторы follicle-stimulating hormone receptor (FSHR), luteinizing hormone receptor (LHR) and thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR). Типа C рецепторы обладают сходными количествами LRRs, но отличаются присутствием короткого шарнирного региона и LDLa мотива. Эта подгруппа включает relaxin гормональные рецепторы Lgr7 и Lgr8 (Hsu et al., 2000; Kumagai et al., 2002). Механизм сигнальной трасдукции посредством рецепторов типа A и C изучен довольно хорошо. Гормон соединяясь с эктодоменом вызывает конформационные изменения в rhodopsin-подобном serpentine регионе, приводя к активации гетеротримерных G-белков, которые связаны с внутриклеточной петлей и к последующему подъёму уровней цАМФ, с одновременной активацией путей передачи внутриклеточных сигналов (Vassart et al., 2004).

Семейство рецепторов типа B, включая Lgr4, Lgr5 и Lgr6, характеризуется присутствием 16-18 LRRs в эктодомене. Оно впервые были идентифицировано как сильно схожий подкласс гликопротеиновых гормональных рецепторов с семейством GPCR (Hsu et al., 2000; Hsu et al., 1998; McDonald et al., 1998). Последующий филогенетический анализ выявил существование Lgr4-6 гомологов во всем царстве животных, включая формы древней жизни, такие как Cnidaria и Placozoa (Luo and Hsueh, 2006; Van Hiel et al., 2012). Это отражает их общий источник происхождения и их, скорее всего, функциональную важность. Мушиный ортолог Lgr2 был идентифицирован в качестве рецептора для нейрогормона Bursicon, a cysteine-knot белок, участвующий в затвердении кутикулы (Luo et al., 2005; Mendive et al., 2005). Однако усилия оценить функции in vivo Lgr4-6 у позвоночных оказывались безуспешными белее 10 лет из-за неспособности обнаружить эндогенные лиганды или сигнальные трансдукционные каскады, которые они контролируют. В 2012, однако, были идентифицированы секретируемые Wnt агонисты R-spondins (RSpo1-4) в качестве эндогенных лигандов для этого класса рецепторов, выявив критическую роль Lgr белков в гомеостазе стволовых клеток ЖКТ (Carmon et al., 2011; Carmon et al., 2012; de Lau et al., 2011; Glinka et al., 2011; Ruffner et al., 2012). Неожиданно, эта роль усиления передачи сигналов Wnt была обнаружена независимой от активации GPCR, подчеркнув ещё сильнее функциональную дивергенцию семейства Lgr4-6 от Type A и C рецепторов (de Lau et al., 2011). Однако оставалась возможность, что могут существовать др. эндогенные лиганды, которые могут опосредовать свои эффекты посредством более обычного пути активации GPCR.

The emergence of Lgr5 as a Wnt-regulated stem cell marker candidate

Каноническая передача сигналов Wnt, как известно, является главным регулятором эпителиального обновления во многих органах взрослых, которая обладает высокой скоростью обновления и также участвует в управлении развития и роста многих раковых опухолей человека посредством нарушения её регуляции (Clevers and Nusse, 2012). В кишечнике это подчеркивается быстрым устранением обновления после удаления сигнальной активности Wnt (Korinek et al., 1998; van Es et al., 2012a) и, напротив, мощной гиперпролиферацией при системном применении агонистов Wnt, таких как Rspo1 (Kim et al., 2005).

Lgr5 впервые был идентифицирован в качестве гена мишени для Wnt в линии клеток рака толстой кишки человека, несущей Wnt-активирующие мутации mutations (van de Wetering et al., 2002). Искусственное устранение этой аберрантной Wnt сигнальной активности in vitro приводило к быстрому гашению экспрессии Lgr5 и гашению экспрессии ~150 других генов. Большинство из этой 'программы' Wnt генов мишеней было позднее обнаружено экспрессирующимися в здоровых криптах тонкого кишечника, это согласуется с центральной ролью канонической передачи сигналов Wnt в регуляции эпителиального гомеостаза в этой быстро самообновляющейся ткани (Munoz et al., 2012; van der Flier et al., 2007). Каждая крипта кишечника представлена ~300 эпителиальными клетками, организованными в U-образную структуру, которая содержит смесь стволовых клеток и Paneth клеток в её основании и верхний столб из сильно пролиферирующих детерминированных клеток предшественников, обозначенных как компартмент временного умножения (Fig. 2A). Многие из Wnt генов мишеней, включая и те, кодирующие различные регуляторы клеточного цикла, широко экспрессируются по всему компартменту временного умножения крипты. Второй набор генов мишеней экспрессируется исключительно в терминально дифференцированных Paneth клетках, располагающихся в основании крипты, отражая роль передачи сигналов Wnt в управлении созревания этого клона клеток in vivo (Bastide et al., 2007; van Es et al., 2005). Очень небольшое количество генов, включая Lgr5, обнаруживает более ограниченный паттерн экспрессии в основании крипты, это позволило предположить, что они могут маркировать до сих пор не выявляемые стволовые клетки кишечника (Fig. 2A). In situ гибридизация выявила, что Lgr5 избирательно экспрессируется в популяции из 10-14 пролиферирующих клинообразных клеток, интеркалированных между клетками Paneth в основании крипты тонкого кишечника (Barker et al., 2007). Эти клетки известные как crypt base columnar (CBC) клетки, были первоначально идентифицированы и морфологически охарактеризованы с использованием ЭМ в 1970s by Hazel Cheng (Cheng and Leblond, 1974). Эти морфологически незрелые клетки позднее заняли выдающееся положение как кандидаты на роль популяции стволовых клеток после публикации модели 'stem cell zone' Hazel Cheng and Matthew Bjerknes (Bjerknes and Cheng, 1981). Эта модель описывала зону стволовых клеток, представленную CBC стволовыми клетками и дифференцированными Paneth клетками как основание крипты. Непосредственные производные CBC стволовых клеток оккупируют 'смешанную' зону непосредственно выше компартмента Paneth клеток, причем эта популяция предшественников ответственна за генерацию быстро пролиферирующих предшественников для дифференцирующихся секреторных и абсорбтивных эпителиальных популяций, выстилающих ось крипта-ворсинка. Дальнейшее исследование паттерна экспрессии Lgr5 у мышей выявило существование дискретной популяции Lgr5+ клеток в нескольких органах, включая кожу, толстый кишечник, желудок, молочные железы, язык и почки (Barker et al., 2010; Barker et al., 2012; Barker et al., 2007; de Visser et al., 2012; Jaks et al., 2008; Plaks et al., 2013; Yee et al., 2013) (Fig. 2, 3).

Validating Lgr5+ populations as adult epithelial stem cells

Популяции стволовых клеток у взрослых операционно определяются по их способности генерировать все типы дифференцированных клеток для ткани, в которой они находятся (мультипотентность) и долговременной способностью к самообновлению (поддержание популяции). Локальная среда ниш играет главную роль в определении таких характеристик стволовых клеток, подчеркивая необходимость оценки 'стволовости' популяций кандидатов в их нативном окружении насколько это возможно. Отслеживание клонов in vivo, техника генетического маркирования, которая облегчает такую 'in situ' оценку стволовости (see Box 1), была в результате приспособлена для оценки характеристик стволовых клеток у Lgr5-экспрессирующих CBC клеток в тонком кишечнике мышей. Целенаправленная активация наследуемого lacZ репортерного гена в Lgr5-экспрессирующих клетках первоначально приводила к появлению lacZ+ клеток в компартменте CBC в основании крипт (Barker et al., 2007). В ходе последующей недели генерировались прогрессивно удлиняющиеся ленты lacZ+ потомков распространялись от основания крипт в направлении кончиков ворсинок (Fig. 2B). Сходные наблюдения были сделаны в толстом кишечнике, хотя скорость, с которой мигрировало lacZ+ потомство к поверхности эпителия была ниже, чем в тонком кишечнике (отражая низкую скорость оборота эпителия в этом регионе кишечника). Индивидуальные lacZ+ метки присутствовали во всех клонах эпителиальных клеток и персистировали в течение жизни, идентифицируя тем самым Lgr5+ клетки как настоящие мультипотентные, самообновляющиеся популяции стволовых клеток кишечника. In vitro, одиночные Lgr5+ CBC клетки оказывались способными генерировать самоорганизующиеся, сомообновляющиеся эпителиальные органоиды с архитектурой и композицией, которая удивительно похожа на in vivo единицы из крипт и ворсинки (Sato et al., 2009). Итак эти наблюдения идентифицировали Lgr5+ клетки в кишечнике мышей как пролиферирующие стволовые клетки, которые ответственны за способность к ежедневному самообновлению эпителиальной выстилки. Иногда кишечный эпителий переживал кондиционное устранение компартмента Lgr5+ стволовых клеток in vivo, это привело к предположению, что может существовать стойкий 'резерв' Lgr5+ популяции стволовых клеток (Kim et al., 2012). Однако недавно было предоставлено альтернативное объяснение, было показано, что секреторные клетки предшественники, экспрессирующие маркерный ген Dll1, который кодирует Notch лиганд Delta-like 1, повторно приобретают мультипотентные характеристики стволовых клеток после повреждениями вызываемого устранения Lgr5+ стволовых клеток (van Es et al., 2012b).

Box 1. In vivo lineage tracing: a brief introduction

In vivo lineage tracing is a powerful fate-mapping technique that relies on the targeted introduction of heritable genetic marks into candidate stem cell populations in situ within living tissues. Any descendants of these marked stem cell candidates will inherit the same genetic mark, thus facilitating their in situ visualization. If all differentiated cell lineages can be traced back to a single marked candidate stem cell candidate, one can conclude that this cell is multipotent. The long-term production of marked cell lineages in a given tissue demonstrates the self-renewal capacity of the stem cell candidate. A candidate cell demonstrating both multipotency and self-renewal capacity in this system fulfils the operational definition of an adult stem cell.

В отличие от традиционных методов трансплантации, которые нуждаются в устранении кандидатов стволовых клеток из их инструктивных окружений ниш, отслеживание in vivo клонов облегчает прямую оценку 'стволовости' в полностью физиологическом окружении. Однако эта техника может быть приложима только к кандидатам стволовых клеток, для которых имеются доступные одиночные, высоко специфичные маркеры у мышей.

Клетки с характерной клиновидной морфологией из мышиных Lgr5+ цилиндрических клеток из крипт также обнаруживаются перемешанными с клетками Paneth в тонком кишечнике человека. Однако, отсутствие на сегодня специфических антител к Lgr5 затрудняет усилия по установлению, являются ли Lgr5 также избирательными маркерами и этой популяции in vitro у человека. Это также ставит препятствие выделению Lgr5+ клеток человека для непосредственной оценки их характеристик стволовых клеток посредством их трансплантации или культивирования органоидов ex vivo. Однако, Batlle с коллегами успешно выделили стволовые клетки толстого кишечника человека, используя экспрессирующийся на поверхности ген мишень для Wnt, EPHB2, в качестве маркера, и они показали, что эти стволовые клетки экспрессируют наивысшие уровни lgr5 в криптах (Jung et al., 2011).

Отслеживание клонов in vivo было использовано для характеристики популяций, экспрессирующих Lgr5 в волосяных фолликулах взрослых, в дистальной части желудка у взрослых, молочных желез, вкусовых почек и эмбриональных почек, в качестве эпителиальных стволовых клеток (Barker et al., 2010; Barker et al., 2012; de Visser et al., 2012; Jaks et al., 2008; Plaks et al., 2013; Yee et al., 2013) (Fig. 3). Др., дефицитные по Lgr5 взрослые ткани обладали значительно более низким оборотом, такие как печень, отвечали острым повреждением при активации передачи сигналов Wnt, чтобы генерировать популяцию Lgr5+ стволовых клеток, которая впоследствии управляла бы эффективной регенерацией ткани (Huch et al., 2013). Учитывая центральную роль пути передачи сигналов Wnt в регенерации ткани, повреждениями индуцируемые Lgr5+ стволовые клетки могут быть обнаружены и в др. взрослых органах.

The mechanics of Lgr5+ stem cell-driven epithelial homeostasis in the intestine

Стволовыми клетками управляемый гомеостаз постоянно обновляет эпителиальную выстилку кишечника, нуждается в ежедневной продукции как детерминированного потомства, так и в новых стволовых клетках в течение всей жизни. Понимание, как компартмент стволовых клеток взрослых обеспечивает этот деликатный баланс in vivo, является критическим, если мы собираемся безопасно использовать ex vivo регенеративный потенциал клинически и для расшифровки того, как нарушения этого баланса вносят вклад в нарушения, такие как раковые опухоли ЖКТ. В твердых тканях, стволовые клетки взрослых обычно рассматриваются как достигшие этого баланса посредством облигатных асимметричных делений, генерирующих одну стволовую дочернюю клетку и одну детерминированную клетку предшественницу. В самом деле стволовые клетки в кишечнике Drosophila, по-видимому, подвергаются таким асимметричным делениям повседневно in vivo (Goulas et al., 2012). Хотя опубликованы ограниченные доказательства в подтверждение сходного способа точных асимметричных делений стволовых клеток в кишечнике мышей (Quyn et al., 2010), недавние исследования предоставили неотразимые доказательства превалирования стохастических, симметричных клеточных делений в компартменте Lgr5+ стволовых клеток. Строжайшие доказательства этого предоставлены отслеживанием многоцветных клонов, которые облегчают картирование судеб индивидуальных Lgr5+ стволовых клеток внутри популяции крипты (Snippert et al., 2010b). Кратковременное отслеживание продемонстрировало, что симметричные деления преобладают в компартменте Lgr5+ стволовых клеток - т.е., Lgr5+ стволовые клетки редко генерируют дочерние клетки, которые принимают разные судьбы (стволовая клетка в противовес детерминированной клетке предшественнице). Анализ долговременного отслеживания выявил постепенный сдвиг в направлении клональности (доказываемый превращением многоцветного пула стволовых клеток со временем в одноцветную популяцию у мышей). Итак, эти находки показывают, что Lgr5+ стволовые клетки удваивают свое количество ежедневно и стохастически воспринимая судьбу или стволовых клеток или детерминированных клеток предшественников. Пока количества симметричных делений, дающих или стволовые клетки или детерминированное потомство сбалансированы, поддерживается гомеостаз. Schepers et al. независимо продемонстрировали, что Lgr5+ кишечные стволовые клетки сегрегируют свои хромосомы случайно во время митозов, это согласуется с идеей, что выбор судеб вследствие деления стволовой клетки является стохастическим скорее, чем предопределен избирательным расхождением генетического материала (Schepers et al., 2011). К сходному заключению пришли в независимо исследовании, связанным преимущественно с математическим моделированием гомеостаза, управляемого стволовыми клетками (Lopez-Garcia et al., 2010).

Лежащие в основе молекулярные механизмы, которые управляют делениями Lgr5+ кишечных стволовых клеток всё ещё не расшифрованы. Как локальное биомеханическое, так и ниш влияние, скорее всего, являются средством в управлении выбора судеб стволовыми клетками, но их технологии затруднительны при аккуратной оценке этого in vivo. Недавно разработанные компьютерные модели (Buske et al., 2011; Buske et al., 2012) могут быть здесь важной альтернативой, однако ценность результатов любого из предсказаний всё ещё необходимо доказывать в физиологических испытаниях. Др. важный вопрос,который необходимо исследовать, включает влияние генетических и эпигенетических мутаций на исходы делений стволовых клеток, которые необходимы для понимания, как аномальные стволовые клетки вызывают рак. Было бы также важно определить, могут ли Lgr5+ взрослые стволовые клетки в др. тканях использовать сходные механизмы для достижения тканевого гомеостаза in vivo.

Mining the Lgr5+ stem cell expression signature for mechanistic insight and novel markers

Открытие Wnt мишени гена Lgr5 в качестве общего экспрессирующегося на поверхности маркера взрослых стволовых клеток в пределах ткани, отличающейся онтогенетическим происхождением и с сильно отличающимися функциями, стало довольно неожиданным. Глубокий анализ глобального профиля экспрессии гена с помощью микрочипов показало, что эта общая экспрессия Lgr5 отражает общую зависимость разных пулов стволовых клеток от канонической передачи сигналов Wnt. Однако помимо этого перекрывания в экспрессии генов мишеней для Wnt, индивидуальная генная экспрессия 'signatures' пула стволовых клеток кожи, желудка и кишечника высоко отлична, возможно отражает разнообразие локальных необходимых условий ниш, в которых они пребывают (Barker et al., 2010; Jaks et al., 2008; Munoz et al., 2012; van der Flier et al., 2007).

Возможно лучше всего охарактеризованной популяцией является Lgr5+ популяция стволовых клеток кишечника, которая подходит для независимых транскриптомных и протеомных подходов (Munoz et al., 2012; van der Flier et al., 2007). В отсутствие хорошо подтвержденного Lgr5 антитела способны облегчить выделение Lgr5-экспрессирующих эпителиальных популяций ex vivo, Lgr5-EGFP репортерные мыши были использованы для выделения Lgr5-EGFPhi стволовых клеток и их Lgr5-EGFPlo потомства из тонкого кишечника. Сравнительное профилирование экспрессии популяций этих стволовых и дочерних клеток идентифицировало ~500 генов, концентрирующихся внутри компартмента стволовых клеток. Из них лишь горстка (помимо Lgr5) избирательно экспрессировалась в кишечных стволовых клетках, включая Ascl2, Olfm4 (olfactomedin 4), Smoc2, RNF43 и Troy. Ascl2 кодирует Achaete scute-like 2, члена семейства basic helix-loop-helix (BHLH) транскрипционных факторов, которые играют жизненно важную роль в поддержании жизнеспособности стволовых клеток in vivo (van der Flier et al., 2009). Smoc2 (SPARC-related modular calcium binding 2) является матрично-клеточным белком, с помощью которого обеспечивается избирательное ингибирование передачи сигналов BMP на стволовых клетках (Munoz et al., 2012), процесс, как известно, важный для обеспечения стволовости популяций эпителиальных клеток (Haramis et al., 2004). RNF43, E3 ubiquitin ligase и Troy (Tnfrsf19 - Mouse Genome Informatics), член семейства рецепторов фактора некроза опухолей, являются генами мишенями для Wnt, как полагают, участвуют в петлях негативной обратной связи, которая тонко контролирует уровни передачи сигналов Wnt в компартменте стволовых клеток (Fafilek et al., 2012; Hao et al., 2012; Koo et al., 2012a).Интересно, что три дополнительных гена, Bmi1 (a polycomb ring finger oncogene), Lrig1 (leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domain 1) и Hopx (HOP homeobox) мощно экспрессируются в компартменте Lgr5+ стволовых клеток, в кажущемся противоречии с предполагаемыми их качественными особенностями как маркеров Lgr5-независимого пула стволовых клеток, принимая во внимание их существование в позиции +4 выше основания крипты (Powell et al., 2012; Sangiorgi and Capecchi, 2008; Takeda et al., 2011).

Exploiting the potential of Lgr5+ stem cells for regenerative medicine

Наша способность идентифицировать и очищать популяции Lgr5+ стволовых клеток из ряда взрослых тканей открывает замечательные возможности использовать их в медицине. Ex vivo культуральные системы, которые способны поддерживать свойства стволовых клеток в очищенных популяциях во время их последующих экспансии или манипуляций (напр., посредством генной терапии), или системы. которые поддерживают их способность продуцировать новые функциональные эпителии для ортотопических трансплантаций, важны для реализации их клинического потенциала. Однако это не так просто разработать ex vivo культуральные системы, которые бы аккуратно воспроизводили очень сложные биохимические и биомеханические свойства эндогенных ниш стволовых клеток. На сегодня нет систем, пригодных для поддержания и увеличения чистых популяций Lgr5+ стволовых клеток ex vivo. Однако, Sato с коллегами успешно разработали культуральную систему, базирующуюся на Matrigel для роста самообновляющихся кусочков кишечного эпителия из очищенных Lgr5+ стволовых клеток (Sato et al., 2009). Используя обширные знания по сигнальным путям, которые регулируют управляемый с помощью стволовых клеток гомеостаз кишечного эпителия in vivo, они разработали 3D культуральную систему, включающую богатый laminin Matrigel и определенный коктейль факторов, включая Wnt агонист R-spondin1, Bmp ингибитор Noggin, epidermal growth factor (Egf), Notch лиганд jagged 1 и низкомолекулярный ингибитор Rock1 (Y27632). Эта система подтвердила рост кишечных 'organoids' из одиночных Lgr5+ клеток, выделенных из тонкого кишечника мыши, убедившись, что они обладают характеристиками стволовых клеток. Удивительно, что базовая архитектура и состав этих эпителиальных органоидов очень сильно напоминают кишечную выстилку in vivo; органоиды содержат множественные структуры крипт, представленных интеркалированными популяциями стволовых клеток и Paneth клеток в их основании и соседних TA клеток предшественников, связанных с регионами, похожими на ворсинки, представленными дифференцированными энтероцитами, goblet клетками, энтероэндокринными клетками и tuft клетками. После механической диссоциации фрагменты крипт быстро вырастали в новые органоиды с формированием de novo крипт, управляемых с помощью процесса, который напоминает разделение крипт. Модификации этой культуральной системы тонкого кишечника, чтобы включить Wnt3A, облегчает рутинный рост органоидов колона мышей из изолированных крипт толстого кишечника, хотя удаление Wnt3A из возникших культур органоидов необходимо, чтобы сделать возможной дифференцировку в направлении зрелых эпителиальных клонов (Sato et al., 2011a). Общим признаком этого культивируемого эпителия является отсутствие любой ассоциированной стромы, которая как полагают важна для обеспечения специализированных условий ниш, чтобы закрепить поддержать популяцию стволовых клеток. Поиск потенциального in vivo эпителиального источника ростовых факторов ниш показал, что Paneth клетки, которые интимно ассоциированы с Lgr5+ стволовыми клетками в основании крипт, являются жизненно важным источником Wnt3, Egf и Notch лигандов (Sato et al., 2011b). В самом деле, Paneth клетки абсолютно необходимы для роста органоидов ex vivo, хотя возможно, что альтернативные мезенхимные источники Wnt3 и др. факторы ниш существуют in vivo (Durand et al., 2012; Farin et al., 2012; Kim et al., 2012). Paneth клетки отсутствуют в большей части толстого кишечника, но имеющиеся данные подтверждают, что Kit+ goblet клетки выполняют сходную поддерживающую функцию для пула Lgr5+ стволовых клеток (Rothenberg et al., 2012).

Культуры органоидов колона мышей успешно использованы для репарации повреждений эпителия толстого кишечника in vivo, если доставлялись посредством обычных клизм, подчеркивая терапевтический потенциал таких эпителиальных культуральных систем для лечения ряда нарушений ЖКТ человека, таких как язвы эпителия (Fig. 4) (Yui et al., 2012). Сравнительно недавно культуральные системы были усовершенствованы для роста эпителия из тонкого и толстого кишечника человека (Jung et al., 2011; Sato et al., 2011a). Для этого необходимо добавление низкомолекулярных ингибиторов anaplastic lymphoma kinase (Alk) и p38 MAPK (Mark14 - Mouse Genome Informatics) сигнальных путей, плюс gastrin и nicotinamide к культуральным системам толстого кишечника мыши. Последующее удаление Wnt3a, nicotinamide и p38 ингибитора из установившихся культур органоидов, как было установлено, существенно для управления дифференцировкой в направлении функциональных эпителиальных клонов, снова подчеркивая существенную роль градиентов факторов роста в кишечных криптах in vivo. Помимо их потенциала для роста здорового эпителия для трансплантаций, используемых в клинике, эти новые культуральные системы у человека, как ожидается, окажутся бесценным инструментом для исследования регуляции самообновления и дифференцировки кишечных стволовых клеток человека. Можно предположить использование избирательных низкомолекулярных ингибиторов и/или агонистов ключевых сигнальных путей, таких как Wnt и Notch, или базирующихся на ретровирусах методов для эффективного подавления избранных генов, чтобы выяснить их роль в регуляции управляемого стволовыми клетками самообновления эпителия в культурах органоидов человека (Koo et al., 2012b). Др. главным применением может быть увеличение конкурирующих нормального и опухолевого эпителиев из биоптатов пациентов, как способа для генерации достаточного материала для попыток глубокого секвенирования по выявлению лежащих в основе генетических мутаций (цель персональной медицины) и для использования поиска лекарств, которые бы эффективно и избирательно уничтожали опухолвый эпителий. Fig. 4.

Lgr6 as a marker of adult stem cells in the skin

В противоположность Lgr5, экспрессия Lgr6, по-видимому, не зависит от канонической передачи сигналов Wnt у мышей, это предоставляет объяснение его отсутствия в Wnt-зависимой эпителиальной выстилке ЖКТ (Snippert et al., 2010a). Анализ Lgr6-lacZ/EGFP репортерных мышей выявил, что подобно Lgr5, экспрессия Lgr6 в основном ограничена небольшими популяциями клеток во многих органах. В коже взрослых, Lgr6 экспрессия ограничена регионом центрального перешейка, который соединяет основное вместилище стволовых клеток волосяного фолликула (выпячивание) и сальную железу (Fig. 3A). Транскрипционные и in vivo эксперименты по отслеживанию клонов показали долговременный вклад Lgr6+ клеток в сальные железы и ассоциированный межфолликулярный эпидермис, это означает, что они являются стволовыми клетками взрослых для этих кожных компартментов (Snippert et al., 2010a). Не отмечено вклада в волосяные фолликулы при физиологических условиях, это подчеркивает отличающиеся характеристики Lgr6+ стволовых клеток сальных желез и эпидермиса и пулов Lgr5+ стволовых клеток волосяных фолликулов (Jaks et al., 2008; Snippert et al., 2010a). Напротив, и Lgr5+ и Lgr6+ компартменты стволовых клеток активно вносят вклад в репарацию эпидермиса после острых ран (Kasper et al., 2011; Snippert et al., 2010a). Отслеживание клонов во время позднего эмбриогенеза выявляет вклад Lgr6+ клеток во все компартменты кожи, включая волосяные фолликулы, указывая тем самым, что предназначенное для Lgr5+ стволовых клеток волосяного фолликула хранилище во взрослой коже происходит из эмбриональных Lgr6+ клеток, располагающихся в развивающемся эпидермисе.

Lgr proteins: functions and mechanisms of action in adult stem cells

Большинство из того, что мы знаем о функциях in vivo Lgr4, Lgr5 b Lgr6 получено в результате детального фенотипического анализа мышей, несущих нулевые или кондиционные потери функции мутации (Table 1). Lgr4 широко экспрессируется в пролиферативных компартментах многих эмбриональных и взрослых тканей in vivo (Van Schoore et al., 2005) и не являются сюрпризом, что мутации потери функции членов этого семейства негативно сказываются на развитии или функциях множественных органов, включая почки, печень, молочные железы, кишечник репродуктивный тракт и кожу (Barker and Clevers, 2010; Kato et al., 2006; Kato et al., 2007; Mohri et al., 2008; Mohri et al., 2011; Mohri et al., 2012; Mohri et al., 2010; Mustata et al., 2011; Oyama et al., 2011). Как результат такие плейотропные эффекты Lgr4-нулевых мутаций обычно фатальны. Lgr5-нулевые мыши всегда погибают в течение 24 ч после рождения из-за черепно-лицевых дефектов, напоминающих дефекты у человека при ankyloglossia, что не позволяет им сосать материнское молоко (Morita et al., 2004). Др. крупных фенотипических отклонений не обнаруживается на этой стадии развития, это возможно объясняется увеличением количества Paneth клеток в кишечнике intestine (Garcia et al., 2009). Напротив, Lgr6-нулевые мыши mice здоровы и плодовиты без видимых фенотипических аномалий (Snippert et al., 2010a). Table 1.

Reported Lgr tissue expression patterns and related loss-of-function phenotypes in mice

Неожиданно, кондиционное устранение функции Lgr5 в кишечном эпителии у взрослых мышей не оказывает заметного эффекта на эпителиальный гомеостаз (de Lau et al., 2011), тогда как кондиционная делеци Lgr4, который обычно экспрессируется по всем кишечным криптам, ведет к заметной редукции клеточной пролиферации, что согласуется с нарушением функции компартмента временной амплификации, вместе с редукцией дифференцировки Paneth клеток (de Lau et al., 2011; Mustata et al., 2011). Однако, наиболее сильный фенотип наблюдается после одновременного устранения Lgr5 и Lgr4, это вызывает быстрое и мощное подавление программ генов мишеней для Wnt, потерю компартмента взрослых стволовых клеток и последующее блокирование возобновления эпителия (de Lau et al., 2011). Итак, эти наблюдения указывают на то, что структурно родственные рецепторы Lgr5 и Lgr4 выполняют важные, всё же перекрывающиеся, функции по поддержанию передачи сигналов Wnt в стволовых клетках. Это было подтверждено, когода секретируемые Wnt агонисты R-spondin1-4 был выявлены в качестве общих лигандов для Lgr4, Lgr5 и Lgr6 (Carmon et al., 2011; Carmon et al., 2012; de Lau et al., 2011; Glinka et al., 2011; Ruffner et al., 2012).

Метод репортерных генов продемонстрировал, что истощение Lgr белков на клеточной поверхности не нарушает способности клеток активировать внутриклеточную передачу сигналов Wnt, как показывает связывание Wnt со своим Frizzled/low-density lipoprotein receptor-related protein (Fzd/Lrp) рецепторным комплексом. Однако, истощение Lgr устраняет мощную способность R-spondin белков амплифицировать эту каноническую передачу сигналов Wnt. Точный механизм, с помощью которого образование комплекса R-spondin/Lgr обеспечивает эффект передачи сигналов Wnt, остается неясным; отсутствуют доказательства роли G protein-обеспечиваемой активации типичных внутриклеточных мессенджеров, таких как Ca2⁺ или cAMP (Carmon et al., 2011). Однако демонстрация физического взаимодействия между Lgr белками и Fzd/Lrp6 на мембране ведет к предложению модели, согласно которой связывание R-spondin с Lgr белками непосредственно влияет на скорость оборота Wnt рецепторных компонентов Fzd или Lrp6 на клеточной поверхности (Carmon et al., 2011). Т.о., Lgr белки, по-видимому, являются факультативными компонентами Wnt рецепторного комплекса, который соединяется с секретируемыми R-spondin белками, чтобы поддержать существующую каноническую передачу сигналов Wnt избирательно в чувствительных клетках (Fig. 5). Сегодня неясноunclear, секретируются ли R-spondin лиганды локально в тканях. экспрессирующих Lgr, или они доставляются посредством кровеносной системы от более удаленных источников (de Lau et al., 2012). Fig. 5.

Ограниченная экспрессия Lgr5 в кишечных стволовых клетках может, следовательно, может рассматриваться как средство для амплификации канонических Wnt сигналов выше порога, совместимого с гарантией гомеостаза стволовых клеток in vivo. Как упоминалось выше E3 ubiquitin лигаза Rnf43 и опухолевый супрессор Troy являются генами мишенями для Wnt, они обнаруживаются на высоких уровнях в стволовых клетках; недавние исследования выявили их участие в тонкой доводке передачи сигналов Wnt в компартменте кишечных стволовых клеток. Rnf43 тушит передачу сигналов Wnt путем убиквитинирования Fzd рецепторных белков, тем самым нацеливая их на деградацию (Hao et al., 2012; Koo et al., 2012a). Troy рекрутируется на Wnt рецепторный комплекс благодаря непосредственному взаимодействия с Lgr белками, где они дестабилизируют Lrp6 корецептор на клеточной поверхности и тем самым снижают каноническую передачу сигналов Wnt (Fafilek et al., 2012). Возникает картина, в которой кишечные стволовые клетки участвуют как врожденный набор позитивных- и негативных-feedback регуляторов, чтобы увеличить силу канонической передачи сигналов Wnt, позволяя тем самым им гарантировать эффективный гомеостаз стволовых клеток in vivo. Важно установить, действуют ли Lgr5+ популяции стволовых клеток в др. взрослых тканях, таких как желудок или кожа, подобно гомеостатическим механизмам Wnt.

Perspectives

The discovery of Lgr stem cell markers and their R-spondin ligands has had a major beneficial impact on our understanding of stem cell biology in a range of rapidly renewing tissues. It has also been instrumental in facilitating the development of near-physiological epithelial culture systems that provide a renewable source of biological material for studying adult stem cells and the regulation of epithelial renewal in isolation. These culture systems also support the massive expansion of Lgr-expressing stem cells from limited quantities of starting material, such as patient biopsies. This is expected to facilitate the development of gene therapy-based approaches for treating genetic diseases, as well as providing a source of healthy tissue type-matched epithelia for treating epithelial diseases such as chronic gastrointestinal tract ulcers. A particularly exciting application of this culture technology is the ability to grow sufficient quantities of matched healthy and tumor epithelia from patient biopsies for use in personalized drug-screening. Such deep sequencing efforts can be used as a means of designing treatment regimes that deliver maximal therapeutic benefit. The exciting discovery of damage-induced Lgr5+ stem cells in the liver has potentially important regenerative medicine implications. Future studies should focus on investigating whether similar regeneration-specific Lgr5+ stem cells are present in other adult organs.

Important advances have also been made in defining the roles of Lgr-expressing stem cells in driving the initiation and progression of gastrointestinal tract cancers (Barker et al., 2009; Schepers et al., 2012) (see Box 2). The identification of Lgr5 as a marker of cancer stem cells in intestinal tumors (Kemper et al., 2012; Schepers et al., 2012) is expected to expedite their isolation and expression profiling as an essential prerequisite to developing more effective cancer therapeutics. Future studies are needed to determine whether Lgr5 is marking cancer stem cell populations in other tissues maintained by Lgr5+ stem cells, such as the stomach. A major challenge will be to selectively kill the Lgr5+ cancer stem cells without damaging the healthy Lgr5+ stem cell pool needed to maintain healthy epithelia.

Box 2. Tumor-resident Lgr5+ cells: cancer stem cells?

Cancer stem cells are considered to be discrete populations of tumor-resident stem cells that are responsible for tumor growth and progression. Targeting their elimination is expected to be a highly effective cancer therapy – hence the interest in identifying and characterizing these populations in human cancers. Aberrant activation of Wnt signaling in normal leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5-positive (Lgr5+) intestinal stem cells is considered to be the major route to colon cancer formation (Barker et al., 2009). The resulting intestinal tumors also contain a small population of Lgr5+ cells, prompting speculation that these could be cancer stem cells. In vivo lineage tracing has recently demonstrated that these Lgr5+ cells in tumors do indeed contribute to tumor growth in mice (Schepers et al., 2012). Human colorectal cancers also contain Lgr5+ cells, which are reported to be the only tumor population capable of sustaining spheroid culture in vitro (a surrogate assay for cancer stem cell activity) when purified using antibodies (Kemper et al., 2012). The next challenge will be to develop ways of selectively killing these Lgr5+ cancer stem cells without damaging the healthy Lgr5+ stem cells that are essential for maintaining our intestinal epithelium

Lgr proteins in epithelial stem cell biology Nick Barker, Shawna Tan and Hans Clevers Development 2013 Vol.140, 2484-2494.

Lgr proteins in epithelial stem cell biology
Nick Barker, Shawna Tan and Hans Clevers
Development 2013 Vol.140, 2484-2494.