WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
Polycomb complexes in stem cells and embryonic development | |
Polycomb group (PcG) proteins are epigenetic modifiers involved in controlling gene repression. Organized within multiprotein complexes, they regulate developmental genes in multiple cell types and tissue contexts, including embryonic and adult stem cells, and are essential for cell fate transitions and proper development. Here, we summarize recent breakthroughs that have revealed the diversity of PcG complexes acting in different cell types and genomic contexts. Intriguingly, it appears that particular PcG proteins have specific functions in embryonic development, in pluripotent stem cells and in reprogramming somatic cells into a pluripotent-like state. Finally, we highlight recent results from analyzing PcG protein functions in multipotent stem cells, such as neural, hematopoietic and epidermal stem cells. Рисунки к статье |
Хотя стволовые клетки открыты давно (Till and McCulloch, 1961; Spangrude et al., 1988), их потенциал в качестве модельных клеток для изучения дифференцировки, тканевого гомеостаза и регенерации только начинает реализовываться. В частности, embryonic stem cells (ESCs), которые являются плюрипотентными клетками, дающими все типы клеток эмбриона (Boiani and Scholer, 2005), предоставляют ценный инструмент для изучения эмбрионального развития in vitro.
Идентифицировано несколько транскрипционных факторов в качестве основных регуляторов плюрипотентности и мультипотентности стволовых клеток (Niwa, 2007). Растут доказательства, подтверждающие, что эпигенетические модификации также играют критическую роль в регуляции характеристик стволовых клеток. Среди модификаторов хроматина, белки Polycomb group (PcG) функционируют в качестве генов репрессоров и участвуют в регуляции характеристик стволовых клеток (Simon and Kingston, 2009). PcG первоначально была описана как набор генов, ответственных за за контроль собственно сегментации тела Drosophila (Lewis, 1978). Во время эмбрионального развития Drosophila белки PcG репрессируют гомеобоксные гены кластера Hox, детерминируя тем самым соотв. активацию гомеозисных генов (Schuettengruber and Cavalli, 2009). Функция белков PcG как репрессоров генов развития строго законсервирована у млекопитающих (Morey and Helin, 2010). Здесь мы обсудим последнюю информацию о PcG-обеспечиваемой эпигенетической регуляции стволовых клеток и эмбрионального развития. Molecular activities of PcG complexes У млекопитающих белки PcG обнаруживаются в нескольких мультибелковых комплексах (Simon and Kingston, 2009), наиболее охарактеризованными из которых являются Polycomb repressive complexes 1 and 2 (PRC1 and PRC2) (Margueron and Reinberg, 2011). В качестве эпигенетических модификаторов PcG комплексы способствуют репрессии генов посредством определенных модификаций и сжатий хроматина (Fig. 1).
Здесь мы лишь кратко рассмотрим молекулярные механизмы, с помощью которых PcG комплексы регулируют экспрессию генов, см. reviews (Lanzuolo and Orlando, 2012; Simon and Kingston, 2013). На молекулярном уровне PRC2 ответственна за ди- и три-метилирование лизина 27 гистона H3 (H3K27me2/me3), которые выступают в качестве репрессивных эпигенетических меток (Fig. 1A) (Cao et al., 2002; Czermin et al., 2002; Kuzmichev et al., 2002; Muller et al., 2002). PRC1, напротив, обеспечивает моноубиквитилирование гистона H2A, которое нарушает транскрипционную элонгацию (Stock et al., 2007) и является критическим для репрессии генов (Endoh et al., 2012) (Fig. 1B). PRC1 также репрессирует гены посредством механизма, такого как уплотнение хроматина (Fig. 1C) (Francis et al., 2004; Endoh et al., 2012) и снижения оборота нуклеосом (Deal et al., 2010). Кроме того, он участвует в репрессии H2AK119ub метки, важной для удаления PRC1 из хроматина, тем самым делая возможной активацию генов в ответ на стимулы дифференцировки (Richly et al., 2010). PRC2 components in mammals Стержневой комплекс PRC2 у Drosophila формируется с помощью Enhancer of zeste [E(z)], Suppressor of zeste [Su(z)] и Extra sexcombs (Esc) (Table 1). У млекопитающих, Ezh1 и Ezh2, гомологи E(z), являются гистоновыми метилтрансферазами, ответственными за ферментативную активность PRC2 (Margueron et al., 2008). Др. стержневые компоненты PRC2, которые представлены гомологом Su(z), Suz12, и гомологом Esc, Eed, необходимы для сборки комплекса и для собственно ферментативной активности (Cao and Zhang, 2004; Pasini et al., 2004; Ketel et al., 2005). Пока неясно, как PRC2 рекрутируется на ДНК у млекопитающих (as discussed below). Было предположено, что Jumonji/ARID домен-содержащий белок Jarid2 (Peng et al., 2009; Shen et al., 2009; Li et al., 2010; Pasini et al., 2010) и члены семейства Polycomb-like белки Pcl, ответственны за рекрутирование PRC2 на гены мишени у млекопитающих, хотя и с помощью разных механизмов (Walker et al., 2010; Ballare et al., 2012; Brien et al., 2012; Hunkapiller et al., 2012; Musselman et al., 2012). Домен ARID в Jarid2 соединяется непосредственно с ДНК, обогащенной GC и GA динуклеотидами, тогда как домен Tudor белков Pcl распознает метилированный H3K36, гистоновую метку, которая ассоциирована с элонгацией транскриптов. Это указывает на то, что белки семейства Pcl облегчают PcG-обеспечиваемое молчание ранее активных генов. Более того, тот факт, что Jarid2 и Pcl белки, как полагают, не присутствуют в одних и тех же комплексах (Ballare et al., 2012) , указывает на то, что в клетках млекопитающих присутствуют и отличающиеся PRC2 комплексы, нацеленные на разные гены. Table 1. Essential role of selected PRC1 and PRC2 components in embryonic development and stem cells PRC1 components in mammals У Drosophilaстержневой комплекс PRC1 формируется с помощью Polycomb (Pc), Polyhomeotic (Ph), Posterior sex combs (Psc) и Sex combs extra (Sce, также известен как Ring) (Morey and Helin, 2010). У млекопитающих состав PRC1 более разнообразен и варьирует в зависимости от клеточного содержимого (Table 1) (Gao et al., 2012; Luis et al., 2012). Все PRC1 комплексы содержат гомологи белка Drosophila Ring. Ring1A и Ring1B (которые также известны как Rnf1 и Rnf2, соотв.) являются E3 ubiquitin лигазами (de Napoles et al., 2004; Leeb and Wutz, 2007), которые наделяют лизин 119 гистона H2A одной ubiquitin группой (H2AK119ub) (Wang et al., 2004a). Гомологи Drosophila Psc, такие как Mel18 (Pcgf2) или Bmi1 (Pcgf4), регулируют ферментативную активность PRC1 (Brunk et al., 1991; Kanno et al., 1995).
PRC1 комплексы могут быть подразделены на, по крайней мере, два класса в соотв. с присутствием или отсутствием Cbx белков, которые являются гомологами Drosophila Pc. Канонические PRC1 комплексы содержат Cbx белки, которые распознают и соединяются с H3K27me3, меткой, откладываемой с помощью PRC2 (Table 1). Следовательно, канонические PRC1 и PRC2 комплексы могут действовать вместе, чтобы репрессировать транскрипцию генов. Неканонические комплексы PRC1, которые содержат Rybp (вместе с дополнительными белками, такими как L3mbtl2 или Kdm2b) скорее, чем Cbx белки (Fig. 1D), были недавно описаны у млекопитающих (Garcia et al., 1999; Trojer et al., 2011; Farcas et al., 2012; Gao et al., 2012; Hisada et al., 2012; Qin et al., 2012; Tavares et al., 2012; He et al., 2013; Wu et al., 2013) (Table 1). На молекулярном уровне, Rybp-PRC1 и Cbx-PRC1, как было установлено, регулируют разные наборы мишеней (Morey et al., 2013). Однако, это исследование также показало, что общий субнабор генов совместно регулируется с помощью Rybp-PRC1 и Cbx-PRC1 в стволовых клетках, показывая, что существуют тесные взаимодействия между этими отличающимися комплексами в зависимости от онтогенетического и клеточного контекста. PcG recruitment: involvement of CpG islands and DNA methylation Помимо рекрутирования посредством Jarid2 и Pcl белков, рекрутирование PRC2 ассоциирует также в крупными неметилированными CpG островками (Ku et al., 2008) посредством механизма, которые может использовать Pcl3 (Phf19) (Hunkapiller et al., 2012). Деметилирование ДНК может быть достигнуто за счет действия Tet белков (Tan and Shi, 2012) а недавние данные показали, что Tet1 необходим для связывания хроматином PRC2 (Wu et al., 2011). Более 95% PRC2 мишеней перекрываются с мишенями для Tet1 в мышиных ESCs. Истощение Tet1 ведет к нарушению рекрутирования PRC2 на большинство сайтов связывания, тогда как истощение Ezh2 не влияет на связывание Tet1, подтверждая, что Tet1 участвует в рекрутировании PcG, способствуя деметилированию CpG островков.
Как упоминалось выше, хромодомен белков Cbx распознает метку H3K27me3, откладываемую с помощью PRC2 (Fischle et al., 2003), рекрутируя тем самым канонические PRC1 комплексы и приводя к совместному занятию PRC1 и PRC2 одних и тех же локусов на хроматине (Morey et al., 2012). Однако, H3K27me3 не всегда достаточен, чтобы рекрутировать PRC1 (Schoeftner et al., 2006; Tavares et al., 2012), и, в случае неканонических PRC1 вариантов, отсутствие Cbx означает, что может быть задействован альтернативный механизм рекрутирования. Недавнее исследование на мышиных ESCs продемонстрировало роль состояния метилирования ДНК для рекрутирования PRC1 и PRC2. PRC1 компонент Kdm2b способен рекрутировать PRC1 на неметилированные CpG островки независимо от PRC2 (Farcas et al., 2012; He et al., 2013; Wu et al., 2013) (Fig. 1D). Эти данные подтверждают, что состояние метилирования CpG островков модулирует присутствие разных комплексов Polycomb. PcG functions in mammalian embryogenesis Здесь мы сконцентрируемся преимущественно на функциях PcG белков в стволовых клетках. Их роль во время эмбриогенеза выявляется посредством анализа knockout (KO) мышей по разным компонентам PcG. Эти исследования выявили ключевые функции этих белков в эмбриональном развитии, при этом мутантные эмбрионы обычно обнаруживают дефекты гаструляции. В частности, KO эмбрионы для PRC2 компонентов Suz12, Ezh2 и Eed погибают во время ранних постимплантационного развития (Faust et al., 1995; O'Carroll et al., 2001; Pasini et al., 2004). В отличие от более ранних и широких дефектов, наблюдаемых после KO стержневые PRC2 компонентов, делеция Jarid2 оказывает отличающийся дефект, вызывая дефекты образования нервной трубки [на 15.5 день postcoitum (dpc)] (Takeuchi et al., 1995). Напротив, Pcl2 (Mtf2) регулирует лево-правостороннюю асимметрию у эмбрионов кур (Wang et al., 2004b), но это несущественно для мышей (Wang et al., 2007). Тот факт, что Jarid2 и Pcl2 KO мыши обнаруживают разные фенотипы, каждый из которых менее тяжелый, чем те, что при нокауте стержневого PRC2 компонента, подтверждает идею, что они не являются стержневыми компонентами комплексов, а скорее регулируют активность PRC2 в специфических контекстах.
Потеря субъединицы PRC1, Ring1B, ведет к эмбриональной гибели, тогда как Ring1A KO мыши жизнеспособны (de Napoles et al., 2004). Ring1B KO вызывает арест гаструляции (Voncken et al., 2003). Кроме того, линия мышей с гипоморфным Ring1B аллелем обнаруживает заднюю гомеотическую трансформацию осевого скелета (Suzuki et al., 2002). Неканонические PRC1 Компоненты важны для эмбрионального развития: Rybp KO эмбрионы обнаруживают гибель на ранних постимплантационных стадиях (Pirity et al., 2005), L3mbtl2 важен для гаструляции (Qin et al., 2012), а Kdm2b для собственно эмбрионального нейрального развития (Fukuda et al., 2011). Напротив, потеря Cbx белков, которые ответственны за рекрутирование канонического PRC1 на хроматин, не влияет на эмбриональное развитие. В самом деле, мутанты по Cbx2 или Cbx4 обнаруживают постнатальную гибель (Core et al., 1997; Liu et al., 2013). Интересно, что Cbx4, как было установлено, специфически регулирует пролиферацию эпителиальных клеток тимуса и подержание эпителия тимуса, открывая новую функцию PcG в иммунной системе (Liu et al., 2013). Хотя взрослые Cbx7 KO мыши и жизнеспособны, но они обнаруживают повышенную чувствительность к неоплазиям легких и печени (Forzati et al., 2012), подтверждая роль Cbx7 в качестве опухолевого супрессора. Это контрастирует с предыдущими сообщениями, показывающими, что Cbx7 является онкогеном (Bernard et al., 2005; Scott et al., 2007); роль этого белка, следовательно, всё ещё предмет споров. Генетическая делеция Mel18 или Bmi1 вызывает дефекты передне-задней спецификации осевого скелета (van der Lugt et al., 1994; Alkema et al., 1995; Akasaka et al., 1996). Mel18/Bmi1 двойные-KO мыши погибают ~9.5 dpc (Akasaka et al., 1996) и обнаруживают более тяжелые дефекты развития, чем каждый из одиночных KO, подтверждая, что Mel18 и Bmi1 обладают частично перекрывающимися функциями, а также некоторыми независимыми ролями, что подтверждается фенотипами одиночных KOs. В будущем, генетические делеции др. предполагаемых компонентов PRC1, таких как у млекопитающих гомологи Drosophila Ph и Psc, будет необходимо выяснить в отношении их функции в развитии. Roles of PcG complexes in ESCs Накапливаются данные, подтверждающие, что PcG белки важны для дифференцировки ESC, тогда как их роль в самообновлении остается спорной. Self-renewal В мышиных ESCs, PRC1 иPRC2 репрессируют гены, участвующие в дифференцировке (rev. Surface et al., 2010). В последние годы, линии ESC от нескольких KO и knockdown мышей были получены для изучения функции PcG. Генетическое истощение Eed или Ring1B, которое почти полностью устраняет активность PRC1 или PRC2, соотв., ведет к усилению экспрессии маркеров дифференцировки при базовых условиях (Leeb and Wutz, 2007; Leeb et al., 2010). Однако, потеря ни Eed ни Ring1B не влияет на экспрессию генов плюрипотентности ли способность клеток к самообновлению (Chamberlain et al., 2008; Endoh et al., 2008). Отметим. что истощение как Ring1A, так и Ring1B нарушает самообновление в ESC, демонстрируя, что Ring1 белки (а , следовательно, PRC1) важны для проявления качественных особенностей ESC (Endoh et al., 2008).
Дополнительные PRC2 компоненты, такие как Pcl2 и Pcl3, также вносят вклад в сеть самообновления ESC и необходимы для экспрессии ключевых маркеров плюрипотентности в условиях пролиферации (Walker et al., 2010; Ballare et al., 2012; Hunkapiller et al., 2012). Поскольку такие эффекты на экспрессию генов плюрипотентности не наблюдаются после истощения стержневых PRC2 компонентов, то это указывает на то, что Pcl2 и Pcl3 обладают PRC2-независимыми функциями - молекулярные основы которых неясны - в дополнение к их роли по рекрутированию комплекса на хроматин.
Интересно, что было сообщено, что набор из Polycomb мишеней, участвующий в метаболических процессах, экспрессируется также в мышиных ESCs, несмотря на то. что Polycomb ассоциирован с репрессией (Brookes et al., 2012; Morey et al., 2013). В самом деле, эти гены содержат elongating RNA polymerase II внутри тела гена. Однако, последующие эксперименты по chromatin immunoprecipitation (re-ChIP) показали, что PRC1 и удлиняющие РНК полимеразы II присутствуют в разных аллелях (Brookes et al., 2012). Это указывает на то, что независимая регуляция двух аллелей вносит вклад в модуляцию экспрессии генов в мышиных ESCs. ESC differentiation Хотя некоторые компоненты PcG были охарактеризованы как позитивные регуляторы состояния ESC, они были также чётко идентифицированы как необходимые для собственно дифференцировки ESC. В частности, Ezh2 необходим для генерации мезэнтодермальных клонов (Shen et al., 2008), а Suz12 KO ESCs не способны генерировать собственно энтодермальные клоны (Pasini et al., 2004). Неожиданно, Eed KO ESCs оказались способны дифференцироваться в три зародышевых слоя и вносить вклад в формирование химер (Chamberlain et al., 2008), хотя некоторые дефекты их способности формировать тератомы были отмечены (Leeb et al., 2010). Др. члены PRC2, такие как Jarid2 и Pcl белки (Pcl2 и Pcl3), были описаны как важные для собственно дифференцировки (Peng et al., 2009; Pasini et al., 2010; Walker et al., 2010; Ballare et al., 2012).
Потеря PRC1 E3 ubiquitin лигазы Ring1B нарушает собственно экспрессию маркеров дифференцировки, когда ESCs росли в виде эмбриоидных тел (Leeb and Wutz, 2007). Др. компоненты PRC1, такие как Cbx белки (see below), Rybp и L3mbtl2, также необходимы для дифференцировки ESC (Hisada et al., 2012; Morey et al., 2012; Qin et al., 2012; Tavares et al., 2012). Интересно, что ESCs, лишенные или Ring1B или Eed всё ещё способны формировать тератомы, но они образуются меньших размеров, при этом увеличивается эктодермальная или энтодермальная фракции, соотв. (Leeb et al., 2010). Напротив, ESCs с двойным KO по Eed и Ring1B, у которых почти полностью устранена активность и PRC1 и PRC2, были неспособны формировать тератомы, указывая, что истощение обоих комплексов блокирует дифференцировку и подтверждает, что они, по крайней мере, частично выполняют независимые функции. Variation in PRC1 composition in ESC self-renewal and differentiation Как PRC1 может способствовать самообновлению и дифференцировке? Недавние доказательства подтверждают, что переключение в составе Cbx белков канонического PRC1 происходит, когда самообновляющиеся ESCs начинают дифференцироваться. Cbx7 является основным компонентом канонического PRC1 (которые присутствует в самообновляющихся ESCs), тогда как Cbx2 и Cxb4 обнаруживаются в вариантах PRC1 в дифференцирующихся ESCs (Morey et al., 2012; O'Loghlen et al., 2012). Роль Cbx7 в самообновлении противоречива: O'Loghlen с коллегами сообщают, что истощение Cbx7 нарушает самообновление ESC, тогда как Morey с коллегами не установили роли Cxb7 в этом процессе. Оба исследования также были адресованы роли Cbx в дифференцировке, находка, что истощенные по Cbx7 ESCs дают тератомы с увеличенной эктодермальной фракцией согласуется с негативной регуляцией, обеспечиваемой Cbx7-PRC1 нескольких эктодермальных генов в ESCs.
Cbx2 и Cbx4, как было установлено, усиливают свою активность после дифференцировки, это сопровождается подавлением Cbx7 (Morey et al., 2012). Т.о., Cbx2 и Cbx4, по-видимому, замещают Cbx7 в дифференцированных клетках, поставляя тем самым PRC1 на разные наборы генов, такие как регуляторы плюрипотентности и специфические мезодермальные и энтодермальные маркеры. На молекулярном уровне, Cbx2 и Cbx4 выполняют не перекрывающиеся функции, репрессируя разные субнаборы генов в дифференцирующихся ESCs (Morey et al., 2012). В самом деле, Cbx2 и Cbx4 необходимы для собственно дифференцировки ESC, при этом тератомы, происходящие из истощенных по Cbx2 и Cbx4 ESCs обнаруживают аберрантное увеличение в количестве энтодермальных и мезодермальных клеток по сравнению с контрольными клетками, что согласуется с их профилями связывания генома (Morey et al., 2012).
Отметим, что в ESCs, Cbx7 и Ring1B оккупируют промоторы Cbx2 и Cbx4, демонстрируя что Cbx7-PRC1 ответственны за репрессию этих генов в самообновляющихся клетках, в то время как Cbx2/4-PRC1, по-видимому, репрессирует Cbx7 в дифференцированных ESCs (Morey et al., 2012). Следовательно, петля ауторегуляции скорее всего контролирует композицию Cbx в PRC1 и управляет переходом ESCs от состояния самообновления к состоянию дифференцировки. PcG complexes regulate bivalent genes in mouse ESCs Бивалентные домены, которые являются регионами, снабженными как активными (H3K4me3) , так репрессивными (H3K27me3) иетками, были идентифицированы в мышиных ESCs (Azuara et al., 2006; Bernstein et al., 2006). Как упоминалось выше, репрессивная метка H3K27me3 откладывается с помощью PRC2 и может в свою очередь рекрутировать PRC1. Параллельно активная метка H3K4me3 откладывается с помощью trithorax/MLL комплекса (Schuettengruber et al., 2011). Такие регионы не уникальны для ESCs, а идентифицированы также в др. мультипотентных стволовых клетках (as discussed below) (Mohn et al., 2008; Cui et al., 2009).
Кроме того, в присутствие активной метки H3K4me3бивалентные гены характеризуются присутствием сбалансированной RNA polymerase II (Fig. 2A) (Brookes et al., 2012). Несмотря на это, они остаются транскрипционно молчащими. Современные модели предполагают, что бивалентность позволяет осуществлять быстрый переход от репрессии к активации онтогенетических генов в ответ на стимулы к дифференцировке (Azuara et al., 2006; Bernstein et al., 2006). Т.о., тонко управляемая регуляция бивалентными доменами существенна для собственно развития, т.к. она регулирует точный ход экспрессии генов плюрипотентности и дифференцировки (Jia et al., 2012). Fig. 2.
После дифференцировки ESC бивалентные домены перейти в активированные или репрессивные геномные локусы в соотв. с процессами дифференцировки (Fig. 2B) (Mikkelsen et al., 2007; Alder et al., 2010). Mohn с сотр. сообщили, что новые бивалентные домены приобретаются в нейральных предшественниках, происходящих из ESCs, указывая тем самым, что эпигенетическая регуляция, обеспечиваемая с помощью PcG комплексов высоко динамична и специфична для типов клеток (Mohn et al., 2008). Сходным образом, анализ дифференцировки ESCs в кардиомиоциты демонстрирует динамичную реогрганизацию бивалентных доменов (Paige et al., 2012). Недавно, Marks с колл. сообщили, что количество бивалентных доменов снижается с ~3000 в ESCs, растущих в среде, содержащей сыворотку, до менее 1000 в ESCs, растущих на среде, содержащей 2i (Marks et al., 2012). Это указывает на то, что становление, по крайней мере, некоторых бивалентных доменов зависит от условий культивирования, тем самым ставится под вопрос их значение при физиологических условиях. Не смотря на это, доказательства демонстрируют, что бивалентные домены регулируют онтогенетические гены, что продемонстрировано на эмбрионах рыбок данио, указывая, что эти наблюдения на ESCs, скорее всего, важны in vivo (Vastenhouw et al., 2010). Итак. становление бивалентных доменов, по-видимому, консервативный механизм для регуляции ключевых свойств стволовых клеток, самообновления и дифференцировки. Механистически, онтогенетические PcG мишени удерживаются молчащими до тех пор, пока они не будут быстро активированы, когда клетка получает соотв. сигналы. Т.о., ключевая функция бивалентных доменов в плюрипотентных и мультипотентных стволовых клетках может быть объяснена, по крайней мере, частично двойной ролью, осуществляемой PcG комплексами в самообновлении и дифференцировке (as discussed further below). PcG proteins promote somatic cell reprogramming Соматические клетки могут быть возвращены в состояние подобное плюрипотентному, используя некоторые техники, такие как перенос ядер соматических клеток (SCNT) и слияние клеток (Jaenisch and Young, 2008). Pereira с колл. предоставили первые доказательства, что PcG играют критическую роль в репрограммировании, обеспечиваемому с помощью слияния клеток (Pereira et al., 2010). Они показали, что мышиные ESCs , истощенные по отдельным членам PRC1 или PRC2 (напр. Eed, Suz12, Ezh12, Ring1A и Ring1B) неспособны правильно репрограммировать B лифоциты человека.
Открытие, что соматические клетки могут быть репрограммированы в induced pluripotent stem cells (iPSCs), используя комбинацию 4-х транскрипционных факторов (т.наз. Yamanaka факторов), предоставило новый путь для использования репрограммированных клеток для моделирования болезней in vitro и генной терапии (Takahashi and Yamanaka, 2006; Robinton and Daley, 2012). Функционально, iPSCs воспроизводят все признаки плюрипотентных ESCs, включая способность к дифференцировке в желаемые типы клеток при определенных культуральных условиях. Однако существуют технические ограничения в генерации iPSCs, прежде всего в терминах низкой эффективности (~0.1%) и длительного времени, необходимого для получения репрограммированных клонов (Stadtfeld et al., 2008). Некоторые сообщения подтверждают, что эти ограничения, скорее всего, связаны с трудностями в преодолении эпигенетических барьеров. Напр., истощение PRC2 компонента, такого как Jarid2, Pcl2 или нового компонента esPRC2p48, нарушает репрограммирование фибробластов в iPSCs (Zhang et al., 2011). Напротив, избыточная экспрессия PRC2 компонентов облегчает процесс репрограммирования. Сходным образом, Onder с колл. сообщили, что потеря PRC1 компонентов BMI1 и RING1B, и стержневых PRC2 компонентов EZH2, EED and SUZ12, существенно снижает генерацию iPSC человека (Onder et al., 2012). Более того, Bugamin с колл. недавно предположили, что Ezh2 не только способен к усилению эффективности получения iPSC , но и также может быть использован как часть нового коктейля транскрипционных факторов для репрограммирования, который включает Lin28, Sall4, Nanog, Klf4 и c-Myc (Buganim et al., 2012). Эта новая комбинация факторов способна генерировать iPSC-подобные клетки в культуре, хотя эти клетки обнаруживают неполную реактивацию программы эндогенной плюрипотентности и, следовательно, не полностью репрограммированы и стабильны.
Все эти наблюдения четко показывают, что PcG белки модулируют репрограммирование дифференцированных клеток в плюрипотентные клетки. Механизмы, лежащие в основе этого процесса всё ещё исследуются в особенности. как PcG белки влияют на репрограммирование. PcG complex activities in tissue stem cells Роль комплексов PcG наиболее активно анализировалась в ESCs, но ключевые функции были также идентифицированы в различных тканевых стволовых клетках. PcG proteins regulate self-renewal and the neurogenic-astrogenic switch in neural progenitors Нейральные предшественники это самообновляющиеся, мультипотентные клетки, которые способны давать нейроны и глиальные клетки. В развивающемся неокортексе нейроны и астроциты происходят из общих нейральных предшественников. Инициальная нейрогенная фаза затем переходит в астрогенную фазу (Hirabayashi and Gotoh, 2005). Это переключение с нейрогенной судьбы на астрогенную является критическим для собственно кортикального развития. Нейральные предшественники in vitro, которые сильно напоминают те, то обнаруживаются in vivo, могут эффективно происходить из ESCs (Conti et al., 2005; Bibel et al., 2007). Присутствие бивалентных доменов хроматина в нейральных предшественниках, происходящих из ESCs подтверждает, что PcG белки также функционируют и в нейральных предшественниках (Mohn et al., 2008), а некоторые функциональные анализы установили PcG комплексы в качестве критических регуляторов признаков нейральных предшественников, таких как пролиферация, самообновление и дифференцировка in vitro и in vivo.
В культуре нейральные предшественники, истощенные по PRC1 энзиматической субъединице Ring1B, обнаруживают дефекты пролиферации и самообновления, а также преждевременную нейрональную (но не глиальную) дифференцировку при базовых условиях (Roman-Trufero et al., 2009). Интересно, что PRC1 компонент Bmi1, как было установлено, контролирует пролиферацию нейральных предшественников путем репрессии p21 (Cdkn1a) (Fasano et al., 2007; Roman-Trufero et al., 2009) и Ink4/Arf белков, ингибирующих клеточный цикл, p16 (Cdkn2a) и p19 (Cdkn2d) (Molofsky et al., 2003; Bruggeman et al., 2005).
Важная роль генов Polycomb в регуляции нейральных предшественников in vivo продемонстрирована Hirabayashi с колл. (Hirabayashi et al., 2009). В развивающейся коре комплексы Polycomb негативно регулируют экспрессию Ngn1 и Ngn2 во время астрогенной фазы. Поскольку Ngn1 и Ngn2 поддерживают нейрогенную фазу путем секвестрирования факторов. способствующих астрогенной фазе (Sun et al., 2001), то замалчивание этих генов с помощью Polycomb-обеспечиваемой репрессии делает возможным собственно начало астрогенной фазы. Т.о., культивируемые нейральные предшественники, истощенные по Eed или Ring1B сохраняют аномально Ngn1 и Ngn2 на поздних ст. развития и не позволяют дифференцироваться в астроциты, а мыши, у которых Ring1B кондиционно истощен в ЦНС обнаруживают нехарактерное окончание нейрогенеза и нарушение начала астрогенеза (Hirabayashi et al., 2009). PcG proteins in hematopoietic stem cell maintenance Клон гематопоэтических стволовых клеток (HSC) является одной из наиболее изученных моделей самообновления и дифференцировки стволовых клеток. Долговременно воспроизводимые HSCs (LT-HSCs) располагаются в качестве редких клеток в костном мозге и и находятся на верхушке иерархии предшественников, которые становятся всё боле и более ограниченными несколькими или одиночными клонами. Эти предшественники способны генерировать short-term repopulating HSCs (st-HSCs), которые, в свою очередь, дают предшественников крови, предназначенные для одноклональной дифференцировки и продукции зрелых кровяных клеток, включая эритроциты, мегакариоциты, миэлоидные клетки (monocytes/macrophages и neutrophils) и лимфоциты (Kondo et al., 2003; Wang and Wagers, 2011).
Некоторые работы выявили роль PcG белков в поддержании HSC. Как упоминалось выше для нейральных предшественников PRC1 компонент Bmi1 ингибирует локус Ink4/Arf, который кодирует ингибиторы клеточного цикла p16 и p19, и это также приложимо и к HSCs (Park et al., 2003). Более того, Bmi1 также участвует в репрессии онтогенетических генов, таких как Ebf1 и Pax5. Истощение Bmi1 вызывает аберрантную экспрессию Ebf1 и Pax5, которая приводит к преждевременной спецификации лимфоидного клона (Oguro et al., 2010). Интересно, что переключение состава Cbx в PRC1 регулирует переход от самообновления к дифференцированному состоянию мышиных HSCs (Klauke et al., 2013), соотв. наблюдения получены и для ESCs (Morey et al., 2012). Полученные данные подтверждают, что Cbx7 необходим дл самообновления мышиных HSCs, тогда как Cbx2/4/8 важны для их дифференцировки. В отдельном исследовании (van den Boom et al., 2013), отсутствие CBX2, как было установлено, сильно нарушает поддержание HSC человека, при этом пониженный уровень пролиферации и повышенный уровень апоптоза. На молекулярном уровне CBX2 репрессирует экспрессию фактора. способствующего старению, P21 в этом контексте (van den Boom et al., 2013). Это очевидное расхождение в его активности, по-видимому, обусловлено видо-специфичными функциями Cbx2. В самом деле, истощение Cbx2 у мышей не влияет на самообновление HSC (van den Boom et al., 2013).
Чёткая регуляция экспрессии компонентов PRC2 также является критической для собственно характеристик HSC. Некоторые исследования подчеркнули роль Ezh1 и Ezh2 в эмбриональных и взрослых HSCs. Потеря Ezh2 тяжело нарушает самообновление плодных HSC, не нарушая функции взрослых стволовых клеток, присутствующих в костном мозге, за исключением того, что лимфопоэз несколько нарушен (Su et al., 2003; Su et al., 2005; Kamminga et al., 2006; Mochizuki-Kashio et al., 2011). Напротив, дефицит Ezh1 тяжело редуцирует фракцию взрослых HSC, нарушая самообновление и покой HSC (Mochizuki-Kashio et al., 2011). Hidalgo с колл. недавно сообщили, что Ezh1 способен удерживать взрослые HSCs в состоянии медленных делений за счет репрессии пролиферации, а также защиты взрослых HSCs от старения и преждевременной дифференцировки (Hidalgo et al., 2012). На молекулярном уровне, Ezh1 репрессирует главные регуляторы старения, такие как Ink4/Arf локус и Bmp2. Т.о., Ezh2 важен для плодных HSCs, тогда как Ezh1 необходим для взрослых. Это подтверждает, что функциональное переключение между Ezh2 и Ezh1 регулирует специфичность PRC2 у эмбрионов и взрослых. PcG promotes self-renewal in epidermal stem cells Эпидермис кожи является стратифицированным эпителием, который действует как барьер, чтобы защитить организм от внешних стрессовых воздействий и микроорганизмов (Beck and Blanpain, 2012). Разные стволовые клетки содержатся в разных эпидермальных нишах (таких как межфолликулярный эпидермис, волосяные фолликулы и сальные железы) , регулирующих поддержание и репарацию эпидермиса. Детально о роли PcG белков в коже см. Frye and Benitah (2012). Потеря Ezh2 нарушает пролиферацию и индуцирует преждевременную дифференцировку базального слоя эпидермиса (Ezhkova et al., 2009; Ezhkova et al., 2011). На молекулярном уровне Ezh2 действует путем репрессии локусов Ink4/Arf и epidermal differentiation complex (EDC), последний из которых кодирует гены дифференцировки, необходимые для созревания кожи. Кроме того, потеря PRC2 компонента Jarid2 сходным образом приводит к увеличению дифференцировки и снижению пролиферации (Mejetta et al., 2011). Однако эффекты Ezh2 KO на эпидермис преимущественно наблюдаются во время эмбриогенеза и менее тяжелые у взрослых, тогда как Jarid2 эпидермальный KO обнаруживает постнатальные дефекты. Подтверждение роли PRC2 в эпидермисе то, что Lien с колл. недавно идентифицировали небольшое количество бивалентных доменов в стволовых клетках волосяных фолликулов, демонстрируя, что PcG белки участвуют в переходе клеточных судеб этих клеток (Lien et al., 2011).
Подобно PRC2, также PRC1 играет важную роль в эпидермисе. В самом деле, недавнее исследование продемонстрировало, что PRC1 компонент Cbx4 необходим для поддержания базальных эпидермальных клеток, предупреждая их от старения и преждевременной дифференцировки, посредством прямой регуляции p16 (Luis et al., 2011). Интересно, что Cbx4 также, скорее всего, предупреждает дифференцировку независимым от PRC1 способом: ингибирование дифференцировки обеспечивается с помощью Cbx4, нуждающегося в его E3-SUMO лигазной активности, но не в распознавании H3K27me3, обеспечиваемого с помощью его хромодомена. Итак, эти данные подтверждают важную роль PcG комплексов в обеспечении самообновления и поддержания эпидермальных стволовых клеток за счет недопущения их преждевременной дифференцировки.
Conclusions The use of mouse ESCs has provided a great opportunity for investigating developmental PcG functions in vitro. ESC differentiation largely recapitulates differentiation during embryonic development, with each step corresponding to a specific developmental stage. Interestingly, studies in differentiating ESCs suggest that PcG complexes set up lineage commitment from pluripotent to differentiated cells (Surface et al., 2010). This is due to the dynamic activities of PcG complexes, which regulate specific sets of genes at different developmental stages (Mohn et al., 2008). PcG complexes are involved in cell fate transitions, not only in pluripotent ESCs but also in several embryonic and adult multipotent stem cell types (Richly et al., 2011). Indeed, a key PcG function in pluripotent and multipotent stem cells is to establish bivalent domains that allow rapid activation of the gene upon differentiation stimuli. Although the relevance of bivalent domains is still debated, several studies indicate that bivalency is an evolutionarily conserved mechanism of regulating cell fate transitions (Alder et al., 2010; Vastenhouw et al., 2010). Apart from their key role in cell fate transitions, PcG proteins are essential for the maintenance of several stem cell types. It is clear that the loss of the PRC1 components Ring1A/B and of several PRC2 components impairs ESC self-renewal. In various multipotent stem cells, PcG proteins maintain self-renewal by repressing differentiation and senescence players, such as those encoded at the Ink4/Arf locus.
Notably, at the molecular level, the roles of the PcG proteins are unique for each stem cell type and also vary within the same cell type depending on the developmental stage and the environmental stimuli. One possible explanation is that the composition of PcG proteins within the PcG complexes determines the specificity of their function. Indeed, increasing evidence from recent studies indicates that the composition of PcG complexes, particularly PRC1, is variable and dynamic in different cell types and at different developmental stages. In addition, exchanging components can have profound effects on complex function. Thus, in ESCs and HSCs, exchanging the Cbx protein in PRC1 is involved in the switch from a self-renewing to a differentiating state, whereas in HSCs the Ezh component in PRC2 differs between embryonic and adult stages, concomitant with differential activities of the complex. Whether these principles apply to other complex components or in other cell types has yet to be seen, but these examples demonstrate that a more detailed characterization of PcG complex composition will contribute greatly to our knowledge of their specific functions in different developmental and cell type contexts.
Importantly, in recent years stem cells have emerged as a possible tool for tissue regeneration upon lesions induced by trauma or disease. Further knowledge of the epigenetic networks underlying stem cell biology will increase the therapeutic use of stem cells in regeneration. Moreover, the discovery of iPSC reprogramming has opened new opportunities for regenerative medicine (Robinton and Daley, 2012), although the process remains slow and inefficient. Given that PcG complexes are essential for proper iPSC generation, more detailed information about the role of PcG genes in reprogramming could increase the efficiency and the quality of the iPSC generation process, thereby improving the therapeutic potential of iPSCs.
Finally, increasing knowledge about stem cell biology, and the roles of epigenetic modifiers therein, will aid the fight against cancer. Data indicate that a stem cell population within the cancer (cancer stem cells) is responsible for tumor initiation and for resistance to therapy. Several PcG genes are dysregulated in cancer, implying that PcG complexes are likely to play a crucial role in cancer generation and in the maintenance of cancer stem cells (Piunti and Pasini, 2011). Thus, understanding Polycomb gene functions will be crucial for elucidating the molecular mechanisms that regulate embryonic development and stem cell function in tissue homeostasis, regeneration and cancer.
|