Несколько исследований предоставило гистологическое и до некоторой степени молекулярное описание зрелого места инсерции сухожилия в кость (Benjamin et al., 2002; Biewener et al., 1996; Thomopoulos et al., 2011; Thomopoulos et al., 2010). Несмотря на это фундаментальный вопрос, как формируется единица прикрепления во время скелетно-мышечной сборки, остается в основном неизвестным. Чтобы выяснить механизмы, с помощью которых формируются AU, мы изучили развитие костной стороны костного возвышения.

В данной работе мы установили уникальный пул предшественников, которые образует костные возвышения. Мы показали, что два самостоятельных пула клеток предшественников формируют костные возвышения. Мы показали, что два самостоятельных пула клеток предшественников формируют хрящевую матрицу длинной кости модульным способом. Sox9-позитивные предшественники формируют первичную, цилиндрическую структуру хрящевого зачатка, тогда как ранее неизвестный второй пул Sox9- и Scx-позитивных предшественников дает костные возвышения. Более того, мы показали, что эти два пула регулируются раздельно, поскольку передача сигналов TGFβ необходима для спецификации предшественников костных возвышений, но не для предшественников первичного хряща. Далее дифференцировка Sox9- и Scx-позитивных предшественников костных возвышений в хрящ использует передачу сигналов BMP (Fig. 9).

Fig. 9. A modular model for bone eminence development. (A,B) The formation of bone eminences is illustrated in the context of limb development (A) and of musculoskeletal development (B). Two distinct pools of progenitor cells form the cartilaginous template of the long bone in a modular fashion. The first pool of Sox9-positive progenitors forms the primary, cylindrical structure of the cartilaginous anlage. Then, a previously unknown second pool of Sox9- and Scx-positive progenitors forms the module of the bone eminence. TGF? signaling controls the specification of eminence progenitors, whereas SCX/BMP4 signaling mediates their differentiation.

Наша находка, что клетки, образующие возвышения, не являются производными первичных хрящевых хондроцитов, а скорее возникают из самостоятельного пула Sox9- и Scx-позитивных предшественников, является первым указанием на то, что кости формируются модульным способом. Ранние события, которые ведут к образованию этого самостоятельного пула предшественников и точный источник Sox9- и Scx-позитивных клеток всё ещё неизвестен.

Хотя позднее в развитии экспрессия Scx ограничивается формирующимся сухожилием (Schweitzer et al., 2001), предыдущие работы описывают раннюю и экстенсивную экспрессию Scx в мезенхиме зачатка конечности (Asou et al., 2002; Cserjesi et al., 1995). Т.о., возможно, что некоторые мезенхимные клетки конечностей, которые экспрессируют Sox9 и Scx являются первыми предшественниками костных возвышений.

Интригующе, что развитие длинных костей происходит прогрессивно из двух пулов клеток предшественников, подобно модульному развитию сердца млекопитающих. Во время развития сердце формируется клетками из двух разных пулов, известных как первое и второе поля сердца. Первоначально сердечная трубка формируется клетками первого поля. Затем клетки. которые возникают из второго поля сердца, вносят вклад в его удлинение и формирование тракта оттока (Kelly et al., 2001; Mjaatvedt et al., 2001; Waldo et al., 2001). Это сходство подчеркивает использование модульности в органогенезе джля обеспечения морфологической и функциональной сложности.

Наша находка, что развитие кости является модульным процессом, открывает новые перспективы на различные аспекты скелетно-мышечной функции и сборки. Функционально разные части одной и той же кости подвержены разным механическим нагрузкам. Напр., костные возвышения испытывают нагрузки от сухожилий, тогда как суставные поверхности испытывают сжатие. Находка, что кости образуются модулярно двумя пулами предшественников дает механистическое объяснение способности разных анатомических регионов кости соответствовать разным механическим условиям. Онтогенетически, блочность (modularity) может облегчать сборку скелетно-мышечной системы путем координации взаимодействий между костью и местом прикрепления сухожилия, не вмешиваясь в конструкцию всей кости. Это мнение подчеркивает эволюционное преимущество модульной стратегии морфогенеза кости, которой можно легко манипулировать путем добавления, удаления или изменения модулей вместо преобразования всей структуры.

Наше открытие второго пула клеток предшественников, которые формирует костные возвышения, подтверждает, что др. регуляторный механизм контролирует спецификацию и дифференцировку этих клеток предшественников. В самом деле, при блокировании экспрессии Tgfbr2 в мезенхиме конечностей мы продемонстрировали центральную роль передачи сигналов TGFβ в регуляции предшественников возвышения, т.к. этот путь необходим исключительно для их спецификации. Ранее мы показали, что клетки сухожилий участвуют в инициации образования костных возвышений (Blitz et al., 2009). Наблюдение, что Sox9- и Scx-позитивные предшественники возвышений уже специфицированы на ст. E11.5 , демонстрирует, что развитие костного возвышения инициируется на ст. E11 скорее, чем на ст. E14, как мы предполагали до этого (Blitz et al., 2009). Поскольку передача сигналов TGFβ необходима для образования сухожилий (Pryce et al., 2009), то можно предположить, что отсутствие предшественников возвышений вторично приводит к потере сухожилий. Однако, у Prx1-Tgf-βRII мутантов, аномальные экспрессия Scx и развитие сухожилий проявляются только на ст. E12.5 (Pryce et al., 2009). Следовательно, вряд ли возможно, что арест образования сухожилия является причиной потери клеток предшественников возвышений в отсутствие передачи сигналов TGFβ.

Наконец, можно предположить, что путем контроля образования и сухожилия и костного возвышения, передача сигналов TGFβ является ключевым регулятором единицы соединения сухожилие-кость. В самом деле, было подтверждено, что TGFβ координирует дифференцировку хряща и сухожилия во время развития конечности (Lorda-Diez et al., 2009).

Механизм, который лежит в основе роли передачи сигналов TGFβ в спецификации предшественников возвышений, всё ещё неясен, особенно в свете широкой экспрессии Tgfbr2 и TGFβ лигандов в развивающейся конечности (Pryce et al., 2009). Несмотря на это, наша находка может помочь разъяснить неясности относительно роли этого пути в скелетогенезе. Ранее в исследованиях in vitro было подтверждено, что TGFβs играют критическую роль в индукции предшественников хряща и их дифференцировки в хондроциты (Carrington and Reddi, 1990; Chimal-Monroy and Diaz de Leon, 1997; Kulyk et al., 1989; Leonard et al., 1991; Merino et al., 1998). Однако, устранение передачи сигналов TGFβ в мезенхиме конечности, по-видимому, не влияет на эти процессы (Seo and Serra, 2007; Spagnoli et al., 2007). Наши находки могут подразумевать, что этот путь регулирует хондрогенез, но его влияние ограничено вторичным пулом клеток предшественников, которые дают начало костным возвышениям.

Ранее мы показали, что путь SCX/BMP4 вызывает образование возвышений (Blitz et al., 2009); однако мы не смогли понять точного вклада этого пути в этот процесс. Здесь мы получили недостающую информацию, показав, что этот путь регулирует дифференцировку клеток предшественников костных возвышений. Др. аспект участия передачи сигналов SCX/BMP4 это возможность, что он служит в качестве неавтономного сигнала, с помощью которого сухожилия регулируют развитие костных возвышений.

Наша находка, что клеток предшественников возвышений являются Scx позитивными, выдвигает новую гипотезу, что экспрессия Bmp4 может регулироваться с помощью Scx-позитивных клеток внутри AU, исключая тем самым неавтономную роль сухожилий. Хотя наш клональный эксперимент не смог предоставить четкий приговор по этому вопросу, наш анализ экспрессии смог предоставить важный сигнал. Как упоминалось между ст. E11.5 и E12.5 обнаруживается перекрывание доменов экспрессии Sox9 и Scx в формировании AU; всё же на ст. E13.5 обнаруживается четкое пространственное разделение между доменами, поскольку экспрессия Scx ограничена сухожилием. Точно на этой стадии SCX управляет экспрессией Bmp4 в клетках на кончике сухожилия (Blitz et al., 2009) и Sox9-позитивные клетки подвергаются дифференцировке в хондроциты. Это подтверждает, что в формирующемся сухожилии SCX управляет экспрессией Bmp4, чтобы регулировать неавтономно дифференцировку Sox9-позитивных клеток в Sox9- и Col2a1-позитивные хондроциты, которые формируют костные возвышения.

Наконец, поскольку , как было установлено, передача сигналов TGFβ регулирует экспрессию Scx (Murchison et al., 2007; Pryce et al., 2009), то вполне возможно, что передача сигналов TGFβ и BMP4 совместно формируют иерархический механизм, который координирует спецификацию и дифференцировку клеток предшественников костных возвышений.

Итак. мы продемонстрировали, что длинные кости развиваются модульно из двух отдельных групп клеток предшественников. Первая дает первичную структуру кости, тогда как ранее неизвестный вторичный пул дает костные возвышения. Экспрессия Sox9 и Scx предшественниками возвышений создает механистическую основу такой модульности. Молекулярный механизм, лежащий в основе модульного морфогенетического процесса формирования костных возвышений использует передачу сигналов TGFβ, а также BMP4. Эти находки проливают свет на два центральных процесса развития, а именно морфогенез кости и скелетно-мышечную сборку.