Мы установили, что мРНК, кодирующие Robo1 и Robo2 экспрессируются в nodose ganglia в ходе всего развития и что экспрессия Robo1 регулируется в ходе развития. Robo лиганды Slit1, Slit2 и Slit3 экспрессируются в плодном и взрослом кишечнике. Slit2 белок преимущественно секретируется в наружной мезенхиме кишки на ст. E14 в регионах, которые частично перекрываются с секрецией netrin-1. Нейриты, отходящие от эксплантированного nodose ganglia отвергаются с помощью Slit2. Эти наблюдения указывают на то, что Robo и Slit экспрессируются nodose ganglia и кишечником, соотв., в тот период, когда сенсорные аксоны блуждающего нерва находят свои соотв. энтерические мишени и что сенсорные нейроны вагуса чувствительные к секретируемым Slit белкам.

Ранее мы продемонстрировали, что DCC экспрессируется развивающимися nodose ганглиями (Ratcliffe et al., 2006). В данном исследовании мы установили, мРНК, кодирующая Robo1 и Robo2 также экспрессируется клеточными телами nodose ганглиев в тот же самый временно промежуток развития, который был определен для DCC. Конкурентная экспрессия рецепторов для классических привлекающих и отталкивающих молекул наведения согласуется с идеей, что и привлечение и отталкивание необходимы управления сенсорными нейронами блуждающего нерва, чтобы они находили правильные мишени в кишечнике. Аксоны, как известно, целенаправленно перемещаются путем изменения свой чувствительности к противоположным привлекающим и отталкивающим сигналам. DCC-экспрессирующие ростовые конусы развивающихся спинальных аксонов, напр., первоначально привлекаются к срединной линии спинного мозга; после достижения срединной линии, Robo активируется в ростовом конусе и способен затушить влечение к netrin благодаря непосредственному связыванию с цитоплазматическим доменом DCC (Stein and Tessier-Lavigne, 2001). Мы предположили, что сходный механизм "hierarchical silencing" позволяет сенсорным аксонам блуждающего нерва или привлекаться с помощью netrins или отталкиваться с помощью Slits, в зависимости от окружения, через которое проходит аксон.

Иммунореактивность Robo1 была обнаружена в субнаборе тел нервных клеток в nodose ганглиев на плодной и постнатальной стадиях. Эти наблюдения не только согласуются с нашей предыдущей работой, в которой DCC-иммунореактивные волокна были обнаружены в субнаборе среди общего количества аксонов блуждающего нерва (Ratcliffe et al., 2006). но и также согласуются с известным разнообразием проекций вагуса. Сенсорные аксоны блуждающего нерва не только обнаруживают мишени помимо кишечника, таких как легкие и печень, но и образуют разные конфигурации в зависимости от их расположения в стенке кишечника, такие как IMAs и IGLEs (Berthoud and Neuhuber, 2000). Поэтому было разумным ожидать, что каждая индивидуальная молекула наведения аксона будет экспрессироваться не только в субнаборе nodose нейронов в данным момент времени.

Мы обнаружили мРНК, кодирующие Slits1-3, на всех исследованных возрастах в кишечнике плодов и взрослых. Белок Slit2 концентрируется в наружной мезенхиме кишечника плода на ст. E14. Наши наблюдения согласуются с предыдущей работой, в которой транскрипты, кодирующие Slit1, Slit2 и Slit3, были обнаружены с помощью in situ гибридизации в виде перекрывающихся паттернов экспрессии в наружной стенке развивающегося кишечника цыплят (De Bellard et al., 2003). Туловищные (truncal), но не вагусные, происходящие из нервного гребня клетки экспрессируют мРНК, кодирующие Robo1 и Robo2, отталкиваются с помощью Slit; экспрессия Slits в наружной стенке кишечника, т.о., служит, чтобы отталкивать Robo-экспрессирующие клетки, происходящие из туловищной части нервного гребня, от вступления из в субдиафрагмальную часть кишечника (De Bellard et al., 2003). Мы предположили, что подобно отталкиванию Robo-экспрессирующих клеток, происходящих из туловищной части нервного гребня, Slits в наружной мезенхиме кишечника также может отталкивать Robo-экспрессирующие сенсорные аксоны блуждающего нерва.

Гипотеза, что Slits могут отталкивать сенсорные аксоны вагуса, подтверждается наблюдением, что аксоны блуждающего нерва реагируют на градиент секреции Slit. Отталкивающий эффект Slit2 анализировали in vitro. Nodose ганглии от плодов мышей на ст. E14 культивировали совместно с агрегатами клеток HEK 293, трансфицированных, чтобы секретировать Slit2 и не трансфицированными контрольными HEK 293 клетками. В то время как нейриты из nodose ганглиев ранее обнаруживали влечение к netrin-1 (Ratcliffe et al., 2008), мы обнаружили, что нейриты, исходящие из эксплантов nodose ганглиев отталкивались с помощью Slit2.

Мы сравнивали паттерны секреции Slit2 и netrin-1 в кишечнике плодов и оказалось, что оба присутствуют в стенке кишечника, Slit2 наиболее выражен в наиболее наружной мезенхиме, а netrin-1 больше концентрируется в регионе развивающегося мышечно-кишечного сплетения. Концентрация netrin-1 в презумптивном мышечно-кишечном сплетении согласуется с нашей предыдущей работой, где мы продемонстрировали, что энтерические нейроны синтезируют нетрины (Ratcliffe et al., 2011). Мы предположили, что роль Slit2 в мезенхиме наружной части кишечника создает зону отталкивания, которая помогает группе ("herd") волокон блуждающего нерва перемещаться в направлении netrin-1-экспрессирующих энтерических нейронов, чтобы сформировать IGLEs, в противоположность тому, чтобы быть отвлеченными от остальных нетринов в мезенхиме. Эта концепция онтогенетически регулируемых зон привлечения и отталкивания аналогична наблюдаемому ведению аксонов клеток ретинальных ганглиев внутри зрительного тракта; экспрессия Slits в ключевых регионах диэнцефалона и телэнцефалона вносит вклад в ограничение аксонального роста вдоль правильных путей (Thompson et al., 2006). Поскольку мы сконцентрировались на иммуномечении и функциональном исследовании Slit2, то мы установили, что Slit1, Slit2 и Slit3 не обязательно эквивалентны в своей роли (Ypsilanti et al., 2010), тем самым в принципе добавляется дополнительный слой сложности, как аксоны блуждающего нерва могут управляться.

Возникает эволюционная картина, согласно которой способность сенсорных аксонов вагуса находить правильные мишени кишечника является конечным результатом серии привлекающих и отталкивающих сил. DCC-экспрессирующие сенсорные аксоны вагуса первоначально привлекаются нетринами, секретируемыми наружной стекой развивающейся кишки (Ratcliffe et al., 2006), в дальнейшем привлекаются концентрацией нетринов, секретируемых энтерическими ганглиями (Ratcliffe et al., 2011). Секреция Slit2 в сходном регионе, что и netrin-1 гарантирует, что как только сенсорные аксоны вагуса проникнут с стенку кишечника, они будут преимущественно привлекаться высокими концентрациями netrins, синтезируемых энтерическими ганглиями скорее, чем остальными нетринами, секретируемыми наружной мезенхимой кишки. После достижения энтерических ганглиев сенсорные аксоны блуждающего нерва наталкиваются на laminin оболочку, покрывающую энтерические ганглии (Mawe and Gershon, 1989). Laminin превращает netrin-обеспечиваемое притягивание в отталкивание и сенсорные аксоны вагуса останавливаются в регионе ламинина и образуют IGLEs (Ratcliffe et al., 2008). Секреция Slit2 в наружной мезенхиме кишки также может служить предупреждению сенсорных аксонов вагуса от остановки их в наружной части стенки кишечника и поощрению сенсорных аксонов вагуса к росту в направлении энтодермы. Это может быть аналогичным способности Robo тушить привлекающий эффект netrin-1, но не его рост-стимулирующий эффект, в спинальных аксонах, как только они достигают срединной линии спинного мозга (Stein and Tessier-Lavigne, 2001). Netrins синтезируются не только энтерическими ганглиями, но и секретируются эпителиальными клетками слизистой (Jiang et al., 2003; Ratcliffe et al., 2006). Как только сенсорные аксоны вагуса проникают в lamina propria и растут в направлении энтодермы, они опять начинают привлекаться градиентом нетринов, секретируемых слизистой. Сенсорные аксоны вагуса не проникают в слизистую, однако поскольку они останавливаются с помощью концентрации laminin, они находят непосредственно соседний к слизистой эпителий и остаются в слизистой, образуя афферентные окончания слизистой (Ratcliffe et al., 2008). Поскольку процессы, описанные выше происходят в плодной жизни, мы описали продолжающуюся экспрессию Slit и Robo у взрослых. Возможно, что Slit и Robo вносят вклад в описываемую постнатальную пластичность аксонов блуждающего нерва (Phillips and Powley, 2005), аналогично их роли в регенерации после повреждений периферических нервов (Yi et al., 2006).