Локализация про-ангиогенного VEGF165 и анти-ангиогенного VEGF165b была исследована в развивающемся глазе человека. VEGF165 в сосудистой сети плодного стекловидного тела экспрессируется рано во время эмбрионального развития и снижается после 12 WG, тогда как экспрессия VEGF165b появляется после того как сформируются кровеносные сосуды и увеличивается с возрастом беременности, когда эта сосудистая сеть регрессирует. В собственно сосудистой оболочке глаза (choroid), VEGF165 экспрессируется рано и в ходе всего развития, тогда как экспрессия VEGF165b появляется после того, как сформируются кровеносные сосуды и постоянно увеличивается с возрастом. В RPE, VEGF165 экспрессируется в базальной части RPE в ходе всего развития. тогда как экспрессия VEGF165b в ядрах и апикальной части RPE выражена на ст.21WG. В сетчатке, VEGF165 экспрессируется диффузно во внутренней части сетчатки и наиболее выражен перед формированием кровеносных сосудов. VEGF165b экспрессируется в ядрах и возможно в ядерной оболочке клеток в пуле предшественников INL (CXCR4+) и клетках, мигрирующих во внутреннюю часть сетчатки из пула, который состоял преимущественно CD39+/CXCR4+ сосудистых предшественников или ангиобластов (McLeod et al.,2006; Hasegawa et al.,2008). В терминах экспрессии существует определенно баланс между VEGF165 и VEGF165b во время сосудистого развития. Развивающися сосуды имеют больше VEGF165, ассоциированного с ними и мало или не содержат изоформу VEGF165b. Когда сосуды сформировались и стали зрелыми, то интенсивность иммунореактивности VEGF165 снижается и VEGF165b усиливается, подтверждая, что VEGF165b участвует в поддержании установившейся сосудистой системы и возможно в предупреждении дальнейшего ангиогенеза. Это особенно наглядно во временной плодной сосудистой сети стекловидного тела, где эта тенденция подтверждена с помощью qRT-PCR.

VEGF165 и VEGF165b генерируются с помощью альтернативного сплайсинга одного и того же гена, кодирующего VEGF-A. Эти система сплайсинга в RPE, как известно, регулируется ростовыми факторами (Nowak et al.,2008,2010). TGF-beta активирует p38/MAPK и последующие Clk/sty киназы. Clk фосфорилирует SR белковые сплайс-факторы, такие SRp55, который является ключевым регуляторным сплайс-фактором, соединяющимся с VEGF pre-РНК в области экзона 8b. SRp55 вызывает сплайсинг в DSS (distal splice-site selection) и продуцирует VEGF165b. С др. стороны, IGF (Insulin-like growth factor 1) активирует PKC (protein kinase C) и фосфорилирует ASF/SF2 (alternative splicing factor/splicing factor 2) посредством SR protein kinase SRPK1 (serine/arginine domain protein kinase 1). ASF/SF2 может соединяться с VEGF pre-РНК вокруг PSS (proximal splice-site selection) и в результате обеспечивает экспрессию VEGF165 (Nowak et al.,2008,2010). IGF-1, как было установлено, контролирует экспрессию VEGF посредством HIF1 alpha (hypoxia-induced factor-1 alpha) -зависимого и -независимого путей (Slomiany and Rosenzweig,2006). Сосудистая сеть развивается в физиологически гипоксичной ткани, где HIF 1 alpha обилен (Ozaki et al.,1999). В целом растущие сосуды нуждаются в VEGF165 и как только сосуды разовьются и уровни кислорода повысятся, происходит переключение в сплайсинге в ответ на снижение HIF-1 alpha/IGF-1 и в результате увеличивается экспрессия VEGF165b. TGF-? продуцируется перицитами и гладкомышечными клетками в зрелых кровеносных сосудах, чтобы поддерживать эндотелиальные клетки в покоящемся состоянии (Orlidge and D'Amore,1987; Walshe et al.,2009). Тот факт, что дифференцированные, но не дедифференцированные подоциты в гломерулах человека секретируют значительные количества VEGF165b белка подкрепляет эту идею (Cui et al.,2004) т.к. подоциты подобны перицитам в своих взаимоотношениях с эндотелиальными клетками.

Подавление VEGF165b было описано при ангиогенной патологии, такой как опухоль (Bates et al.,2002; Woolard et al.,2004; Pritchard-Jones et al.,2007; Varey et al.,2008), диабетическая ретинопатия (Perrin et al.,2005) и экспериментальная индуцированная кислородом ретинопатия (Konopatskaya et al.,2006). Эти исследования показали увеличение экспрессии VEGF165 и уменьшение экспрессии VEGF165b по сравнению с нормальными условиями, где VEGF165b является доминирующим сплайс-вариантом. Напр., 64% от общего количества VEGF в стекловидном теле составляло VEGFxxxb (сюда входят VEGF165b, VEGF121b, VEGF 145b, VEGF 183b, VEGF189b) у пациентов без диабета, тогда как только 12.5% от общего числа VEGF составляло VEGFxxxb у пациентов с диабетом (Perrin et al.,2005). Это исследование показывает, что происходит переключение сплайс-варантов с анти-ангиогенных на про-ангиогенные при диабетической ретинопатии, подтверждая, что VEGFxxxb может быть потенциальным терапевтическим воздействием при диабетической ретинопатии. Hua et al. продемонстрировали, что введение в стекловидное тело VEGF165b ингибирует вызванное лазером образование новых хороидальных сосудов в глазах мышей (Hua et al.,2010). Др. исследование с использованием модели вызванной кислородом ретинопатии в качестве экспериментальной модели неоваскуляризации предоставило более прямые доказательства анти-ангиогенного эффекта VEGF165b (Konopatskaya et al.,2006). В этой модели внутриглазное применение VEGF165b пептида достоверно ингибировало область неоваскуляризации в сетчатке с 23% сетчатки до 12% и, что интересно, увеличивалась нормальная сосудистая область с 62 до 74%. В нашем исследовании развивающаяся сосудистая сеть в её созидательном состоянии экспрессировала больше VEGF165 , а развившаяся васкулатура в стабильном или анти-ангиогенном состоянии имела преобладающим VEGF165b. Эти данные согласуются с предыдущими сообщениями о снижении VEGF165b при статусе ангиогенеза в патологических условиях.

VEGF165 и VEGF165b часто ассоциированы с эндотелиальными клетками развивающихся кровеносных сосудов. В сетчатке имеется существенное количество VEGF165 диффузно распределенное по внутренней сетчатке, включая и кровеносные сосуды в более поздние временные точки. Из иммуногистохимии остается неясным, какие клетки продуцируют его и является ли связанным или диффузно распределенным VEGF165. Однако в сосудистой сети стекловидного тела плодов VEGF165 и VEGF165b четко ассоциированы с эндотелиальными клетками, также как и с перицитами (Figs. 2,3) и существует только один не сосудистый тип клеток в тесной близи к некоторым сосудам, гиалоциты или дендритные клетки стекловидного тела. Возможно, что VEGF165 и VEGF165b, обнаруживаемые в этой сосудистой сети, были аутокринными по природе, продуцируемые и используемые эндотелиальными клетками сосудистой сетью плода, или паракринными, продуцируемые перицитами и направляем ые в соседние эндотелиальные клетки. Существует прецедент аутокринной продукции VEGF165 эндотелиальными клетками in vitro (Yamagishi et al.,1999; Bocci et al.,2001) , при этом перициты индуцируют эндотелиальные клетки к продукции фрагментов сосудов (Franco et al.,2011). Однако не производилось локальных исследований VEGF165b во время развития, так что до сих пор неизвестно происходит аутокринная или паракринная продукция этого сплайс-варианта.

VEGF165 в нашем исследовании обнаруживался в базальной порции RPE во время всего плодного развития. Напротив, VEGF165b не обнаруживался в RPE на очень ранних стадиях, но составлял существенную часть в апикальной порции RPE и в её ядрах после образования хориокапилляров. Гомеостаз хориокапилляров зависит от VEGF, секретируемого базальной частью RPE. Развитие и поддержание фенестраций в CC базируется на доступности происходящего из RPE VEGF (Marneros et al.,2005; Saint-Geniez et al.,2009). Наши находки VEGF165 в базальной части RPE указывают, что он может функционировать, чтобы стимулировать образование фенестраций во время развития. Мы наблюдали соприкасающиеся фенестрации в CC на ст. 21WG (Baba et al.,2009). Между тем иммунореактивность VEGF165b в апикальной части RPE может быть важной в предупреждении хороидальной васкулатуры от инвазии в субретинальное пространство. Неожиданно обе формы VEGF165 наблюдались на ст. 21WG в RPE в одних и тех же клетках. Это может указывать на зависимую от полярности экспрессию сплайс-вариантов VEGF в клетках RPE, а именно, VEGF165b в апикальной и VEGF165 в базальной части RPE. Однако, как две системы сплайсинга могут действовать одновременно в одной и той же клетке, неизвестно. В клетках RPE взрослого человека, используя ту же самую APase технику, что использовали мы в данном исследовании, мы обнаруживали VEGF165 наиболее выраженным в белых клетках крови в сосудистой оболочке глаза (choroid) и не обнаруживали в клетках RPE (Bhutto et al.,2006), хотя Saint-Geniez с сотр. обнаружили мРНК VEGF165 в RPE взрослых людей (Saint-Geniez et al.,2006). VEGF165b не обнаруживался в ассоциации с RPE у взрослых людей с помощью APase иммуногистохимии, но ассоциировал с хороидальными кровеносными сосудами (unpublished data).

Локализация VEGF165b и отсутствие VEGF165 в ядре, также неизвестны. Альтернативный сплайсинг не генерирует или не экспозирует последовательности для ядерной транслокации (unpublished data). VEGFR-1 транслоцируется в ядро при некоторых условиях (Cai et al.,2006), известно, что оба сплайс-варианта соединяются с VEGFR-1 (Bates et al.,2003). Также неизвестно, почему ядерная локализация VEGF165b столь выражена в клетках предшественниках в сетчатке, т.к. он имеет ядерную локализацию в полностью дифференцированных эндотелиальных клетках и перицитах в сформированных кровеносных сосудах стекловидного тела. VEGF165b из перицитов может участвовать в стабилизации этих развивающихся сосудов. Недавнее исследование продемонстрировало защищающий клетки потенциал у VEGF165b (Magnussen et al., 2010) и также защищающий нейроны потенциал у VEGF165 (Saint-Geniez et al.,2008). Вообще-то присутствие диффузного VEGF165 во внутреннем нейробластном слое и ядерного VEGF165b в нейрональных предшественниках в этом слое необходимо для жизнеспособности нейронов во время состояния ремоделирования при развитии сетчатки.

Итак, данное исследование впервые продемонстрировало пространственную и временную локализацию VEGF165b в развивающейся кровеносной сети глаз плодов человека. VEGF165b и VEGF165 часто обнаруживают чётко отличающуюся локализацию др. от др. в изученных тканях: сосуды стекловидного тела плода, сетчатка и choroid. В сетчатке, безусловно, VEGF165 встречается как внеклеточно (диффузно) , так и в ассоциации клеток при конфокальном (Fig. 7) и APase анализе (Figs. 8,9), тогда как VEGF165b, по-видимому, ассоциирован в основном с клетками. Мы сконцентрировались на анти-ангиогенной форме VEGF, VEGF165b, и установили четкие изменения в экспрессии во время васкулогенеза и гемо-васкулогенеза. VEGF165 преимущественно экспрессировался во время развития сосудов, а экспрессия VEGF165b была наиболее выраженной в развитой сосудистой системе. Этот драматический молекулярный сдвиг в сплайсинге VEGFA из VEGF165 в VEGF165b во время сосудистого развития предоставляет информацию о новой системе формирования и поддержания сосудистой системы с помощью VEGF165b.