Неблагоприятными последствиями старения являются дегенерация и функциональная неспособность многих тканей тела, которые часто ведут к болям и потере подвижности. У человека межпозвоночные диски (IVD) часто портятся и, как полагают, вызывают в большинстве случаев боли нижнего отдела спины. В США свыше 85% людей страдают болями в спине с определенного момента своей жизни, затраты на лечение этих распространенных болей в спине составляют приблизительно 100 биллионов долларов ежегодно (Andersson,1999; Katz,2006; Smith et al.,2011). Современное лечение повреждений дисков включает противовоспалительное лечение болей и артропластику дисков (замещение искусственным диском)(Mirza and Deyo,2007). Хотя импланты восстанавливают подвижность, но они приходят со временем в негодность (Hanley et al.,2010).

Функции IVD позвоночных противостоят компрессивным нагрузкам, направленным на позвоночный столб, поскольку наделяют его структурной поддержкой и гибкостью. У млекопитающих диск состоит из двух разных частей, студенистого ядра (nucleus pulposus) фиброзных колец (annulus fibrosus). Центральное студенистое ядро является похожей на гидрогель структурой, состоящей преимущественно из протеогликанов. Фиброзные кольца окружают студенистое ядро и состоят из слоев из пучков волокон коллагена I расположенных в противоположных направлениях и менее организованных слоев волокон коллагена II (Humzah and Soames,1988; Smith et al.,2011). Разрушение протеогликанов в студенистом ядре и натеки (tears) в фиброзных кольцах могут приводить к изнашиванию дисков.

У мышей эмбриональная хорда присутствует с эмбрионального дня (E) 7.5 вплоть до E12.5. Предыдущая работа нашей лаб. продемонстрировала, что хорда эмбрионов мышей формирует все клеточные типы в студенистом ядре (Choi et al.,2008; Choi and Harfe,2011). Студенистое ядро сохраняется в течение всей взрослой жизни, как у мышей, так и людей. Принимая во внимание роль хорды как сигнального центра во время образования у эмбрионов позвоночного столба, возможно, что клетки, происходящие из хорды, продолжают регулировать морфологию дисков и у взрослых (Hunter et al.,2003; Smith et al.,2011). Эти клетки могут служить в качестве популяции стволовых клеток, чтобы замещать поврежденные клетки в дисках и они могут секретировать белки, которые обладают потенциалом, индуцировать клеточные деления в поврежденных ядрах pulposi.

Молекулярные пути, отвечающие за образование межпозвонковых дисков, сходны у всех млекопитающих, что подтверждается структурой IVD у организмов, таких как человек, собаки, кролики и свиньи (Walmsley,1953; Butler,1989; Alini et al.,2008; Kong et al.,2008). У мышей было продемонстрировано, что клетки хорды вносят вклад с студенистое ядро и что хорда исчезает во время позднего эмбрионального развития (Walmsley,1953; Choi et al.,2008).

Клеточное происхождение фиброзных колец менее ясно. Предполагается, что фиброзные кольца происходят из склеротома, вентральной части каждого из сомитов (Bagnall and Sanders,1989; Goldstein and Kalcheim,1992; Huang et al.,1994). На ст. E12 у мышей клетки склеротома мигрируют в направлении срединной линии и конденсируются вокруг хорды (Christ and Wilting,1992). Эти сформировавшиеся конденсаты имеют регионы, которые отличаются плотностью клеток (Rufai et al.,1995). Наиболее компактные конденсаты позднее дают тела позвонков, тогда как те, что менее плотные, как было установлено, принимают морфологию фибробластов. Это регион позвоночного столба, поверх которого ламеллы формируют фиброзные кольца (Christ and Wilting,1992; Rufai et al.,1995).

Поскольку большая часть развития позвоночного столба охарактеризована на модельных мышах, развитию межпозвонковых дисков у кур было уделено мало внимания. Во время первичной гаструляции параксиальная мезодерма в сегментной пластинке эпителизируется, чтобы сформировать первые 28 пар сомитов (Deries et al.,2010). Затем в течение второго дня развитие сомитов эмбрионов кур подвергается кранио-каудальной поляризации, в результате чего разделяются краниальный и каудальный компартменты, которые в дальнейшем выполняют разные онтогенетические цели; в частности, эпителиально-мезанхимный переход, обеспечиваемый секретируемыми сигналами от окружающих тканей, дает склеротомы (Deries et al.,2010), вентральную часть мезенхимы, и дермамиотом из дорсального слоя эпителиальной ткани (Christ and Wilting,1992; Christ et al.,2000; Brent et al.,2003). Когда формируются позвонки, то происходит ресегментация склеротома вдоль барьера, отделяющего каждый полусомит-наз. von Ebner's щелью-так, что краниальная порция одного сомита и каудальная порция соседнего сомита вносят вклад в тело одного позвонка (Bagnall and Sanders,1989).

Компоненты осевого скелета, включая тела позвонков, дуги позвонков, остистые отростки, проксимальные части ребер и межпозвонковые диски, как полагают, происходят из разных субпопуляций клеток внутри склеротома (Brent and Tabin,2002; Brent et al.,2003). Сегодня встречаются противоречивые сообщения относительно того, какая половинка склеротома дает диск, исходя из исследований судеб полусомитов у эмбрионов кур. Bagnall и Sanders установили, что каудальный полусомит вносит вклад в образование диска, на базе окрашивания лектинами арахиса (Bagnall and Sanders,1989), также как и эксперименты Huang et al. с использованием трансплантаций между перепелом и курицей (Huang et al.,1994). Однако, Goldstein и Kalcheim сообщают, что ростральный полусомит ответственен за образование диска (Goldstein and Kalcheim,1992).

Используя липофильный флюоресцентный зонд DiI (1,1', di-octadecyl-3,3,3',3',-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate) и DiA (4-(4-(dihexadecylamino)styryl)-N-methylpyridinium iodide), мы картировали судьбы разных регионов каждого полусомита у кур. У мышей, передняя часть склеротома была мечена с использованием Tbx18:Cre аллеля (Cai et al.,2008). Базируясь на нашем анализе клонов у мышей и кур, мы предположили, что клетки от рострального полу-склеротома вносят вклад в каудальную половину тела позвонка и в межпозвонковый диск, тогда как каудальный полу-склеротом вносит вклад в ростральную половину соседнего позвонка. Кроме того, наш анализ выявил, что хорда персистирует в течение всего эмбрионального развития кур, приводя отсутствию студенистых ядер в межпозвонковых дисках кур. Проверка др. видов показала, что студенистые ядра обнаруживаются только у млекопитающих.

DISCUSSION

Источник межпозвонковых дисков у кур дебатировался десятилетиями. Используя липофильные флуоресцентные зонды DiI и DiA, чтобы получить карты судеб клеток, происходящих из склеротомов, мы установили, что ростральный полу-склеротом является частью сомита, которая ответственна за образования межпозвонкового диска у кур. В соответствии с экспериментами на курах, картирование судеб передней части склеротома у мышей показало, что фиброзные кольца состоят из склеротомных клеток. В свете этих наблюдений и хорошо описанной ресегментации склеротома, которая предшествует образованию позвонков (Christ and Wilting,1992; Goldstein and Kalcheim,1992; Christ et al.,2000; Brent et al.,2003), мы предложили модель, согласно которой клетки из рострального полу-склеротома вносят вклад в образование каудальной части тела позвонка и межпозвонкового диска, тогда как каудальный полу-склеротом вносит вклад в ростральную половину соседнего позвонка (this model is shown in Fig. 5).

Figure 5. The rostral half-sclerotome forms the chicken intervertebral disc and the caudal region of adjacent vertebrae. In this figure, the caudal vertebrae is marked "R" to denote the origin of cells that form this structure. R, rostral; C, caudal; IVD, intervertebral disc.

Ранее, используя мышиную модельнуюсистему мы показали, что эмбриональная хорда формирует студенистое ядро диска (Choi et al.,2008). У кур наш анализ по картированию судеб показал, что хорда не вносит вклада в какие-либо структуры позвонков, присутствуя во время всего эмбриогенеза, что согласуется с нашими гистологическими данными, продемонстрировавшими, что студенистые ядра обнаруживаются только у млекопитающих. Судьба клеток хорды во время постнатального развития кур неясна и мы не можем исключить возможность, что некоторые клетки хорды формируют часть позвонков, как это было постулировано для развития позвонков у рыб (Hyman,1992).

Предлагаемая нами модель подтверждает данные, представленные Goldstein и Kalcheim (Goldstein and Kalcheim,1992). Однако они противоречат экспериментам Bagnall and Sanders' по связыванию лектинов арахиса (Bagnall and Sanders,1989) и картированию судеб у перепел-курица химер Huang et al. (1994), которые предположили, что каудальный полу-склеротом образует диск. Мы предприняли эксперименты по мечению краской, которые не соответствовали трансплантациям клеток между разными организмами и были более чувствительными, чем окрашивание лектинами арахиса. Кроме того, ни одна из техник, использованных в предыдущих исследованиях не была способна маркировать две разные популяции клеток одного и того же сомита. Наши данные строго подтверждают гипотезу, что межпозвонковые диски у кур состоят из клеток, происходящих из рострального полу-склеротома.

У кур хорда персистирует в течение всего эмбрионального развития и продолжает экспрессировать Shh. У мышей образование позвонков завершается приблизительно в то время, когда хорда формирует студенистые ядра. Хотя эмбриогенез мышей и кур продолжается в течение 21 дня, образование систем органов варьирует существенно. Напр., развитие конечностей у эмбрионов кур начинается примерно 2.5 дней спустя после оплодотворения, тогда как зачатки конечностей у мышей не образуются вплоть до 9.5 дня после оплодотворения (Martin,1990; Hamburger and Hamilton,1992). Время образования позвоночного столба также существенно варьирует между мышами и курами. У мышей позвоночный столб оказывается сформированным примерно спустя 13 дней после оплодотворения, тогда как образование позвонков у кур продолжается вплоть до рождения (Christ and Wilting,1992; Hamburger and Hamilton,1992; Tam and Trainor,1994; Christ et al.,2000; Choi and Harfe,2011). Поскольку SHH играет существенную роль в формировании паттерна и позвонков персистенция хорды у кур может быть необходима для поддержания экспрессии Shh во время позднего эмбриогенеза.

У млекопитающих фиброзные кольцевые слои образуются вокруг и в конечном счете окружают студенистое тело. Однако происхождение клеток фиброзных колец оставалось неизвестным. Наши эксперименты по картированию судеб у мышей показали, что, по крайней мере, частично передняя часть фиброзных колец у мышей происходит из склеротома. Только Tbx18 экспрессируется в передней части склеротома. Возможно, что задняя часть фиброзных кольцевых слоёв происходит из задней части склеротома.

Отсутствие студенистых ядер у всех организмов помимо млекопитающих довольно неожиданно. Синергичные функциональные взаимоотношения между фиброзными кольцами с студенистым ядром делает возможными как униформное распределение нагрузок при сжатии между позвонками, так и сложные движения межпозвонковых соединений. Студенистое ядро, как полагают, необходимо для гибкости позвоночного столба, существенно для поглощения удара и для противостояния компрессии спинного мозга за счет распределения гидравлического давления (Hunter et al.,2003; Smith et al.,2011). Кажущееся отсутствие студенистых ядер у организмов помимо млекопитающих указывает на то, что позвоночный столб этих организмов или не нуждается в этих специфичных для студенистого ядра функциях или что уникальная композиция их дисков может замещать функционально студенистые ядра в межпозвонковых пространствах.

У всех исследованных не млекопитающих организмов помимо Мексиканского аксолотля и Fire-bellied жаб, межпозвонковые диски состоят из коллагенового белка. В данной работе мы показали, что у кур клетки диска происходят из сомитов и что хорда не включается в состав дисков. Кроме того, мы продемонстрировали, что фиброзные кольца мышей, по крайней мере, частично происходят из склеротома. У Мексиканского аксолотля и Fire-bellied жаб, межпозвонковые диска состоят преимущественно из гликозамингликанов и небольшого количества коллагена. В отличие от клеток др. не млекопитающих диски амфибий содержат вакуоли и напоминают клетки хорды. Одной из интерпретаций этих данных , по крайней мере, частично то, что диски амфибий происходят из хорды, а не сомитов и могут напоминать примитивное студенистое пятно. Наше картирование судеб у мышей и кур и анализ экспрессии T (Brachyury) показывают, что ткань, присутствующая в дисках не млекопитающих, эквивалентна фиброзным кольцам млекопитающих. Эти данные подтверждают, что "примитивные" межпозвонковые диски состоят из annulus fibrosis-подобных структур и что образования студенистых ядер из хорды происходит только у млекопитающих.