Carell и Lomas [7] ввели термин «конформационные болезни» (“conformational diseases”), чтобы объединить болезнь Альцгеймера, инфекционную губчатую энцефалопатию, болезнь Крейцфельдта-Якоба и амилоидоз. Согласно этим авторам, конформационные болезни «… возникают, когда конститутивные белки подвергаются изменениям в размере или флуктуациям формы, в результате чего происходит их самосборка и отложение в тканях». По крайней мере, часть белка уложена правильно при реализации его в физиологическую форму, a конформационные болезни возникают в результате их посттрансляционной модификации. На этот процесс влияют генетические факторы и первичная структура белка. Большинство наших знаний о конформационных болезнях исходит из изучения амилоидоза.

Амилоид.

Амилоид определяют как белковые отложения в ткани, имеющие следующие признаки:

1) типичное зеленое двойное преломление в поляризованном свете после окраски Конго красным (рис.1);

2) присутствие неветвящихся линейных фибрилл неопределенной длины с диаметром около 10-12 nm (Рис.1) [66];

3) характерный Х-ray паттерн, соответствующий модели перекрестных b-фибрилл Паулинга.

Электронно-микроскопические исследования показали, что амилоидные фибриллы содержат сердцевину, состоящую из пентосомальных частиц, имеющих признаки Р-амилоидного компонента (АР, Рис.1). «Обмотка» вокруг нее представляет собой двухрядную лентоподобную структуру, идентифицированную как хондроитин сульфат протеогликан (CSPG) [22]. Эту структуру дополнительно покрывает лентовидная двухрядная структура (double-tracked), охарактеризованная как гепаран (heparan) сульфат протеогликан (HSPG,Рис.1). Фибриллярный белок формирует внешнюю структуру. Основная архитектура амилоидных фибрилл сходна с микрофибриллами эластичной ткани [22]. Происхождение амилоида разнообразно и уже описано свыше 20 фибриллярных белков. Предшественники большинства фибриллярных белков отличаются друг от друга по их первичной структуре и функции. Фибриллярные белки образуются из аполипопротеинов (аполипопротеин АI, аполипопротеин АII и сывороточный амилоид А), протеогормонов (атриальный натрийуретический пептид, кальцитонин, инсулин, островковый амилоидный полипептид и пролактин) иммуноглобулинов (l- и k-легкие цепи, тяжелые цепи), протеаз (лизосомы), ингибиторов протеаз (цистатин), трансмембранных белков (белок-предшественник амилоида), транспортных белков (транстиретин) и других (gelsolin, фибриноген, lactadherin, лактоферрин, b2-микроглобулин). Единственным признаком, общим для всех этих белков, является их способность образовывать агрегаты при специфических условиях, которые приводят к образованию и отложению амилоида. Такие депозиты могут быть локальными, органоспецифичными или генерализованными и они могут поражать любой орган или тип ткани. Однако патерн распределения амилоида зависит от происхождения и типа фибриллярного белка, который откладывается в ткани.

Амилоидоз

Амилоидоз означает состояние болезни, при котором образуются отложения амилоида. Симптомы зависят от паттерна распределения и количества депозитов. И хотя специфическая комбинация клинических симптомов может с высокой степенью указывать на амилоидоз у пациента, клиническая картина разных амилоидных болезней может быть вариабельной. Более того, один и тот же пациент может страдать от разных амилоидных заболеваний одновременно. Данный обзор сфокусирован только на реактивном или вторичном типе амилоидоза (АА амилоидоз).

АА амилоидоз

Эпидемиология

Примерно 45% всех генерализованных амилоидозов являются АА амилоидозами. Начало заболевания обычно внезапно, а его причинами являются ревматические заболевания (ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный артрит), идиопатические болезни (саркоидоз, болезнь Крона, язвенный колит и Rosai-Dorfman болезнь), наследственные болезни (семейная Средиземноморская лихорадка, tumor factor receptor associated periodic fever syndrome), инфекционные болезни (туберкулез и проказа) и злокачественные опухоли (мезотелиома и болезнь Ходжкина) [50, 61]. Абсолютная и относительная распространенность индивидуальных заболеваний, ассоциированных с АА амилоидозом, показывает значительные географические и временные различия. До середины ХХ века туберкулез был одним из наиболее обычных причин амилоидоза на Западе. Т.к. заболеваемость туберкулезом снизилась, благодаря успешному лечению антибиотиками, основными причинами АА амилоидоза стали хронические ревматические и воспалительные идиопатические болезни [59, 73]. Однако в странах Третьего Мира и на Индийском субконтиненте главными причинами АА амилоидоза все еще остаются хронические инфекционные заболевания, такие как туберкулез и проказа. Примерно в 5% случаев причины АА амилоидоза неизвестны.

Патология АА амилоид сначала откладывается в селезенке, затем в печени и почках, после чего обнаруживают его генерализованные васкулярные и интерстициальные депозиты. Причина такого временного порядка амилоидных отложений неизвестна. Т.к. белком-предшественником АА амилоида (см. ниже) является аполипопротеин, можно высказать предположение, что амилоид обнаруживается сначала в селезенке, печени и почках из-за того, что они являются основными органами метаболизма липидов и холестерина (см.ниже). Однако требуется экспериментальное подтверждение этой гипотезы.

Клинические признаки Протеинурия является чаще всего первым клиническим признаком генерализованного АА амилоидоза, и тяжесть альбуминурии коррелирует с прогнозом течения заболевания у больного [25]. Обширное поражение сердца приводит к сердечной недостаточности. Была описана адренокортикальная недостаточность, обусловленная отложениями амилоида в надпочечниках, которая обычно ассоциируется с обширным почечным амилоидозом.

Диагноз Для диагноза и классификации амилоида необходимы гистологические исследования. Никакие клинические или лабораторные тесты пока еще не заменили гистологический метод. Чувствительность и специфичность гистологического диагноза зависит от выбора и адекватности выбранного кусочка ткани, количества отложений амилоида в полученном образце, качества оборудования (хорошая поляризация является обязательной) и квалификации патогистолога. Т.к. АА амилоидоз является генерализованным заболеванием, он может быть диагностирован при исследовании любой из амилоид-содержащей ткани, но чаще всего применяют биопсию подкожного жира, почек, прямой кишки и печени. Когда амилоид присутствует в небольших количествах, он может быть не выявлен. Если он присутствует в значительных количествах, он может быть неправильно принят за эластоз кожи и ткани груди или коллагенозный колит при кишечной биопсии. Точная классификация типа амилоида очень важна, так как правильное лечение может значительно задержать прогрессирование заболевания. При подозрении на амилоид необходима окраска Конго красным с последующим анализом препарата в пляризованном свете в затемненном помещении. После установления диагноза амилоид классифицируют либо иммуногистохимически с использованием специфических антител против определенных фибриллярных белков [59], либо биохимически путем экстрагирования фибриллярных белков из нативной или фиксированной в формалине амилоидной ткани с последующим аминокислотным секвенированием белка. И, наконец, гистопатологический диагноз и классификация амилоида должны быть скоррелированны с клинической картиной, т.к. полученная клиническая информация может вводить в заблуждение исследователя. Например, пациент с плазмацитомой (которая может ассоциироваться с АL амилоидозом) может также страдать ревматоидным артритом (который может ассоциироваться с АА амилоидозом), о котором патолог не осведомлен.

ПАТОГЕНЕЗ АА АМИЛОИДОЗА

Патогенез АА амилоидоза был исследован следующими способами:

1. Изучением морфологических и биохимических составляющих амилоида человека.

2. Исследованиями у различных видов животных. Было обнаружено, что заболевание встречается у собак, кошек, гепардов, тигров, зайцев, каменных куниц, норок, крупного рогатого скота, лошадей, овец, горных газелей, кроликов, хомячков, морских свинок, летучих мышей, цыплят и уток [24, 57, 90]. Как и у человека, заболевание у животных обычно ассоциируется с хроническим воспалительным процессом. АА амилоидоз поражает также мышей, которых в течение многих лет используют в качестве животных моделей для изучения амилоидогенеза. Именно они дали большинство информации для понимания этого заболевания.

3. Исследованиями in vitro, включающими эксперименты на клеточных культурах, а также изучением белковых и структурных биохимических особенностей.

Эти исследования показали, что патогенез АА амилоидоза зависит от нескольких отличных друг от друга факторов (Рис.2).

Белки-предшественники

Сывороточный амилоидный А белок (SAA) является предшественником АА фибриллярного белка, откладывающегося при АА амилоидозе. У человека SAA гены локализованы на хромосоме 11р15.1 [19, 43]. SAA белки относятся к семейству гомологичных белков, которые делят на две группы. Первая группа включает острофазовые белки типа-I, синтезированные печенью - SAA1 и SAA2 (SAA1+2). Во время острофазового ответа (реакции) концентрация SAA1+2 в сыворотке должна увеличиться почти в 1000 раз, чтобы достичь концентрации 1-2 mg|ml [19, 43]; 80% из них связаны с липопротеинами и 90% из этих белков связаны с липопротеинами высокой плотности (HDL) [19, 43]. Вторая группа SAA белков (SAA4 у человека и SAA3 у мышей) экспрессируется постоянно и их концентрация в плазме составляет около 55mg|ml; SAA4 у человека синтезируется различными органами и тканями и не является острофазовым белком [19]. Физиологические функции SAA белков были недавно описаны в обзоре Uhlar and Whitehead [35, 77]. Пока еще неясно, как эти функции связаны с патогенезом АА амилоидоза.

Острофазовый ответ

Уже давно хорошо известно, что АА амилоидоз возникает после длительного периода воспалительного и/или инфекционного заболевания. Следовательно, нет оснований подозревать амилоидоз на ранних стадиях хронических или рецидивирующих воспалительных заболеваний. Однако в редких случаях он может появиться в течение года при клинически выраженном воспалительном процессе [60]. АА амилоидоз не встречается в отсутствие острофазового ответа или в отсутствие повышенного уровня сывороточного SAA. Синтез и секреция острофазового SAA опосредуется цитокинами, главным образом интерлейкином (IL)-1, IL-6 и фактором некроза опухоли (TNF)-a [12, 19, 43]. АА амилоид, встречающийся при злокачественных заболеваниях, таких как мезотелиома или болезнь Ходжкина, или при идиопатических болезнях, таких как саркоидоз, может быть «запущен» (индуцирован) цитокинами, синтезированными и секретируемыми опухолевыми или гистиоцитными клетками. Эти цитокины генерируют систематический острофазовый ответ и, таким образом, индуцируют синтез SAA и способствуют развитию АА амилоидоза. Прогрессирующий характер АА амилоидоза в значительной степени отражает природу условий, лежащих в основе процесса и, вследствие флуктуаций активности заболевания, не у всех пациентов наблюдают острофазовый ответ во время постановки диагноза.

Генотип и первичная структура

Первичная структура SAA влияет на его способность формировать фибриллярные белки. У амилоид-чувствительных мышей, SAA1.1 является единственным предшественником АА фибриллярных белков. Он отличается от SAA2.1 девятью аминокислотами. В сравнении с другими мышиными моделями, инбредные мыши линии Сe/J резистентны к амилоидозу из-за уникальной первичной структуры их острофазового SAA, который представляет собой смесь SAA1.1 и SAA1.2 и обозначается как SAACE/J или SAA2.2. SAA2.2 отличается от SAA1.1 пятью аминокислотами и от SAA2.1 шестью аминокислотами [67]. У человека пока не установлена связь специфической последовательности аминокислот с амилоидозом, но, оказалось, что генотип влияет на частоту возникновения заболевания. SAA1.3 генотип более распространен у больных с АА амилоидозом, чем у больных, страдающих ревматоидным артритом, без амилоидоза [6, 48, 49]. Исследования с использованием синтетических пептидов показали, что первые 10-15 аминокислот молекулы являются наиболее важными при образовании амилоидных фибрилл [81]. Все АА фибриллярные белки, проанализированные к настоящему времени, имеют интактный N-конец, охватывающий (spanning) эту область.

Mетаболизм липопротеина

SAA, прикрепленный к HDL (HDL_SAA) является источником тканевого АА фибриллярного белка [20, 74]. Существуют некоторые доказательства для поддержания гипотезы о связи между метаболизмом аполипопротеинов и липопротеинов и патогенезом амилоида; амилоидные депозиты появляются сначала в органах и тканях, которые являются основными местами липидного и холестеринового метаболизма (селезенка и печень). Более того, иммуногистохимические исследования и секвенирование белков показали наличие других аполипопротеинов в HDL фракции - аполипопротеина А-I (apo A-I) и аполипопротеина Е (apo E) в АА депозитах [28]. Думали, что Аpo Е и HDL играют основную роль в обратном (реверсивном) метаболизме холестерина, который заключается в транспорте холестерина из периферических клеток к печени для реутилизации или кишечной экскреции в желчь. Макрофаги (m?), нагруженные липидами и холестерином служат моделью in vitro для изучения выведения (efflux) холестерина и, следовательно, как источник избыточных плазменных липидов. Количество холестерина, выделенного из (m?) в HDL значительно увеличивается при синтезе и присутствии apo Е. Более того, изменения в липидном составе липопротеиновой частицы может вызвать изменение в ее белковом составе. Хотя apo A-I и apo A-II могут перемещать SAA из HDL [21], эффект варьирования липидного состава при связывании SAA еще неизвестен. HDL_SAA связывается с m? и захватывается им [37, 58], и макрофаг способен производить амилоидные фибриллы из SAA in vitro [36].

Рецепторы

Недавно было показано, что мышиный острофазовый SAA и мышиные АА фибриллярные белки связываются с клеточным поверхностным рецептором of advanced glycation end product (RAGE), который является рецептором сигнальной трансдукции и не приводит к захвату (интернализации) SAA/AA фибриллярных белков [89]. Однако после связывания с RAGE , сигнальная трансдукция опосредуется p21^ras, митоген-активированными киназами, ERK1 и ERK2 [75,89]. Начало амилоидоза задерживается, если связывание острофазового SAA или АА фибриллярного белка с RAGE блокируется [89], но механизм этого процесса пока неясен. Более того, было показано, что HDLSAA связявается и подвергается эндоцитозу макрофагами [30,37,58], что предполагает рецептор-опосредованный путь интернализации для HDL_SAA по сравнению с таковым для других липопротеинов. Интернализация HDL_SAA может быть опосредована через связывание SAA с другим специфическим рецептором, отличным от RAGE [30], и на это взаимодействие влияют клеточные поверхностные гликозаминогликаны [58]. Таким образом, существует доказательство, по крайней мере, для двух рецепторов, которые связывают SAA и АА фибриллярные белки. Предположение об их участии в патогенезе АА амилоидоза требует дальнейших исследований.

Нуклеация и конформационные изменения

Так как амилоидоз относится к конформационным заболеваниям, то любые изменения во вторичной структуре SAA могут оказывать влияние на сборку белковых агрегатов и амилоидных фибрилл. Амилоид-усиливающий (ускоряющий) фактор (amyloid-enhancing factor, AEF) [33], гликозаминогликаны [42], белки базальной мембраны [31,42] могут облегчать конформационные изменения, действуя как «скаффолды» (scaffold - подпорки, подмостки, строительные леса in engl, т.е. действуя как «помощники».). Связывание SAA с любыми из этих компонентов может индуцировать конформационные изменения в направлении b-структурного образования белка и с этого момента формировать амилоид [31, 33, 42]. Шелк, имеющий β-уложенную вторичную структуру, также может служить в качестве «скаффолда». Внутривенное введение шелка ускоряет образование депозитов АА амилоида у мышей [34].

AP компонент

АР компонент был обнаружен в депозитах при всех известных к настоящему времени амилоидных заболеваниях. АР идентичен сывороточному амилоидному Р компоненту (SAP) -N-гликозилированному сывороточному белку, который принадлежит к группе пентраксинов (pentraxin) и гомологичен С-реактивному белку [54]. SAP присутствует в плазме как пентамер, способный активировать классическую систему комплемента [54]. Он синтезируется и метаболизируется в печени [54] и связывает амилоидные фибриллы, фибриллярные белки и сульфатные гликозаминогликаны [54]. SAP является физиологическим компонентом гломерулярной базальной мембраны почек, базальной мембраны кожи, легких, печени и кровеносных сосудов, также как и компонентом микрофибрилл, которые покрывают эластичные мембраны [54]. Эти микрофибриллы имеют структурное сходство с амилоидными фибриллами [22].

SAP может оказывать влияние на патогенез АА амилоида следующим способом: он может стимулировать фибриллогенез, связывая фибриллярные белки; он может защищать амилоидные фибриллы от протеолиза и он может быть структурным компонентом [22,54]. Однако исследования SAP-дефицитных мышей показали, что SAP увеличивает образование АА амилоида до тех пор, пока не появляется влияние деградации [76, 78]. Кроме предполагаемой патофизиологической роли SAP, меченый (радиоактивно) SAP используют в диагностике [14]. Количество SAP в АА амилоиде коррелирует со степенью амилоидного заболевания [14, 15]. Плазменный клиренс SAP также коррелирует с тяжестью заболевания и увеличивается в преддверии амилоидоза (вероятно до отложения амилоида?). Радиоактивный SAP быстро включается в АА амилоидные депозиты и остается там в течение нескольких месяцев [14]. Это может быть использовано в диагностических целях для оценки степени амилоидоза и эта процедура уже была применена для определения стадии заболевания у нескольких сотен больных амилоидозом [14].

ApoE

ApoE был обнаружен в депозитах при разных амилоидных болезнях. Ему было уделено специальное внимание, потому что на возникновение и заболеваемость спорадической несемейной формы болезни Альцгеймера влияет совокупность apoE аллелей [63]. Статистические исследования показали, что на клиническое течение этой формы болезни Альцгеймера влияют apoE аллели - носители ε4 аллеля имеют более высокую частоту и более раннее начало заболевания, чем носители остальных аллелей, но ε4 аллель не влияет на продолжительность болезни Альцгеймера и летальность [63]. ApoE связывается с HDL и предполагали, что они играют основную роль в реверсионном метаболизме холестерина, т.е. в его транспорте от периферии к печени (см. выше). Apo E был также обнаружен в амилоидных депозитах и он выделяется вместе с фибриллярными белками [11, 28]. Следовательно, возможно, что Apo Е играет определенную роль в патогенезе АА амилоидоза, но это пока еще не доказано [27, 41, 52]. Тем не менее было показано, что ApoЕ влияет на амилоидогенез у «нокаутных» мышей: apoE ускорял образование депозитов АА амилоида, но не оказывал влияния на патерн распределения депозитов, и отсутствие (или недостаток) apo Е не предотвращало образование АА амилоида [17, 26]. Неизвестно, как apoЕ опосредует этот эффект.

Гликозаминогликаны и белки базальной мембраны

АА амилоидоз, подобно большинству амилоидных заболеваний, характеризуется временным и пространственным совместным отложением белков базальной мембраны и гликозаминогликанов (GAGs) [42]. Ламинин, коллаген типа IY и фибронектин обнаружены в АА амилоидных депозитах [31, 42]. Транскрипция этих белков регулируется (upregulated) во время или непосредственно перед образованием амилоида и на этом основании полагали, что они могут влиять на фибриллогенез после нарушения целостности интерстициального матрикса [1,82]. Ламинин связывает SAA с высокой аффинностью [2]. Биохимические исследования поддерживают результаты морфологических исследований; хондроитин сульфат, дерматан (dermatan) сульфат, heparan сульфат, гиалуронан, СSPG и HSPG, все они были обнаружены в амлоидных депозитах [31, 42]. Значимость галактозаминогликана и GAG композиции для структуры или патогенеза АА амилоида и структуры амилоидных фибрилл полностью не понята. Однако GAGs и протеогликаны связывают фибриллярные белки и АР [31, 42, 54]. Человеческий и мышиный SAA содержат связывающие сайты, специфичные для гепарин/гепаран сульфата [3]. В экспериментах in vitro с использованием различных GAGs показано, что только гепаран сульфат увеличивал количество β-sheet мышиного амилоидогенного SAA. [8, 45]. Было также показано, что ламинин связывает мышиный SAA с высокой аффинностью [2] и это дает возможность постулировать, что связывание SAA с компонентами интестициального матрикса, такими как ламинин и GAGs, может облегчать нуклеационные события, приводящие к фибриллогенезу [2, 3]. Эту гипотезу остается подтвердить в исследованиях in vivo. Клеточная поверхность покрыта GAGs и взаимодействие SAA и GAGs может здесь происходить скорее, даже быстрее чем в interstitium.

Протеазы

У больных с АА амилоидозом фибриллярный белок является продуктом расщепления белка-предшественника путем протеолиза. [19]. АА фибриллярный белок состоит из интактного N-конца, но имеет нехватку между 18 и 83 аминокислотами на С-конце (Рис.3). Таким образом, N-конец SAA является критическим в образовании фибрилл и способ (путь), посредством которого происходит расщепление SAA важен для патогенеза амилоидоза. В нескольких экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что амилоид является протеазочувствительным и что амилоидоз обратим. Использование антител против фибриллярных белков может привести к деградации депозитов [18]; это также требует активности протеаз. Таким образом, протеазы и протеолиз SAA, фибриллярного белка и амилоидных депозитов может влиять на патогенез и клиническое течение АА амилоидоза следующими путями (Рис.4):

а. Протеолиз неамилоидного белка-предшественника может высвобождать фибриллярный белок и способствовать амилоидогенезу. Такой механизм встречается при Аb-амилоидозе, который обычно ассоциируется с болезнью Альцгеймера [63]. Но еще нет доказательств, что этот путь годится для АА амилоидоза, с тех пор как было показано, что белок-предшественник является потенциально амилоидогенным [84, 85].
b. Протеолиз амилоидогенного белка-предшественника может происходить до, во время или после фибриллогенеза. Протеолиз до образования амилоида может иметь разные эффекты в зависимости от участка расщепления; он может увеличивать фибриллогенез, продуцируя фибриллярные белки, которые являются более склонными к самосборке, чем белки-предшественники, или он может предотвращать фибриллогенез посредством деградации белка-предшественника в районе наиболее важном для самосборки, таком как N-терминальный конец SAA [81] (Рис.4a). Предварительные исследования показали, что расщепление в N-терминальном конце SAA предотвращает образование амилоида [5,10, 40, 55, 56, 71, 79, 80]. Протеолиз на С-терминальном конце может встречаться после того как уже образовался амилоид и таким образом, может удалять лишние пептиды [4, 32, 84] (Рис.4b). Протеолиз во время фибриллогенеза может влиять на сборку фибрилл. Гипотетически, латеральный рост «скаффолдов» может быть блокирован sterically C-терминальным концом. После расщепления этого фрагмента, латеральный фибриллярный рост может быть продолжен (Рис.4с).
с. Протеолиз после образования амилоида может не оказывать никакого эффекта или может приводить к деградации амилоида (Рис.4d).

Предположение, что протеолиз SAA и АА фибриллярных белков воздействует на патологию амилоидоза требует дальнейших исследований для того, чтобы определить (1) участие протеаз, (2) происхождение протеаз, (3) клеточные и внеклеточные компартменты, участвующие в протеолизе и (4) природу процесса, т.е. физиологическую или патологическую. Несмотря на отсутствие наших знаний в этой области, некоторые факты указывают на то, что различные протеазы, и, вероятно, различные компартменты вовлечены в образование и деградацию SAA и АА фибриллярных белков. Это: (1)существование различных субстратов («субстратная разнородность (разнообразие»)), т.е. белки-предшественники, мономерные фибриллярные белки, олигомерные фибриллярные белки и «зрелые» амилоидные фибриллы; (2) наличие различных протеаз («протеазная разнородность»), которые расщепляют либо SAA, либо фибриллярные белки.

Вклад протеаз и протеолиза в патогенез АА амилоидоза был изучен с использованием тканей и клеточных линий человека и животных моделей, таких как кролики и мыши. Большинство исследований продемонстрировало присутствие и активность протеаз (качественно) при исследовании тканевых гомогенатов, сыворотки, очищенных протеаз, полиморфонуклеоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов или макрофагов. Две работы были выполнены in vivo, но подавляющее большинство in vitro с использованием самых разнообразных субстратов: delipidate SAA, рекомбинантных SAA и HDL_SAA. Суммарно эти исследование показали раcщепление SAA следующими способами: сывороточными протеазами [68], протеазами, выделяемыми в культуральный супернатант полиморфонуклеоцитами и макрофагами [9, 65, 69], связанными с мембранами протеазами лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов [38, 39, 64] и тканевых гомогенатов селезенки [88], печени [88] и почек [88]. Семейство протеаз, способных или ответственных за деградацию SAA включает металлопротеиназы, сериновые протеазы и аспартатпротеазы. Было обнаружено, что ингибиторы протеаз особенно полезны для определения (характеристики) энзимов; протеолиз подавляется ингибиторами сериновых протеаз ( диизопропилфлюорофосфат) [38], α1-антитрипсином [39, 65], ингибиторами аспартат протеаз (пепстатин) [65], ингибитором эластазы (Ас-Аla-Ala-Pro-Val-CH2-Cl пептид ) [39, 65] и ингибитором трипсина (soybean трипсиновый ингибитор) [65]. Специфическими протеазами, расщепляющими SAA являются катепсин G [72], нейтральная серин эстераза [65], катепсин D [86, 88], эластаза [39, 65,72, 87], катепсин В [87], коллагеназа [72, 47] и стромелизин (stromelysin) [47] (cм. ниже). Некоторые исследования показали, что SAA деградирует поэтапно и посредством действия разных протеаз. Он может быть деградирован полностью без (обнаружения) фрагментов [13, 38, 64] или не полностью с образованием фрагментов, напоминающих АА фибриллярные белки по своим размерам, антигенным свойствам и/или аминокислотной последовательности [38, 39, 69, 86,87, 88] в зависимости от метода, применяемого для анализа протеолиза. Полную деградацию SAA без фрагментов наблюдали после деградации макрофагами (m?) [13, 38] и нейтрофилами [64] и это связывали с активностью сериновых протеаз [38, 64]. Неполную деградацию m?-ми также связывали с сериновыми протеазами и эластазой [38, 39, 69]. Сайт деградации пока неизвестен; в двух работах были исключены внутриклеточный или лизосомальный протеолиз SAA [38, 64], но общее число подробных качественных и количественных работ, направленных на определение сайтов разделения ограничено.

Сериновые протеазы

Активность сериновой протеазной эластазы [39, 65, 72, 87] и катепсина G [72] были обнаружены в амилоидных тканях и это предполагает их участие в патогенезе АА амилоидоза. Эластаза расщепляет SAA в пределах N-терминальной половины белка-предшественника - между Ala27 и Asn28, Ile58 и Ser59 и Ile 65 и Gln 66, предотвращая образование фибриллярных белков; следовательно, эластаза может служить протектором. Активность катепсина G пока еще не объяснена.

Аспартатовые протеазы

Катепсин D, лизосомальная аспартатовая протеаза при кислых рН разрушает SAA полностью при концентрации 0.2 U/ml и не полностью при концентрации 0.02 U/ml [86]/ Расщепление происходит между Phe6 и Leu7, Glu9 и Ala10, Asp12 и Gly13, Arg15 и Asp16, Ala20 и Tyr21. Катепсин D также расщепляет SAA внутри N-терминальной половины белка-предшественника, предотвращая образование фибриллярных белков [86]. Пепстатин, аспартат протеазный ингибитор, укорачивает lag период образования амилоида у мышиных моделей со вторичным амилоидозом [88]. Аспартат протеазы являются потенциальными протекторами образования амилоида. Деградация лизосомальной протеазой катепсином D требует интернализации SAA.

Цистеиновые протеазы

Катепсин В, лизосомальная цистеин протеаза, расщепляет SAA in vitro между позициями 76 и 77, чтобы образовать пептид идентичный АА фибриллярному белку (Arg1 to Ser76) [87]. Следовательно, катепсин В, эндо- и экзопептидаза, могут быть потенциально амилоидогенными. Катепсин К принадлежит к папаиновуму семейству цистеиновых протеаз и является наиболее потентной эластазой у млекопитающих, описанной к настоящему времени. Мы показали, что катепсин К экспрессируется и, вероятно, секретируется многоядерными гигантскими клетками (MGCs)/ соседствующими с амилоидными депозитами. Более того, рекомбинантный катепсин К полностью разрушает SAA и АА фибриллярные белки in vitro при рН 5.5, менее эффективную деградацию наблюдали при рН 7.4. Т.о. in vitro катепсин является протектором [62]; необходимы исследования in vivo для оценки значимости этих наблюдений. MGCs имеют специфический фенотип m? и они также, хотя и не так обычно, обнаруживаются в амилоидных депозитах с которыми они часто обнаруживают тесные пространственные связи [62]. Ранее исследования на животных подтвердили, что MGCs могут принимать участие в резорбции амилоидных депозитов [83]. В противоположность катепсину В протеолитическая активность катепсина К не ограничена клеточными компартментами.

Значимость других цистеиновых протеаз, т.е. катепсинов L и Х, в патогенезе АА амилоидоза пока не определена.

Матриксные металлопротеиназы

Эта группа протеаз разрушает базальные мембраны и соединительную ткань и играет существенную роль в гомеостазе внеклеточного матрикса. Дисбаланс в экспрессии и/или активности матриксных металлопротеиназ (MMPs) может иметь важные последствия для развития заболевании, таких как рак и болезнь Альцгеймера. У больных, страдающих ревматоидным артритом, значительно повышен сывороточный уровень MMP-1, -2,-3 и -9 по сравнению со здоровыми лицами, а уровень сывороточного ММР-3 коррелирует с уровнем С-реактивного белка и скоростью седиментации эритроцитов [23] и т.о. с системным воспалением [70]. Воспалительные цитокины, такие как Il-1, Il-6 и TNF-a являются потенциальными индукторами MMPs (MMP-1,-3,-9) и могут увеличивать их транскрипцию до 100 раз [53]. Образование и секреция MMP-2 и -3 могут быть стимулированы острофазовым белком SAA [46]. Таким образом, АА амилоидоз встречается при условиях, когда возникают значительное повышение сывороточного и тканевого уровней ММPs по сравнению со здоровыми лицами. При иммуногистохимических исследованиях мы обнаружили MMP-1, -2 и -3 в АА амилоидных депозитах, независимо от пораженного органа (печень, почки или селезенка) [51]. Эти находки подтверждают, что MMP могут участвовать в амилоидогенезе либо путем процессинга белка-предшественника SAA посредством разрушения амилоидных депозитов, либо путем ремоделирования интерстициального матрикса после образования амилоидных депозитов. Исследования in vitro показали, что MMP-1, -2 и -3 способны расщеплять SAA и АА фибриллярные белки (AFP) в пределах региональных (region spanning) остатков от 51 к 57. Следующие сайты расщепления были идентифицированы: от 57 к 58 для MMP-1, 7 к 8 и 51 к 52 для MMP-2, 7 к 8, 16 к 17, 23 к 24, 51 к 52, 55 к 56 и 57 к 58 для MMP-3 [71]. Эксперименты на культурах клеток показали, что ТНР-1 клетки (клеточная линия моноцитов/макрофагов человека) были способны к деградации AFP, но этот процесс замедлялся при добавлении обычного ингибитора металлопротеиназы (о-phenanthroline) к декстран сульфат-стимулированным клеткам. Таким образом, SAA и AFP являются чувствительными к протеолизу посредством MMPs [71]. MMPs являются эндопротеазами, которые расщепляют белки при физиологическом рН и могут функционировать в interstitium. Их значимость в амилоидогенезе была подтверждена в экспериментах in vivo, выполненных Hernandes-Pando с соавт. [16]. После туберкулезного инфицирования мышей амилоидоз встречался в легких, когда одновременно мышам вводили bitimastat (ингибитор металлопротеиназы). Однако этот эффект не обязательно связан с MMPs. Другие металлопротеиназы могут также участвовать в патогенезе АА амилоидоза.

Является ли АА амилоидоз трансмиссивным заболеванием?

Еще не было показано, что АА амилоидоз относится к трансмиссивным заболеваниям подобно другим конформационным болезням, таким как губчатая энцефалопатия (BSE).Известно, что развитие АА амилоидоза требует либо бэкграунда персистирующей/хронической воспалительной реакции, либо повышенного эндогенного синтеза белков-предшественников. Последнее также необходимо для развития BSE, при котором необходим эндогенный синтез прионового белка. Однако в случае АА амилоидоза на начало и течение заболевания могут повлиять внутривенные инъекции веществ, снижающих lag период образования амилоида. Это так называемый AEF, шелк, АА амилоидные фибриллы и транстиретиновые амилоидные фрагменты [33, 34, 44]. Биохимическая природа AEF еще не до конца изучена. Вероятно, он представляет АА амилоидные фибриллы и определяется их биологической активностью. Инъекции только одного AEF не вызывают образования амилоида у мышей, для этого требуются дополнительные воспалительные стимулы, такие как нитрат Ag или ежедневные инъекции казеина. Однако AEF и стимуляторы воспалительной реакции не должны быть введены в одно и то же время и интервал между инъекциями может составлять до 6 месяцев. Таким образом, хотя развитие болезни имеет некоторое сходство с BSЕ, к настоящему времени АА амилоидоз может быть рассмотрен только как потенциально трансмиссивное заболевание..

Обратимость амилоида

Отложение амилоида не является необратимым. Прогрессирование генерализованного амилоидоза может быть отсрочено или остановлено лечением основного заболевания. Депозиты также могут регрессировать [18, 83]. Идентификация факторов, которые участвуют в образовании и деградации АА амилоида и объяснения их способов взаимодействия может помочь лечению этого заболевания.

Заключение

В последнее десятилетие значительные успехи были сделаны в понимании патологии и патогенеза АА амилоидоза. Сейчас ясно, что патогенез заболевания мультифакториален и на него влияют многие переменные. Они включают первичную структуру белка-предшественника, острофазовый ответ, наличие нефибриллярных белков (т.е. АР, ароЕ, GAGs и протеогликаны), рецепторов, метаболизма липидов и протеазы. Процесс отложения амилоида у живых существ вероятно гораздо более сложен и тонок, чем мы представляем в настоящее время [29]. Пока мы еще не знаем, какие из этих переменных являются необходимыми предпосылками для амилоидогенеза, а какие являются обычными катализаторами. В конечном счете, изучение амилоидоза вносит большой вклад в понимание природы конформационных болезней и они могут помочь в понимании других болезней, принадлежащих к этой особой гетерогенной группе.

Pathology, diagnosis and pathogenesis of AA amyloidosis
Christoph Roсken and Ann Shakespeare
Virchows Arch V.440., P.111-122 (2002)
(Перевод И.Г. Лильп)

Конформационные болезни

ПАТОГЕНЕЗ АА АМИЛОИДОЗА

Pathology, diagnosis and pathogenesis of AA amyloidosisChristoph Roсken and Ann Shakespeare Virchows Arch V.440., P.111-122 (2002)(Перевод И.Г. Лильп)

Конформационные болезни

ПАТОГЕНЕЗ АА АМИЛОИДОЗА

Pathology, diagnosis and pathogenesis of AA amyloidosis
Christoph Roсken and Ann Shakespeare
Virchows Arch V.440., P.111-122 (2002)
(Перевод И.Г. Лильп)