Посещений: INBORN ERRORS OF THE DEVELOPMENT
Нарушения Проводящей Системы

Patrick Y. Jay , Brett S. Harris , Antje Buerger , Olga Rozhitskaya , Colin T. Maguire , Laura A. Barbosky , Ellen McCusty , Charles I. Berul , Terrence X. O'Brien , Robert G. Gourdie , Seigo Izumo

INBORN ERRORS OF THE DEVELOPMENT OF THE CONDUCTION SYSTEM AS A CAUSE OF POSTNATAL PHYSIOLOGIC DEFECTS
The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology Volume 280A, Issue 2 , Pages 966 - 972 Оригинал->Full html

AV | l-TGA
Детские кардиологи давно уже распознали, что некоторые пороки сердца ассоциированы с дефектами атриовентрикулярного проведения. Мы исследовали базу данных Department of Cardiology at Children's Hospital, Boston, в которой имеются записи диагнозов и процедур 59,832 пациентов, наблюдавшихся между 1 January 1988 и 1 January 2002. Из 360 пациентов с диагнозом полного сердечного блока и анатомических дефектов у 13 подтвержден врожденный блок сердца на основании электрокардиограмм, врачебной документации или обоих (Табл. 1). Ни один из 13 не имел на электрокардиограмме или в документации указаний на остаточную атриовентрикулярную проводимость. Большинство оставшихся имеби временный или remainder had transient or благоприобретенный сердечный блок. Немногие имели врожденный блок сердца, но доказательства не были найдены.
 
Table 1. Congenital heart defects associated with congenital heart block in cardiology patients seen at Children's Hospital, Boston, 1988-2001*
Diagnosis Number Total Additional diagnoses
l-TGA 7 382
Heterotaxy 3 351 (118) Interrupted IVC
Tetralogy of Fallot 1 1,123 Down syndrome
Ventricular septal defect 1 5,319 Maternal lupus Ab+
Atrial septal defect 1 3,466 Maternal lupus Ab+
  * The most commonly associated defects were l-TGA and heterotaxy, specifically left atrial isomerism. The number of patients with an interrupted inferior vena cava, a sign of left atrial isomerism, is noted in parentheses. Tetralogy of Fallot, especially as a feature of Down syndrome, is not usually associated with congenital heart block but has been reported (Machado et al.,1988). The two patients with a muscular ventricular septal defect and secundum atrial septal defect probably developed congenital heart block because of maternal lupus antibodies, i.e., anti-SSA/Ro and SSB/La, which do not cause congenital heart defects.

Поиски выявили два дефекта, l-transposition of the great arteries (l-TGA) и heterotaxy с левым предсердным isomerism, которые, как ранее было показано, ассоциируют с врожденным сердечным блоком (Pinsky et al.,1982; Machado et al., 1988). При l-TGA, правый и левый желудочки меняются своими позициями, чтобы соотв. качать кровь в systemic и pulmonary круг. При heterotaxy, теряются обычные признаки лево- и право-сторонней асимметрии предсердий, легких и абдоминальных органов. Heterotaxy пациенты имеют предсердие, структуры или органы на одной из сторон, которые напоминают таковые на противоположной стороне, хотя и называет ся правый и левый атриальный изомеризм. Прерывание сегмента нижней полой вены между печенью и почками, как это обнаружено у трёх пациентов, является характерным признаком левого атриального изомеризма. Гистопатологический анализ сердец при l-TGA (Lev et al., 1963; Anderson et al.,1974a, 1974b) или при левом атриальном изомеризме продемонстрировал прерывание атриовентрикулярной проводящей оси как причины врожденного полного сердечного блока (Ho et al., 1992).
Эти случаи подтверждают участие специфических, хотя и не известных, онтогенетических путей в патогенезе некоторых форм врожденного блока сердца. Отсутствие блока сердца при крупных сердечных дефектах, которые часто наблюдались в Children's Hospital указывают на специфичность этиологий. Напр., среди почти 3,000 пациентов, которые имеют сирндром гипоплазии левой части сердца (n = 402), коарктацию аорты (n = 1,271) или дефекты эндокардиальных подушек (n = 1,271), ни один не имел врожденного блока сердца. Т.о., дефекты проведения при l-TGA скорее всего связаны с аномальным пелеобразованием скорее, чем ассоциацию с дефектами, такими как гипоплазия желудочков, дефекты межжелудочковой перегородки или аномалии клапанов. Аозможно, что дефекты эндокардиальных подушек, такие как частичные или полные дефекты общего атриовентрикулярного канала, являются признаками heterotaxy. Патогенез дефектов проведения при левом атриальном изомеризме , следовательно, д.б. специфичным для развития билатеральной лево-стороннести, а не для аномального развития эндокардиальных подушек или атриовентрикулярного канала.
Хотя изучение базы данных было сфокусировано на пациентах, которые имели полный блок сердца, дети с l-TGA или левым атриальным изомеризмом обычно имеют менее тяжелые формы блокады сердца, которые м. прогрессировать. Если аномальное развитие проводящей системы м.б. причиной дефектов постнатального проведения, то это не обязательно фенотип типа sc`-или-ничего. Первоначальная тяжесть дефектов проведения варьирует и м. становиться хуже.

PHYSIOLOGIC CONDUCTION DEFECTS IN NKX2-5 HAPLOINSUFFICIENT HUMANS AND A MOUSE MODEL


ДНК-связывающие мутации Nkx2-5 вызывают дефекты проведения у людей (Табл.2). Мутации были впервые открыты в семьях с наследственными дефектами межпредсердной перегородки и атриоветрикулярной проводимости. Сердечный блок варьирует по тяжести от лёгкого удлиннения PR интервала (блок первой степени) до полного(блок третьей степени) и был прогрессирующим а одной семье (Schott et al., 1998). Benson et al. (1999) затем идентифицировали пациента, который имел продвинутый блок второй степенм, но не имел порока сердца. Исходя из электрофизиологичкских исследований в одной семье дефект проводимости был локализован в AV узле (Schott et al., 1998).
 
Table 2. Conduction defects and electrophysiologic abnormalities*
Human Mouse
3 weeks 7 weeks
AV block, degree
   First + - +
   Second + - -
   Third + - -
Prolonged QRS ? + +
AH block + + +
HV block - - -
Diminished His potential ? + +
  * Reported in humans (Schott et al., 1998) and mice (Jay et al., 2004) with heterozygous Nkx2-5 loss of function. The presence of AH and absence of HV block in human cases are inferred based on the description of electrophysiologic abnormalities reported in one family (Schott et al., 1998). +, reported as present; -, reported as absent; ?, not reported.

Две группы сообщили об эффектах потери функции у Nkx2-5 нокаутных мышей (Lyons et al., 1995; Tanaka et al., 1999). Открытие мутаций и людей было модиаировано исследованиями гетерозиготных Nkx2-5 нокаутных (Nkx2-5+/-) мышей. В первом сообщении описан легкой первой степени блок только у мутантных самок мышей (Biben et al., 2000). наша группа наблюдала блок у обоих полов в возрасте 7 недель и старше (Tanaka et al.,2002; Jay et al., 2004). Причина расхождений неясна, но это м.б. связано с временной разрешающей способностью измерений электрокардиограм. Ни одна из групп не наблюдала блока сердца втророй или третьей степени (Табл.2).
Как и у людей дефект в AV узле вызывается пролонгацией PR интервала у Nkx2-5+/- мышей, исходя из удлиннения AH интервала на внутрисердечной ЭКГ и нормальной продолжительрности P-волны на поверхностной ЭКГ. Быстрое атриальное pacing при высоких скоростях предоставляет дальнешие доказательства снижения функции AV узла у мутантов. Интересно, что блок первой степени и др. при знаки снижения функции AV узла отсутствовали у 3-недельных мутантных мышей, но присутствовали у 7-недельных (Jay et al.,2004). Задержанное развитие блока первой степени у мутантных мышей напоминает прогрессирование блока у людей с Nkx2-5 мутацией или врожденными пороками сердца, такими как l-TGA и heterotaxy.
После задержки в AV узле проведение сигнала идет по пучку Гиса.Исполбзуя octapolar электродный катетр,, который проводится через внутреннюю яремную вену в правое предсердие и желудочек, мы смогли измерять одновременно деполяризацию предсердия, пучка Гиса и желудочка. В слепых исследованиях His деполяризационный сигнал был заметно уменьшен или отсутствовал у субнабора мышей (Табл.2) (Jay et al., 2004). Уменьшение или отсутствие His сигнала в точности коррелировало с Nkx2-5+/- генотипом при изучении примерно 100 животных в возрасте от 3 недель до 1 года; все мыши дикого типа имели четкио обнаружимые His сигналы


Рис.1.  | Representative simultaneous surface electrocardiogram and intracardiac electrogram tracings from a wild-type (WT) and Nkx2-5+/- (HET) mouse. The onsets of the A-spike and P-wave are coincident, as are the V-spike and QRS. A, H, and V are atrial, His, and ventricular depolarization spikes. Note the small His spike in the Nkx2-5+/- tracing. 1, AH interval; 2, HV interval. Reproduced with permission from Jay et al. (2004 ).

Пучёк Гиса подразделяется на левую и правую ветвь, которые в свою очередь разветвляются в периферическую сеть волокон Пуркинье. Деполяризация желудочков начинается в соединениях Пуркинье с контрактильными миоцитами. Проведение через Гис-Пуркинье систему отражается в виде HV интервала на внутрисердечной ЭКГ. QRS интервал на поверхностной ЭКГ, который начинается с вентрикулярного пика на внутриклеточной ЭКГ, отмечает время, необходимое для деполяризации всего контрактильного миокарда после системы Пуркинье. Скорость проведения через Nkx2-5+/- ветви пучка и соединения Пуркинье-миоциты была нормальной, на это указывает нормальный HV интервал. QRS был слегка удлиннен у мутантных мышей всех изученных возрастов. Вместе данные по HV и QRS указывают на то, что задержка происходит в результате аномалий в или дистальнее соединений между волокнами Пуркинье и контрактильными миоцитами.

ANATOMIC DEFECTS OF THE CONDUCTION SYSTEM IN AN NKX2-5 HAPLOINSUFFICIENT MOUSE


Физиологические дефекты, обнаруживаемые на каждом уровне проводящей системы у Nkx2-5+/- мышей, коррелируют с клеточной гипоплазией соотв. структур. Количество проводящих клеток определяли качественно и количественно, используя два отдельных набора молекулярных маркёров of molecular markers, minK-lacZ and connexin40 and -45 (Cx40, Cx45) (Gourdie et al., 1993a, 1993b; Kupershmidt et al., 1999). Оба набора маркёров ясно демонстрируют уменьшение клеток в проводящей системе Nkx2-5 гетерозигот (Jay et al.,2004). Напр., один из авт. (B.S.H.) смог определить генотип неизвестного сердца основываясь на количестве Cx40-позитивных клеток, присутствующих на среде AV узла, пучка Гиса или системы Пуркинье. Анатомические аномалии AV узла скорее всего вносят вклад AV блок первой степени в связи с неизвестными факторами, связанными с созреванием, а гипоплазия пучка Гиса и системы Пуркинье м.б. полностью объяснена дефектами, ассоциированными с этими структурами.
AV узел образуется на внутреннем изгибе сердечной трубки во время петлеобразования (looping) (Viragh and Challice, 1977). MinK-lacZ-позитивные клетки маркируют область у эмбрионов дикого типа E9.5, но такие клетки отсутствуют в атриовентрикулярной области Nkx2-5 нулевых мутантных эмбрионов (Рис.2a и b), указывая тем самым, что Nkx2-5 существенен для образования AV узла (Jay et al., 2004). У взрослых Nkx2-5+/- AV узел меньше и содержит меньше клеток, чем у дикого типа (Рис.2c и d). Т.о., по-видимому, существует прямая корреляция между дозой гена Nkx2-5 от нуля до нормы и количеством клеток в узле. Кроме того Nkx2-5+/- AV узел полностью отсутствует в проксимальной части узла, которая экспрессируетCx45, но не Cx40 (Jay et al., 2004).


Рис.2.  |  MinK-lacZ expression in wild-type and homozygous or heterozygous Nkx2-5 knockout animals reveals hypoplasia of the central and peripheral conduction systems. At E9.5, the progenitors of the AV node are seen as blue cells at the inner curvature of the heart tube in WT embryos (a; arrow) but nowhere seen in the atrioventricular region of the null mutant (b; arrow). The somites stain normally, suggesting that Nkx2-5 is not required for transcription (arrowhead). The AV node (c and d), His bundle (e and f), and peripheral Purkinje network (g and h) are all hypocellular in the Nkx2-5+/- heart (d, f, and h) compared to the wild type (c, e, and g). Adapted from Jay et al. (2004).

Т.к. Nkx2-5+/- мыши не дают AV блока первой степени вплоть до 4-недельного возраста, при этом ни гипоплазия, ни отсутствие проксимальной части AV узла недостаточны, чтобы вызывать дефекты проводимости у молодых мышей, но м. вносить вклад в патогенез у мышей в возрасте. Мы подозреваем, что неизвестные факторы, связанные с созреванием м. вызывать у Nkx2-5+/- мышей развитие преувеличенного PR удлиннения, учитывая их аномальные AV узлы. Напр., мыши удваивают свой размер между 3 и 7 неделями, тогда как AV узел и пучёк Гиса имеют фиксированное количество клеток, они м. растягиваться и стончаться во время роста сердца. Ремоделирование щелевых соединений мужду рождением и молодым возрастом такж м.б. таким фактором (Litchenberg et al., 2000). Интересно, что условный нокаут Nkx2-5 с использованием Cre у трансгенных мышей, управляемого с помощью MLC2V промотора, подтвердило роль гипоплазии AV узла в патогенезе AV блока первой степени. MLC2V-Cre экспрессируется в субнаборе клеток в AV узла, которые преимущественно делетируются у Nkx2-5 и вызывают гиперплазию AV узла и блок первой степени у взрослых мышей (Pashmforoush et al., 2004).
Пучок Гиса у Nkx2-5+/- мышей слабый и тонки по сравнению с диким типом (Рис.2e и f). Гипоплазия пучка Гиса м.б. непосредственно объяснена низкой амплитудой His деполяризующиго сигнала в сердце Nkx2-5+/-. Низкая амплитуда сигнала у 3-недельных Nkx2-5+/- мышей согласуется с врожденной гипоплазией пучка Гиса (Jay et al., 2004).
Периферические волокна сети Пуркинье у Nkx2-5+/- мышей выглядят урезанными по сравнению с диким типом. Общая инспекция mink-lacZ-окрашенных сердец демонстрирует плотное голубое окрашивание сети пуркинье в межжелудочковой перегородке у мышей дикого типа (Рис.2g), тогда как только индивидуальные волокна м. различаться у гетерозигот из-за меньшего количества клеток и волокон (Рис.2h). Качественное и количественное подтверждение было получено при изучении замороженных срезов, на которых клетки Пуркинье идентифицировалиь по экспрессии Cx40. Волокна реже и мельче, присутствует лишь половина клеток Пуркинье в сердце Nkx2-5+/- по сравнению с диким типом (Jay et al., 2004). Это в точности коррелирует с уменьшением mink-lacZ ферментативной активности у Nkx2-5+/- эмбрионов E14.5, указывая тем самым, что гипоплазия сети Пуркинье возникает в результате аномального эмбрионального развития скорее, чем постнатальной потери. Подтверждения получены также на сердцах, экспрессирующих GFP, управляемый промотором Cx40. Рисунки поверхности левой стороны межжелудочковой перегородки демонстрируют флюоресцентные радиации левой веточки пучка, чётко показывают, что Nkx2-5+/- серда имеют меньше волокон Пуркинье по сравнеию с диким типом (D. Gros, Conduction System Meeting, April 2004, Washington, DC).
Уменьшение клеток в сети Пуркинье у Nkx2-5+/- мышей м. объяснить пролонгацию продолжительности QRS. Т.к. проведение через контрактильный миокард более медленное, чем через сеть Пуркинье, то деполяризация всего вентрикулярного миокарда д. б. тем длиннее, чем меньше соединений Пуркинье-миокард присутствует. Сравнение с MLC2V-Cre условным нокаутом Nkx2-5 указывает на то, что количество периферических волокон Пуркинье м. редуцироваться ещё больше в отсутствие Nkx2-5. Отслеживание ритма у взрослых мышей после условного нокаута, чтобы продемонстрировать Mobitz type II, AV block второй степени (Pashmforoush et al.,2004), который локализует дефекты проводимости в или дистальнее пучка Гиса (Damato et al.,1969; Rosen et al.,1971,1972). Было бы интересно узнать, м. ли скудность клеток Пуркинье объяснить прогрессирующий фенотип AV блока в экспериментах по нокауту, ограниченного желудочками, т.к. сердце перерастает способность пучка ГИса или проксимальных ветвей пучка деполяризовать весь миокард.
Гаплонедостаточность по Nkx2-5, по-видимому, нарушает взаимоотношения среди крупных и малых видов между продолжительностью QRS и расстоянием от соединений Пуркинье-миоциты до самых удалённых контрактильных миоцитов в соотв. области возбыждения. Люди, чьи сердца примерно в 10 раз толще, чем у мышей, имеют преимущественно субэндокардиальное распределение клеток Пуркинье. В соотвествии с этой относительной толщиной желудочков у человека примерно в 10 раз QRS длиннее, чем у мышей. Сходным образом, сердце коров в 4 раза толще, чем у людей, но сеть Пуркинье у них распределяется почти в под эпикардом. Поэтому и кошки, имеют ту же самую продолжительность QRS, что и люди (Oosthoek et al., 1993).

ROLE OF NKX2-5 IN CONNEXIN40 EXPRESSION


Гаплонедостаточность Nkx2-5 чётко вызывает физиологические и анатомические дефекты у мышей, это м. объяснить патогенез Nkx2-5 фенотипа и у людей. Анали з гетерозиготных Nkx2-5 нокаутных мышей ставид дополнительный вопрос относительно регуляции Cx40 с помощью Nkx2-5. Подавление активности Cx40 у мутантов Nkx2-5 рассматривается как потенциальная причина дефектов проведения. Во-первых, промотор Cx40 содержит Nkx2-5 связывающие сайты, а трансактивация in vitro показала, что Nkx2-5 м. активировать экспрессию конструкции Cx40 промотор-репортёрный ген (Bruneau et al.,2001). Во-вторых, гомозиготные Cx40 нокаутные мыши имеют атриовентрикулярный блок первой степени и удлиннёные интервалы AH и HV (Tamaddon et al., 2000; VanderBrink et al., 2000).
Количественная конфокальная иммунохимия выявляет те же самые уровни клеточной экспрессии Cx40 в дикого типа и Nkx2-5+/- клетках Пуркинье (Jay et al., 2004). Не выявлено и качественных отличий ни в AV узле, ни в пучке Гиса в отношении экспрессии Cx40 и 45. Т.о, имеющееся небольшое количество клеток в Nkx2-5+/- проводящей системе, но каждая клетка имеет нормальные количества коннексинов. Половинные уровни Nkx2-5 не достаточны, чтобы повлиять на экспрессию Cx40. Незначительные количественные снижения Cx40 м. и не улавливаться, но они не м. вызывать дефектов проводимости, т.к. гетерозиготные Cx40 нокаутные мыши, которые имеют имеют полвинные уровни белка, имеют нормальную проводимость (Kirchhoff et al., 1998).
Какова же роль Nkx2-5 в регуляции экспрессии Cx40 вне нормальных патофизиологических пределов активности транскрипционных факторов. Kasahara et al. (2001) описали фенотип мышей, которые избыточно экспрессируют мутантный Nkx2-5, I183P, который не м. связывать ДНК. У мышей развивался преогрессирующий AV блок и обнаруживалось сопутствующе подавление активности Cx40 и -43. Аномальная экспрессия коннексинов скорее всего вносит вклад в дефекты проведения, но нельзя пока установить, оказывает она прямое или косвенное влияние на мутантный трансген. У MLC2V-Cre нокаутных Nkx2-5 мышей меньше Cx40 бляшек щелевых соединений в AV узле и в пучке ГИса у вхрослых, но неясно, редуцирован ли уровень Cx40 или Nkx2-5 в индивидуальных клетках (Pashmforoush et al., 2004). Эти результаты подчёркивают трудности интерпретации данных по экспрессии у мутантных животных, даже если in vitro подтверждено, что определенный ген является непосредственной транскрипционной мишенью.

DEFINING THE ROLE OF NKX2-5 IN DEVELOPMENT OF THE CONDUCTION SYSTEM


Дефекты анатомические и проводимости ассоциированные с мутациями Nkx2-5 хорошо описаны, но точные механизмы Nkx2-5 в патогенезе любого частного дефекта остаются смутными. Открытие, что количество клеток в проводящей системе связано с с дозой гена Nkx2-5 является важным указанием. Исходя из современного понимания развития проводящей системы, телоретически возможны 4 общих механизма, посредством которых Nkx2-5 м. действовать. Т.к. отсутствует существенная прролиферация клеток, рекрутированных в проводящую систему, то уменьшение проводящих клеток у мутантных Nkx2-5 животных м. б. или результатом уменьшения рекрутирования или усиления потери.
Уменьшение рекрутирования у Nkx2-5 м. возникать в результате 3-х возможностей. Nkx2-5 м. регулировать спецификацию небольшой популяции клеток, которая формирует очаг для рекрутирования др миоцитов (Рис.3a). Нет доказательств существования такой популяции, но м. предположить, что такие пре-специфицированные клетки м. существовать, чтобы сформировать AV узел, исходя из паттерна экспрессии cGATA6-lacZ трансгена в прекардиальной мезодерме и миокарде атриовентрикулярного канала (Davis et al., 2001). Или Nkx2-5 м. регулировать экспрессию предполагаемого индуктивного сигнала (Рис.3b), который инструктирует плюрипотентные миоциты, соединяться в развивающийся узел или волокна, или отвечать на сигнал (Рис.3c). Доза гена Nkx2-5 д.б. важной или для развивающейся проводящей системы или для плюрипотентныхы миоцитов.


Рис.3.  | Hypothetical models of Nkx2-5 action in the development of the conduction system. a: Nkx2-5 specifies the number of cells that serve as the nidus for formation of the conduction system. Nkx2-5 regulates (b) the expression of an inductive signal or (c) the response to the signal. d: Nkx2-5 enhances the survival of cells in the conduction system.

Будучи ректрутированными некоторые миоциты в или около развивающейся проводящей системы подвергаются апоптозу (Cheng et al., 2002). Nkx2-5 гаплондеостаточные сердца м. терять миоциты, как только они вступят в проводящую систему (Рис.3d). Апоптоз м. объяснить прогрессирование от средней тяжести к полному атриовентрикулярному блоку у пациентов с мутациями Nkx2-5 (Schott et al.,1998). Нет прямых доказательств, однако, которые бы демонстрировали бы больше апоптоза или потерю проводящих миоцитов у Nkx2-5 гетерозигот или у у мышей с ограниченным желудочками условными нокаутами Nkx2-5 (Pashmforoush et al., 2004). Подтверждение теориетической возможности нуждается в TUNEL окрашивании, напр., или в подсчёте количества клеток в проводящей системе эмбрионов и мышей разных стадий. Т.к. количества клеток в проводящей системе скорее всего фиксировано при рождении, то рост постнатального сердца д. вызывать то, что проявляется как потеря клеток или уменьшение AV узла, пучков и волокон.
Помимо онтогенетических процессов, нужно также знать, какие специфические гены регулирует Nkx2-5. Известны немногие гены, которые м.б. важны для развития проводящей системы и мы не знаем ни одного, которые бы служили мишенью для Nkx2-5. Известно, что Wnt11, который усиливает свою активность в развивающейся проводящей системе цыплят (Bond et al., 2003), не экспрессируется дифференциально в сердцах эмбрионов Nkx2-5+/- (data not shown). Msx2, который экспрессируется в развивающейся проводящей системе цыплят и в атриовентрикулярном миокарде мышей, аномально усиливат свою активность у Nkx2-5 нулевых мутантных эмбрионов (Chan-Thomas et al., 1993; Tanaka et al., 1999). Отсутствие Msx2, однако, не затрагивает проводимости сердца и не устраняет дефектов проводимости у Nkx2-5+/- (Jay et al., in press).

Сайт создан в системе uCoz