Перевод В.К. Викуловой
Cationic lipid-mediated CFTR gene transfer
Опосредованный катионными липидами перенос гена CFTR в клетки легких и носа пациентов с кистозным фиброзом (муковисцидозом)

Cationic lipid-mediated CFTR gene transfer to the lungs and nose of patients with cystic fibrosis: a double-blind placebo-controlled trial

E W F W Alton, M Stern, R Farley, A Jaffe, S L Chadwick, J Phillips, J Davies, S N Smith, J Browning, M G Davies, M E Hodson, S R Durham, D Li, P K Jeffery, M Scallan, R Balfour, S J Eastman, S H Cheng, A E Smith, D Meeker, D M Geddes
Lancet 1999; 353: 947-54


В прежних наших работах и работах  других авторов уже сообщалось о  значительных изменениях в транспорте хлоридов после  переноса гена CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) с помощью катионно-липидных комплексов в эпителий носа пациентам с кистозным фиброзом. Мы исследовали безопасность этого переноса гена в клетки легких и носа пациентов с кистозным фиброзом , используя метод двойного-слепого плацебо-контролируемого тестирования
Восемь пациентов с кистозным фиброзом были произвольно выбраны для введения ДНК-липидного комплекса (активного) посредством распыления в легких, сопровождаемого спустя 1 неделю введением препарата в нос. Восемь контрольных пациентов следовали точно такому же протоколу, но использовался  липид без ДНК (плацебо). Результат оценивали с помощью анализа наличия вектор-специфической CFTR ДНК и мРНК ,   по разнице потенциалов (PD) in vivo, с помощью эпифлуоресцентного анализа истечения хлоридов и по бактериальному прилипанию( bacterial adherence).
У семи из восьми пациентов, получавших активный комплекс, были обнаружены слабые гриппо-подобные симптомы, которые разрешились в пределах 36 часов. У шести из восьми пациентов в каждой из групп наблюдались слабые симптомы отклонений в дыхательных путях на протяжении 12 часов после пульмонарного введения. Никакого специфического лечения не требовалось в обоих случаях. Пульмонарное введение комплекса, как было оценено in vivo по изменению PD и степени истечения хлоридов, привело к значительной (p<0,05) коррекции хлоридной аномалии у пациентов, получавших активное лечение, но не у тех, кто получал плацебо. Бактериальное прилипание было также уменьшено. Подобные изменения происходили и после назального введения.
Интерпретация: Перенос гена CFTR посредством катионно-липидных комплексов может в значительной степени влиять на хлоридный дефект в легких больных кистозным фиброзом,лежащий в основе патологии.

1. Welsh MJ. Abnormal regulation of ion channels in cystic fibrosis epithelia. FASEB J 1990; 4: 2718-25.

2. Knowles MR, Gatzy JT, Boucher RC. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. N Engl J Med 1981; 305: 1489-95.

3. Davis P. Pathophysiology of pulmonary disease in cystic fibrosis. Semin Respir Med 1985; 6: 261-70.

4. Elborn JS, Shale DJ, Britton JR. Cystic fibrosis: current survival and population estimates to the year 2000. Thorax 1991; 46: 881-85.

5. Zabner J, Couture LA, Gregory RJ, et al. Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect in nasal epithelia of patients with cystic fibrosis. Cell 1993; 75: 207-16.

6. Knowles MR, Hohneker KW, Zhou Z, et al. A controlled study of adenoviral-vector-mediated gene transfer in the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. N Engl J Med 1995; 333: 823-31.

7. Crystal RG, McElvaney NG, Rosenfeld MA, et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat Genet 1994; 8: 42-51.

8. Hay JG, McElvaney NG, Herena J, Crystal RG. Modification of nasal epithelial potential differences of individuals with cystic fibrosis consequent to local administration of a normal CFTR cDNA adenovirus gene transfer vector. Hum Gene Ther 1995; 11: 1487-96.

9. Zabner J, Ramsey BW, Meeker DP, et al. Repeat administration of an adenovirus vector encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. J Clin Invest 1996; 97: 1504-11.

10. Bellon G, Michel-Caemard L, Thouvenot D, et al. Aerosol administration of a recombinant adenovirus expressing CFTR to cystic fibrosis patients: a phase I clinical trial. Hum Gene Ther 1997; 8: 15- 25.

11. Caplen NJ, Alton EWFW, Middleton P, et al. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Nat Med 1995; 1: 39-46.

12. Gill DR, Southern KW, Mofford KA et al. A placebo-controlled study of liposome-mediated gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Gene Ther 1997; 4: 199-209.

13. Porteous DJ, Dorin JR, McLachlan G, et al. Evidence for safety and efficacy of DOTAP cationic liposome mediated CFTR gene transfer to nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Gene Ther 1997; 4: 210-18.

14. Zabner J, Cheng S, Meeker D, et al. Comparison of DNA-lipid complexes and DNA alone for gene transfer to cystic fibrosis airway epithelial in vivo. J Clin Invest 1997; 100: 1529-37.

15. Wagner JA, Reynolds T, Moran ML, et al. Efficient and persistent gene transfer of AAV-CFTR in maxillary sinus. Lancet 1998; 351: 1702- 03.

16. Lee ER, Marshall CS, Siegel C, et al. Detailed analysis of structures and formulations of cationic lipids for efficient gene transfer to the lung. Hum Gene Ther 1996; 7: 1701-17.

17. Chadwick SL, Kingston HD, Sterm M, et al. Safety of a single aerosol administration of escalating doses of the cationic lipid

GL-67/DOPE/DMPE-PEG5000 formulation to the lungs of normal volunteers. Gene Ther 1997; 4: 937-42.

18. Alton EWFW, Chadwick SL, Smith SN, et al. Lower airway potential difference measurements in non-CF and CF subjects. Paediatr Pulmonol 1996; 135 (suppl): 240 (abstr).

19. Stern M, Munkonge FM, Caplen NJ, et al. Quantitative fluorescence measurements of chloride secretion in native airway epithelium from CF and non-CF subjects. Gene Ther 1995; 2: 766-74.

20. Davies JD, Stern M, Dewar A, et al. CFTR gene transfer reduces the binding of Pseudomonas aeruginosa to cystic fibrosis respiratory epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 16: 657-63.

21. Schwartz MJ, Malone GM, Haworth A, et al. Cystic fibrosis mutation analysis: report from 22 UK regional genetics laboratories. Hum Mutat 1995; 6: 326-33.

22. Cousway SP, Pond MN, Bowler I, et al. The chest radiograph in cystic fibrosis: a new scoring system compared with Chrispin-Norman and Brasfield scores. Thorax 1994; 49: 860-62.

23. Andersen I, Camner P, Jensen PL, Philipson K, Proctor DF. A comparison of nasal and tracheobronchial clearance. Arch Environ Health 1974; 29: 290-93.

24. Middleton PG, Geddes DM, Alton EWFW. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. Eur Respir J 1994; 7: 2050-56.

25. Schwartz DA, Quinn TJ, Thorne PS, et al. CpG motifs in bacterial DNA cause inflammation in the lower respiratory tract. J Clin Invest 1997; 100: 68-73.

26. Johnson LG, Olsen JC, Sarkadi B, et al. Efficiency of gene transfer for restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis. Nat Genet 1992; 2: 21-25.

27. Johnson LG, Boyles SE, Wilson J, Boucher RC. Normalisation of raised sodium absorption and raised calcium-mediated chloride secretion by adeno-virus-mediated expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in primary human cystic fibrosis airway epithelial cells. J Clin Invest 1995; 95: 1377-82.

28. Dorin JR, Farley R, Webb S, et al. A demonstration using mouse models that successful gene therapy for cystic fibrosis requires only partial gene correction. Gene Ther 1996; 3: 797-801.

29. Johnson LG, Pickles RJ, Boyles SE, et al. In vitro assessment of variables affecting the efficiency and efficacy of adenovirus-mediated gene transfer to cystic fibrosis airway epithelia. Hum Gene Ther 1996; 7: 51-59.

30. Smith JJ, Travis SM, Greenberg EP, Welsh MJ. Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid. Cell 1996; 85: 229-36.

31. Pier GB, Grout M, Zaidi TS, et al. Role of mutant CFTR in hypersusceptibility of cystic fibrosis patients to lung infections. Science 1996; 271: 64-67.
Ген CFTR ( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ) кодирует белок, одна из функций которого - действовать в клетках эпителия поражаемых органов  таких, как легкие и пищеварительный тракт, в качестве цАМФ-управляемого хлоридного канальца .Существуют следующие характерные черты патологии кистозного фиброза. Во-первых, мутация этого гена приводит к ослаблению движению хлоридов, что в сочетании с увеличенным поглощением натрия  присутствует в эпителиальных клетках  дыхательных путей больных кистозным фиброзом . Во-вторых, наличие мутации данного гена ассоциируется с восприимчивостью к колонизации некоторыми микроорганизмами (в частности  Pseudomonas aeruginosa). В-третьих, повторяющиеся  инфекции и воспаление дыхательных путей приводят в настоящее время к тому, что  средняя продолжительность жизни больных кистозным фиброзом составляет  около 30 лет. Эти характеристики дают несколько зацепок , которые могут быть использованы для оценки введения нормальной копии гена CFTR в целях коррекции основного биохимического дефекта. Генотерапия для кистозного фиброза достигла стадии клинических работ. Эти работы в данный момент сфокусированы на введении гена CFTR c помощью аденовирусов, 5-10 катионных липосом, 11-14 или наиболее недавно, адено-ассоциированного вируса.
Существует  простой подход  для выявления характерных электрофизиологических дефектов слизистой носа. Все опубликованные до настоящего времени работы использовали этот подход при оценке эффективности переноса гена.5-14 Сообщалось о некоторой степени коррекции нарушения секреции хлоридов, но не  аномалии уровня ионов натрия и при вирусном, и при опосредованном катионно-липидными комплексами переносе гена. Однако, это не согласуется с результатами некоторых работ, в которых не удалось обнаружить  вышеупомянутых изменений. 6 Одна из интерпретаций этих результатов состоит в том, что степень переноса гена и последующая коррекция малы при измерении в сравнении с основным фоном и в известной степени трудны, и, следовательно, могут расходиться  в исследованиях in vivo  и ex-vivo. Проблем безопасности, с которыми сталкиваются при использовании назального эпителия как модельной системы, немного. Ясно, что одна из целей таких генотерапевтических работ - коррекция аномалий в легких у людей с кистозным фиброзом, которая могла бы продемонстрировать пользу применения подобного подхода в клинике . На сегодня , существуют два неконтролированных исследования, касающиеся опосредованного  адено-вирусом переноса гена в легкие. Крайстал с коллегами (Crystal and colleagues)7,8 продемонстрировали наличие у одного из четырех пациентов белка CFTR, а Биллон c коллегами (Bellon and colleagues)  10 определили  наличие мРНК CFTR  и белка CFTR у двух из шести пациентов после аэрозолизации. До настоящего времени еще не было предпринято работ по  переносу гена с помощью катионно-липидных комплексов как при кистозном фиброзе , так и при каком-либо  другом заболевании легких.
Несколько групп сообщили о значительных достижениях по вопросу об эффективности переноса гена  при использовании катионных липидов, и ряд работ заставляет предполагать о том, что второе поколение катионных липидов GL-67 может быть более эффективным для трансфекции in vivo  в эпителий легких.16 Поэтому мы произвели оценку безопасности введения этого липида  в возрастающих дозах с помощью распылителя в легких 15 нормальных добровольцев, 17   при этом мы не нашли никаких токсический эффектов. Кроме того, нам удалось разработать несколько методов для измерения хлоридных и натриевых аномалий in vivo в легких 18 и в образцах ex vivo. 19 Мы также разработали метод для измерения характерного увеличения прилипания P aeruginosa к эпителиальным клеткам при кистозном фиброзе.20
Теперь мы расширили наши работы по  переносу гена с помощью липосом при кистозном фиброзе методом двойного слепого  исследования, контролируемого  использованием плацебо  для оценки как опасности, так и эффективности введения  комплекса GL67-CFTR комплементарной ДНК (сDNA) в легкие пациентов с кистозным фиброзом с помощью распылителя. Через одну неделю  этим же пациентам комплекс был введен в клетки назального эпителия, что дало возможность сравнить эффекты введения в эпителиальные клетки легких и носа  одного пациента и ответить на вопрос, соответствуют ли изменения в назальном эпителии нарушениям в эпителии легких. Было произведено сравнение полученных данных с результатами использования липидов первого поколения.

Пациенты и методы

Пациенты
Мы выбрали 16 пациентов мужского пола с кистозным фиброзом, бесплодных, что было подтверждено при анализе семени. Генотипы этих пациентов были следующие: 12 - 3F508/3F508, oдин - 3F508/W1282X, и три -  3F508/другая (т.е. никакая мутация не обнаружена после скринирования на мутации, присутствующие у 92-94% пациентов UK  с кистозным фиброзом). 21 Все пациенты отвечали диагностическим критериям для кистозного фиброза, включая  потовый тест- аномально высокое  содержание  хлоридов в поте, и все пациенты имели объем форсированного выдоха в 1 сек. примерно 70% предполагаемого. Восемь пациентов , произвольно выбранных, были предназначены для активного лечения, а восемь получали только липид.  Некоторые из клинических и электрофизиологические характеристики в группах были  хорошо сцеплены. Работа была одобрена   the Royal Brompton Hospital Ethics Committee, the Gene Therapy Advisory Committee, и the Medicines Control Agency.
Протокол испытания
Пациентов оценивали с помощью фиброоптической  бронхоскопии под day-case анестезией ( без использования лигнокаина) до введения и в течение 2 дней после введения препарата или плацебо в легкие. Анестезия для выполнения протокола включала 2,0-2,5 мг/кг для индукции,  6-12мг/кг21 ч21 и векурониум 0,1 мг/кг для поддержания , и гликопиролат 500 мг и неостигмин 2,5 мг для отмены. Пациенты были интубированы и снабжались воздухом и кислородом, одновременно производился мониторинг  ЭКГ, неинвазивного измерения давления, количества выдыхаемого  СО2, и насыщения кислородом. Спустя одну неделю каждый пациент получал предназначавшийся активный компонент или плацебо, распыленный на назальном эпителии . Введение препарата производили скрыто и относительно пациента и относительно исследователей.
Ведение комплекса липид-ДНК или одного липида.
Доза для введения комплекса в легкие была основана на нашем предварительном изучении безопасности воздействия на 17 нормальных добровольцах так же , как и расчет поверхности областей слизистых в легких и носу.

42,2 мг pCF-1-CFTR (CFTR cDNA под контролем промотера цитомегаловируса и включающая гибридный интрон и полиаденилированную последовательность бычьего ростового гормона) в сочетании с  229 мг GL-67/DOPE/DMPE-PEG5000 (молярное отношение 1:2:0,05) в объеме 20 мл  были распылены восьмерым пациентам первой группы группы, которые таким образом, получили  активный комплекс. Введение производилось через  распылитель с активацией при вдыхании . Пациентов, зажавших нос, просили сделать 50 вдохов через эту систему, сопровождающихся 2 мин остановкой, во время которой объем, оставшегося воздуха в распылителе, был измерен. Эта процедура повторялась до тех пор пока в распылителе не оставалось 16мл. Пациенты группы, получавшей плацебо, подвергались точно такой же процедуре, но в липидной смеси вместо ДНК была вода.

Для носа использовали 4,5 мл комплекса (11,8 мг ДНК) или одного липида, распыляя таким же способом, за исключением того, что мундштук заменяли носовым адаптором. Пациентов просили вдохнуть 50 раз, после чего следовала 10 мин остановка. Такой период был выбран чтобы максимизировать контакт комплекса с назальным эпителием через вредное пространство слизи и ресничек.
Испытания
Были сделаны анализы крови, анализ мочи, изменений функционирования легких, тонкослойное компьюторное томографическое сканирование и радиография грудной клетки. Последняя была выполнена с помощью поисковой системы  Northern: 22 метящих рангов от 0 до 20(  наиболее высокие  цифры  соответствовали  более тщательному обнаружению радиологических изменений). Мертвое пространство слизи и ресничек в носу( клиренс) оценивали, используя метод сахаринового клиренса. 23 Получение мокроты было индуцировано распылителем 3,5% раствора соли в течение 10 мин. Мокрота (1г)была собрана, откручена, супернатант анализировали на наличие интерлейкина 8, интерлейкина 6, и фактора некроза опухоли а (Predicta, Genzyme Corporation, Cambridge, Cambridge, MA, USA).Сухой остаток был обработан  10% дитиотреитолом, цитоцентрифугирован и окрашен по гимза. Во время каждой бронхоскопии  бронхоскопистом , не осведомленным о том, какого пациента он осматривал, был дан субъективный подсчет (0-4 балов) степени брохиальных  воспалений.
Для гистологического анализа, мы брали образцы биопсии от carina от сегментальных дыхательных путей и от передней поверхности внутреннего прохода носа. Образцы сразу же фиксировали в 2% параформальдегиде и  заключали в парафин для окрашивания гематоксилином и эозином, и для иммуногистохимии со следующими антителами (все от Dako, UK): CD45 (M0701)  для тотального окрашивания лейкоцитов; CD45 Ro (M0742) для  для  окрашивания в первую очередь лимфоцитов; анти-нейтрофильная эластаза (M0752) для идентификации нейтрофилов ; триптаза антител против тучных клеток ( anti-mast cell tryptase )(M7052) для идентификации тучных  клеток;  CD68 (M0876)  для моноцитов или макрофагов; и анти-HLA-DR (M0775). Был использован алкалин фосфатазный анти-алкалинфосфатазный метод иммуноокрашивания с новым фуксином в качестве хромогена.
Мы использовали бронхиальные(by brushing) или назальные соскобы для оценки присутствия вектор-специфичекой ДНК и мРНК посредством встроенной обратной транскриптазы PCR. 14 Для оценки присутствия вектор-специфической ДНК, pCF1-CFTR ДНК было проведено полуколичественное определение с внешней стандартной кривой , и результаты были проявлены с помощью фосфор-имидж  денситометрии, как  высокой (а 106 копий), средней (104-105), так и  низкой (е103). Для определения присутствия мРНК , с первой нити ДНК путем обратной транскрипции была сделана РНК  с  вектор-специфическим праймером, сопровождающаяся  двумя кругами амплификации по 25 циклов каждый. Мы определили целостность РНК, оценивая каждый образец на присутствие эндогенной мРНК, используя встроенную обратную транскриптазу PCR.
PD (potential difference) нижних дыхательных путей измеряли через двухпросветную полиэтиленовую трубочку - катетер, протянутую через канал для биопсии в гибком бронхоскопе. Один просвет был использован для измерения трансэпителиальных PD по отношению ко второму электроду, соединенному с внутривенно введенной иглой.  Измеряющий электрод содержал стандартный раствор Рингера, подтянутый к самому кончику, но без постоянной перфузии. Оба электрода были сконструированы на основе каломельных электродов и подсоединены к портативному компьютеру  через  усилитель,   превращающий слабый сигнал от электродов в более сильный, и содержащий усредняющий фильтр с постоянным временным интервалом 0,5 сек. Основной PD был измерен в четырех местах (и посчитано среднее) в нижней трахеи (передняя, задняя, и две боковые поверхности) , на четырех местах в главном бронхе (как для трахеи), на одном  в каждой доли, в сегментальном и субсегментальном бронхах и так далее, пока внешний диаметр измеряющего электрода 2,8 мм мог поместиться внутри воздушного прохода. После измерения основных (без перфузии) величин, катетер был помещен в сегментальный бронх , показаниям  PD дали время стабилизироваться (плюс или минус 0,3 мВ) в течение 30 сек. Фармакологические растворы были перфузированы через второй просвет катетера со скоростью 0,8 мл/мин в таком порядке: низкохлоридный раствор Рингера ( с низким содержанием ионов хлора:6 ммол/л хлорида, замещенного эквимолярным глюконатом), амилорид (100ммол/л ), изопреналин (100ммол/л), и аденозинтрифосфат (100ммол/л). Каждый агент был перфузирован до появления стабильных величин(примерно 3 мин).Об ответе на комбинированное воздействие низкохлоридного раствора с изопреналином  уже сообщалось , он представлял сумму реакций на каждый агент. После завершения этих измерений, катетер был  перемещен  область  carina , и последовательность перфузии лекарствами повторили. Мы использовали эту последовательность перемещений катетера для гарантии отсутствия загрязнений фармакологическими агентами, встречающимися  в проксимальной области. Величины этих измерений соответственно были отнесены как к дистальной, так и к проксимальной облатям.
Назальные PD были измерены как было описано ранее вдоль нижней поверхности нижнего воздушного прохода. 24 Когда максимальный основной PD был зарегистрирован , лекарства были перфузированы в следующей последовательности: амилорид, низкохлоридный раствор, и изопреналин в тех же концентрациях, что и в нижних дыхательных путях. Лекарственная перфузия всегда предпринимается в области максимального PD, если по предварительным  измерением не зарагистрировано, что в этом месте получено существенное нарушение в лекарственном ответе. В таких случаях, место локализуют по отношению к входу катетера в нос , и возвращаются к последующим измерениям.
Чтобы измерить истечение хлоридов в нижних дыхательных путях, мы применили взятие соскобов  ( 3 мм ) при стандартной бронхоскопии для получения образцов и из сегментальной, и из  carinal ( мечевидный отросток грудины)областей , из подповерхностных и из нижних  воздушных проходов . Образцы сразу помещали в среду Игл, модифицированную Дульбекко, содержащую пеницилин  и стрептомицин, транспортировали в лабораторию и содержали в течение ночи при 37o С в 5% СО2.Клетки погружали в 6-метокси-N-(-сульфопропил)квинолиун(SPQ) , в условиях гипотонического шока, как описывалось ранее. 19 Для анализа были взяты только ресничные эпителиальные клетки (15-20 клеток на образец)  с активным биением. Для оценки цАМФ-опосредованного истечения.мы использовали изменения в SPQ флуоресценции в ответ на воздействие форсколина (10ммол/л) и 3-изобутил-1-метилксантин (100ммол/л)  . Скорость истечения подсчитывали , используя константу Stern-Volmer, и она составляет 20,8 мол21 (расчитанная ранее для клеток , полученных при анализе подобных соскобов). Кроме того, для оценки кальций-зависимого истечения хлоридов  мы использовали аликвоты полученных образцов при тестировании ответа на иономицин (100ммол/л) .
Статистический анализ
Мы производили межгруповое сравнение средних  , используя U тест Манна-Уитни, и внутригрупповое, используя критерий Вилкоксона . Гипотезу 0 отвергали при р<0,05. Данные представлены для удобства как средние (SE).

Результаты

Безопасность
Семь пациентов из первой  группы  проявили симптомы  миалгии, головной боли и высокой температуры( 38,3oС [SE 0,3]), начавшиеся примерно через 6 ч после процедуры распыления. Возвращение нормального самочувствия происходило в пределах 30 ч. Против этой реакции применяли парацетамол, она исчезла спонтанно и не повторялась после назального введения. У   двух пациентов с лихорадкой не было обнаружено никаких аномалий ни по  результатам анализов крови, ни по результатам вирусного скринирования и радиографии грудной клетки. У трех пациентов из второй группы, получавших плацебо, была зарегистрирована повышенная температура (37,6oС  0,2 p<0,05 в сравнении с первой группой) примерно через 6 ч, и продолжавшаяся примерно 12 ч. У одного пациента из этой группы развились гриппо-подобные симптомы, которые скачкообразно проявлялись на протяжении исследования.У шести из восьми пациентов в обеих группах (получавших активный препарат и плацебо) были обнаружены слабые симптомы воспаления( кашель, охриплость,  жесткое дыхание), продолжавшиеся не более 48 ч, и которые не возвратились при назальном введении. Шестерым пациентам (двум из группы , получавших активный препарат, четырем из группы , получавших плацебо), пять из которых уже принимали бронхорасширающие  средства,  были примененены ингаляции сальбутамолом   . Зарегистрировано значительное падение(р<0,05) объема форсированного вдоха в 1 сек( в первой группе пациентов, получавших активный препарат, 16,7%  0,6; в группе получавших плацебо 15,3%  0,6), форсированной жизненной емкости(в первой группе 16,6% 0,7; во второй группе   14,9%  0,4) , и кислородного насыщения( в первой группе 2,5% 0,5 ; во второй -  1,1%  0,4) на протяжении периода в 6 ч после введения вещества в легкие. Анализ газообмена обнаружил малое( 7,5% 0,4) но значимое (р<0,05 ) его уменьшение на 2 день в группе пациентов, получавших активное вещество, но не в группе получавших плацебо (2,6% 2,7), с последующим возвращением к величинам основного PD при измерении на 29 день.
По трем плазматическим маркерам воспаления показаны изменения (С-реактивный белок, интерлейкин-6 и общее количество белых клеток). Через 48 часов после введения в легкие активного вещества количество С-реактивного белка возрастало от 8,5 мг/л   до 42,5 мг/л    (SE 11,7;  нормальный уровень 0-10 мг/л) , чего не происходило у индивидов, получавших плацебо (р=0,001). Эта величина возвращалась к основному уровню через некоторое время( дней 6) и не увеличивалась после назального введения. Показано, что концентрации интерлейкина -6 также увеличивались после введения через 6 ч в легкие в обеих группах (после введения активного вещества   -  от 5,8пг/мл 1,9 до 25,0 пг/мл 5,7, р=0,08; после введения  плацебо  -   от 2,5пг/мл  0,5  до 15,4пг/мл  4,6,  р=0,01) , но не изменялись после назального введения  . И, наконец, после введения вещества в легкие наблюдалось небольшое увеличение количества белых клеток : в первой группе (до введения - 9,03109/мл  1,2; после - 12,13109/мл  1,5),и во второй группе (до введения -7,03109/мл  0,5; после -11,33109/мл 1,4), которое достигало уровня значимости(р<0,05). После назального введения значимое (p<0,05)  увеличение количества белых клеток в обеих группах по величине соответствовало  21 дню после легочного введения. Не обнаружено значимых изменений в уровнях интерлейкина 8 в  самых разных анализах крови, включая анализы с использованием почечных и печеночных маркеров( данные не показаны). Ни у одного из пациентов не обнаружено положительных  антиядерного, антиядрышкового, анти-двунитевой ДНК или антиревматоидного факторов. Кроме того, никто из пациентов не показал наличия анти-CFTR  IgG антител при измерении на 29 день. При применении тонкослойной сканирующей компьюторной томографии, произведенной на 2 день или стандартной радиографии  на 29 день , не было  обнаружено никаких значительных изменений в сравнении с основной картиной ( до введения).  Гистологический анализ назального эпителия у трех пациентов (одного, получавшего активный препарат  и двух, получавших плецебо) показал наличие нейтрофилов, хотя они были малочисленны и пятнистое окрашивание нейтрофильной эластазы свидетельствовало об отсутствии секреции и высвобождения эластазы. В образцах бронхиальной биопсии, мы нашли у троих пациентов из каждой группы несколько эластаз-положительных нейтрофилов после введения в сранении с одним пациентом  перед введением. И, наконец,  в отношении бронхита, субъективная оценка, произведенная бронхоскопистом, не показала значительных различий между наблюдениями  до и после (на 2 день) введения и в группе пациентов, получавших активное вещество, и в группе получавших плацебо.
В мокроте было показано значительное уменьшение (р<0,05) клеток воспаления у лиц группы, получавшей активное вещество (до введения - 11,23106/мл  3,2;после - 5,53106/мл 1,4), но не у лиц, получавших плацебо (до введения -7,23106/мл  3.3; после - 5,63106/мл  2,6). Это уменьшение соотносится с сопутствующим уменьшением числа нейтрофилов, которые составляют примерно 85% от числа клеток до  введения. Анализ цитокинов в супернатанте мокроты показал значительное уменьшение (р<0,05) концентраций интерлейкина-8 у пациентов, получавших активное вещество (до введения - 214,7пг/мл  61,9; после - 64,4пк/мл  11,1), но не у пациентов, получавших плацебо (до введения - 204,5пг/мл  101,6; после - 361,5пк/мл; 131,6). Мы не нашли значительных различий   в уровнях  ни интерлейкина-6, ни фактора некроза опухоли в обеих группах пациентов до и после воздействия.
Эффективность.
На 2 день после процедуры взятия соскобов или образцов биопсии из проксимальной (carina) и дистальной (сегментальной) области легкого мы обнаружили 106 или более копий вектор-специической ДНК на образец у всех восьми пациентов группы, получавшей активное вещество. В подобных образцах от пациентов, получавших плацебо, было105 или менее копий, перекрывание между результатами двух групп не было. В назальных образцах первой группы уровни вектор-специфической  ДНК также были более высокими в сравнении с уровнями второй группы. Однако, в назальных образцах, относящихся к первой группе, уровни плазмиды были ниже , чем в легких , создавая перекрывание со второй  группой. Уровни ДНК из назальных соскобов (на 2 день) в общем были выше, чем в образцах назальной биопсии (на 4 день) в группе пациентов, получавших активное вещество. В назальных соскобах не обнаружено ни в одном из образцов никаких вектор-специфических мРНК CFTR. В нижних дыхательных путях мы обнаружили эндогенную мРНК CFTR по крайней мере в двух образцах от каждого пациента ( соскоб или биопсия из проксимальных или дистальных дыхательных путей), и в 83% всех тестированных образцов. Для проверки жизнеспособности комплекса липид-ДНК, образцы были удалены из распылителя после распыления и трансфицированы в 293 клетки in vitro. Во всех случаях ( для первой группы n=4, для группы " плацебо" n=3), вектор-специфическая мРНК была выделена из клеток, получивших активный комплекс, но не из клеток, получавших один липид.
Разность потенциалов (PD) in-vivo
Легочные измерения основного уровня PD и ответ на действие амилорида взяты в качестве показателя потока натрия. 2 Мы не нашли значительных изменений основного уровня PD на любой из исследуемых поверхностей прохода в обеих группах. Подобным же образом не встретилось значительных изменений в ответе на действие амилорида (в группе, получавших активное вещество, до воздействия -256,8% SE 4,5, после воздействия - 269,4%  5,9; в группе, получавших плацебо,  до воздействия - 247,6%  2,7, после воздействия - 264,1%  6,6).  Для оценки способности к секреции хлоридов эпителия дыхательных путей мы использовали перфузию раствором с низким содержанием хлоридов, изопреналином и аденозин трифосфатом. Комбинация результатов перфузии раствором с низкой концентрацией хлоридов и изопреналином позволяет оптимальным образом отдифференцировать пациентов с кистозным фиброзом от не имеющих такового. У шести из восьми пациентов, получавших активное вещество, произошло  изменение в направлении нормальных показателей . В группе пациентов, получавших активное вещество, наблюдалось значимое (p<0,05) увеличение показателей при сравнении с показателями до воздействия, чего не было в группе пациентов, получавших плацебо. Кроме того, это изменение в первой группе значительно (p<0,05) отличалось от изменения во второй группе. В легких первой группы произошло 25%-ое восстановление  функции хлоридных канальцев по сравнению с нормальным контролем, анализировавшимся аналогичным образом в исследованиях перед опытом. Изменений в ответ на воздействие аденозин трифосфата не было обнаружено (данные не показаны).
При назальном воздействии мы не нашли значительных изменений ни в каком временном интервале ни в основном PD, ни в ответе на амилорид в любой из сравниваемых групп (данные не показаны).  При оценке на протяжении  продолжительного времени обнаружены значимые различия (p<0,05)между группой пациентов ,получавших активное вещество, и группой пациентов, получавших плацебо. Никаких изменений не установлено в ответ на воздействие изопреналина в обеих группах.
Исследование потока хлоридов еx-vivo
При легочном воздействии было значимое (p<0,05) увеличение потока хлоридов, опосредованного цАМФ в сравнении с величинами перед воздействием  в  группе пациентов, получавших активное вещество, но не в группе пациентов, получавших плацебо.У пяти из шести пациентов первой группы было показано увеличение показателей потока хлоридов  после воздействия в сравнении с двумя из семи пациентов второй группы. В первой группе скорость потока возросла до 0,40 мМ сек 21 (0,20) от величины перед воздействием 0,20 мМ сек 21 (0,04). У пациентов без кистозного фиброза средний ответ на  ту же стимуляцию был 0,91мМ сек 21 (0,36; n=6). Никаких значительных изменений не найдено в ответ на родственный кальцию агонист (иономицин) в клетках, взятых из тех же образцов и в первой, и во второй группах.
При назальном воздействии мы не нашли ни в одном из образцов никаких значимых  изменений ни в цАМФ, ни кальций-опосредованных ответах. Однако, в отношении первого, у пяти из семи пациентов , получавших активный препарат, показано увеличение потока в сравнении с одним из шести пациентов, получавших плацебо.
Бактериальное прилипание  Bacterial adherence
При легочном воздействии, в группе пациентов, получавших активное вещество, у пяти из шести показано уменьшение бактериального связывания в сравнении с соответствующими показателями перед введением - среднее уменьшение  3,1 бактерий/10 клеток (SE 2,5). И только у одного из шести пациентов, получавших плацебо, показано подобное уменьшение - среднее возрастание 2,1 бактерий/10 клеток (0,7), р=0,13 , в сравнении с первой группой пациентов. Для сопоставления, связывание перед воздействием у этих 12 пациентов с кистозным фиброзом было равно 9,5 бактерий /10 клеток (1,9) и для 14 пациентов без кистозного фиброза было равно 3,1 бактерий/10 клеток (0,7). В четырех парах образцов (перед воздействием и после воздействия) из доступных проксимальных дыхательных путей, было установлено значимое различие в бактериальном связывании между  пациентами, получавшими активное вещество и пациентами, получавшими плацебо(р<0,05).
При назальном воздействии у шести из восьми пациентов первой группы было обнаружено уменьшение бактериального связывания в сравнении с показателями перед воздействием - среднее уменьшение для всех восьми пациентов было 1,3 бактерий /10 клеток (0,9). Во второй группе у четырех из семи пациентов было показано уменьшение бактериального связывания со средним для всех семи пациентов  - 0,5 бактерий/10 клеток. (1,7). Для сопоставления, связывание до воздействия у всех 16 пациентов было 7,5 бактерий /10 клеток (1,0) и для 15 пациентов без кистозного фиброза 2,5 бактерий/10 клеток (0,5).
Мукоцилиарный клиренс
 В сравнении с исходными параметрами основных уровня после воздействия не было найдено  изменений ни в какой области назального эпителия.

Обсуждение

В настоящей работе продемонстрирована значительная коррекция основного электрофизиологического дефекта, характерного для кистозного фиброза, при  использовании катионно-липидного комплекса GL-67/DOPE/DMPE-PEG5000 в качестве транспортирующего агента для переноса нормальной копии гена. Введение комплекса в легкие сопровождалось двумя группами мягко выраженных  респираторных симптомов , разрешившихся спонтанно. Последующее назальное введение также привело к значительным изменениям транспорта хлоридов у пациентов, получавших активное вещество, но не у пациентов, получавших плацебо.
Принципиальная приоритетность этого исследования заключается в оценке безопасности введения катионных липидов в легкие больных кистозным фиброзом. Симптомы гриппо-подобной реакции преимуществено в группе пациентов, получавших активное вещество, в более мягком варианте встречались и среди пациентов, получавших плацебо. Эта реакция сопровождалась небольшим увеличением остро-фазного маркера  С-реактивного белка  в первой группе пациентов, но не коррелировала с  ни с количеством белых клеток, ни концентрациями интерлейкина-6. Мы рассмотрели три возможных объяснения этой реакции. Первое, засорение ДНК  полисахаридами, что мало вероятно. Во время получения ДНК были предприняты строгие меры для удаления полисахаридов и уровни (<5 единиц эндотоксина/мг ДНК)  были подсчитаны with the limulus amoebocyte lysate; более мягкие симптомы, наблюдавшиеся  у пациентов, получавших плацебо, наводят на мысль , что засорение не является причиной гриппо-подобной реакции. Второе объяснение, что реакция может быть ответом на перенос гена . Но быстрое начало ( в пределах 6 ч) и мягкая выраженность эффекта у пациентов, получавших плацебо, свидетельствует, что и это не является объяснением. Хотя мы не смогли определить анти-CFTR антител,  мы не исключаем цитотоксического ответа  T-лимфоцитов при экспрессии трансгена. Третье, мы постулировали, что комплекс липид-ДНК и, в меньшей степени, один липид могут проходить через макрофаги, инициируя ряд провоспалительных секреторных ответов. Активный комплекс несомненно имеет отличающуюся вязкость и отличающиеся химическое и биофизическое строение в сравнении с просто липидом и может усиливать этот ответ.  Кроме того, бактериальная ДНК, как показано, является провоспалительной, свойство, которое, вероятно, связано с расположением составляющих ее неметилированных оснований цитозина и гуанина .26  Для будущих работ по переносу гена в  легкие важно прояснить этот вопрос.

Мягко выраженные респираторные симптомы воспаления наблюдались в обеих исследованных группах. Эти симптомы коррелировали со значительным уменьшением функции легких (на 15%). Это уменьшение вряд ли связано с распылением гипотонического раствора, так как мы показали в последней работе, что такая процедура не вызывает значительного уменьшения функции легких у пациентов с кистозным фиброзом (неопубликованные наблюдения).  Мы выбрали этот ряд изменений чтобы показать, что  в ответ на местное введение липида возникает мягко выраженное воспаление слизистой дыхательных путей , что, возможно, не является неожиданным, принимая во внимание количество (около 20-8- мг липида),  вероятно достигающее  поверхности слизистой. Это количество липидов , введенное с помощью одного и  того же распылителя в одних и тех же условиях в легкие нормальных добровольцев, не вызывает таких ответов, приводя к предположению, что воспаленные дыхательные пути пациентов с кистозным фиброзом могут отвечать иным образом на введение липида.  Назальное приложение не дает представления о клинической картине, не говоря уже о небольшом увеличении количества белых клеток , наблюдаемых  после легочного приложения. Неясно, связаны ли различия в клинической картине с фактором  дозы или места приложения в легких. Тем не менее, оба этих наблюдения наводят на мысль, что в фазе 1 клинических испытаний, цель которых оценить степень безопасности, только легкие пациентов  с кистозным фиброзом могут давать адекватную информацию. Несмотря на наличие воспалительных симптомов, после воздействия  в мокроте пациентов, получавших активный препарат, но не плацебо,  количество интерлейкина 8 и количество нейтрофилов значительно уменьшаются. Это уменьшение совместимо с локальным уменьшением воспаления после переноса  CFTR в нижние дыхательные пути  и, совместимо с уменьшением бактериального прилипания, указывая на  то, что результат воздействия имеет потенциальное клиническое значение.

Мы отдаем себе отчет в том, что  подходы  генотерапии  не позволяют оценить функциональную  электрофизиологическую коррекцию CFTR в главном органе-мишени -  легких больных кистозным фиброзом. Мы показали нормализацию параметров хлоридного дефекта и в проксимальной , и в дистальной областях  легких. Однако мы не смогли показать какую либо коррекцию увеличенного поглощения натрия. Изменение в секреции хлоридов  представляет примерно 25%ое восстановление в направлении нормального уровня. В настоящее время, неясно , является ли для клинического эффекта необходимой  коррекция аномалий одновременно и ионов натрия, и ионов хлора ; только ли уровень хлора нуждается в коррекции, и в какой степени необходимо  восстановление секреции хлоридов для предотвращения или лечения заболевания легких. Некоторые указания  получены в двух работах. Одна из них относится к вопросу о введении варьирующего числа клеток ,  не несущих аномального гена кистозного фиброза, в  монослой клеток , имеющих данный ген , и оценке степени коррекции хлоридных и натриевых аномалий. Смесь примерно 5% клеток , не несущих данную наследственную патологию,   полностью корректирует хлоридную аномалию, 27 и лишь  около 100% клеток должны быть генетически здоровыми, т.е. не нести заболевания кистозного фиброза для возникновения коррекции дефекта натрия. Наши собственные данные показывают, что около 5% мРНК CFTR дикого типа внутри клетки могут корректировать хлоридную аномалию., и, что важно, пищеварительную патологию, обнаруживаемую у мышей с кистозным фиброзом.28 Эти данные дают представление о трудностях исследований in vivo на человеке.  Настоящая работа служит продолжением  экспериментов в данном направлении . Однако, если для клинического эффекта необходима коррекция аномалии натрия  , то генотерапия для кистозного фиброза  - путь более короткий к такой цели.   Так или иначе, по прежнему остается в фокусе внимания повышение эффективности переноса гена в респираторный эпителий in vivo. Необходимо отметить что, уровни экспрессии гена и изменения различий потенциалов PD,  регистрируемые на выходе в этой работе, могут не быть параллельным, и  нуждаются в соотнесении.
Мы включили назальный компонент исследований в настоящую работу по двум причинам. Во-первых, чтобы оценить, можно  ли по  изменениям  внутри назального эпителия судить об изменениях в низших дыхательных путях - для подтверждения как наших собственных работ, так и работ других авторов, использовавших нос в качестве показателя  для легких. Кроме того, мы хотели сравнить эффекты липид-ДНК комплексов второго поколения в отношении нашей прежней работы  на назальном эпителии. Ни при  назальном , ни при легочном  воздействии измерения in vivo не показали коррекции аномалии натрия, тогда как в обоих случаях показано значительное улучшение параметров, связанных  с секрецией хлоридов  . В носу это улучшение представляло по грубым подсчетам 20%, а в легких 25% восстановления ответа на комбинированное воздействие раствора с низким содержанием хлоридов и  изпреналином , которое при введении в обоих органах позволяет провести  оптимальное различие между пациентами с кистозным фиброзом и без него. Однако по контрасту с изменениями в легких, мы не достигли никакой коррекции  назального   ответа на введение изопреналина .   Такое отсутствие ответа было стойко в каждой из прежних трех назальных липидных работ. 11-13 Причина этого неясна, но интересно, что в  работе с клеточным смешением 26, описанной выше, введение низких концентраций (1%)  клеток ,  не несущих аномальный ген кистозного фиброза в монослой клеток , несущих этот аномальный ген, приводит к восстановлению  ответа на воздействие раствора с низкой концентрацией хлоридов (низко хлоридного), но не цАМФ-опосредованного ответа. При добавлении приблизительно 3% клеток" без кистозного фиброза ", оба ответа начинают обнаруживать коррекцию. Является ли перенос гена с коррекцией   ответа на низкую концентрацию хлоридов,  более чувствительным , если сопровождается цАМФ-опосредованным ответом, и затем коррекцией натриевого дефекта, неясно, но это может быть одним из возможных объяснений различия. Ответ на действие раствора  с низкой концентрацией хлоридов служит признаком уже открытых канальцев, и дальнейшее возможное объяснение для различий реакции между носом и легкими может относиться к дифференциальной регуляции открывания канальцев в этих двух органах. Благодаря этим различиям в эффективности, сравнительной простоте измерений в легких, и различиям в степени безопасности при назальном и легочном введении, становится ясным, что в то время, как назальный эпителий дает некоторую степень подобия с легкими, существуют и важные различия. Эти различия заставляют нас предполагать , что легкие могут представлять критическое место для исследования результатов переноса генов при кистозном фиброзе.  Мы получили в настоящей работе приблизительно среднюю величину коррекции   ответа на воздействие раствора с низкой концентрацией хлора в назальном эпителии   5 mV, определимую в течение 3 недель .Для сравнения, соответствующая цифра в нашем прежнем назальном исследовании была около 2,5mV, сигнал не обнаруживался в течение 7 дней после введения
Дальнейшая цель настоящей работы была оценить выполнимость нескольких систем анализа,  и в легочном, и в назальном эпителии при таких генотерапевтических испытаниях. Мы не смогли продемонстрировать присутствия вектор-специфической мРНК путем обратной трансткриптазы PCR, вопреки регистрации функциональных изменений. Подобное расхождение зарегистрировано  в некоторых, если не во всех прежних попытках генотерапии при кистозном фиброзе. Таким образом, расхождения с лабораторными исследованиями, наводят на мысль, что обратная транскриптаза PCR вероятно является менее надежным индикатором , чем биоэлектрические параметры. 29 Наша неспособность определения вектор-специфической CFTR  мРНК вероятно вызвана одним из двух факторов. Первый, в малом поднаборе образцов (17%), эндогенная CFTR мРНК не может быть определена, указывая на то, что либо неадекватное количество образцов было собрано, либо целостность  РНК подвергалась опасности во время получения (процессинга) образцов, и, таким образом, в этих образцах определение вектор-специфической CFTR мРНК оказалось невозможным. Второй, большинство образцов  с вектор-специфической мРНК содержит высокий уровень вектор-специфической ДНК, как доказано в контрольных реакциях  при отсутствии обратной транскриптазы  ,а именно, что продукт амплификации содержит несплайсированные цепочки большого размера. Высокий уровень векторной ДНК , как известно, уменьшает чувствительность определения вектор-специфической РНК. Обычно эта трудность преодолевается  с помощью обработки дезоксирибонуклеазой каждого образца. Однако, так как эта обработка может быть связана с потерей чувствительности обратной транскриптазы , обработка до конца не может быть выполнена , особенно при определении ожидаемых низких уровней экспрессии мРНК . Таким образом, эти пробы могут содержать векторную РНК, не определяющуюся из-за компромисной чувствительности исследований с применением обратной транскриптазы PCR ,являющихся причиной наличия векторной ДНК в образце. Существует, очевидно, необходимость оптимизировать этого рода тестирование для оценки клинических образцов больше, чем тестирование с использованием рутинных лабораторных экспериментов.
Day-case анестезия  - важная особенность работы, позволяющая производить измерения PD in vivo в нижних дыхательных путях и облегчающих очистку и биопсию образцов нижних дыхательных путей. Анестезия не приводит ни к каким клиническим трудностям, и все пациенты предпочитали эту часть исследования повторным измерениям назальных PD и назальной биопсии. Мы пришли к выводу, что измерение PD нижних дыхательных путей, включая ответы на лекарства, осуществимо, позволяя четко отличать индивидов с кистозным фиброзом от индивидов без него, и дает ценное средство для оценки эффектов переноса гена в ткань легких пациентов с кистозным фиброзом. Несмотря на то , что при исследовании ex-vivo  транспорта хлоридов и бактериального прилипания на эпителиальных клетках, полученных при соскобе , показаны изменения, совместимые с экспрессией CFTR, мы дожны отметить две важные трудности. Первая,  по ряду технических причин , относящихся и к процедуре во время брохоскопии, и последующему взятию вручную нескольких клеток, мы не всегда получали согласованные измерения( до и после переноса )  гена у каждого из пациентов. Вторая, присутствие слизи и  влияние подвижных ресничек приводят еще и другим техническим трудностям. Тем не менее, каждое из этих двух дополнительных исследований дает дальнейшие доказательства, по крайней мере для легких, о функциональных изменениях после переноса гена. В настоящее время связь между аномалиями ионного транспорта и бактериальной колонизацией неясна, так как могут иметь значение другие факторы такие, как солечувствительные antimicrobials, 30 бактериальное проглатывание,31 и мукоцилиарная очистка  . Тем не менее бактериальное прилипание представляет результирующую меру, потенциально более клинически уместную, и демонстрирующее сходную степень коррекции того, что происходит при биоэлектрических исследованиях.
В заключение можно сказать, что перенос гена CFTR с помощью катионно-липидных комплексов в легкие больных кистозным фиброзом может отчасти корректировать аномалию хлоридов, но не натрия, и может корректировать бактериальное прилипание к респираторным эпителиальным клеткам. Генотерапия в отношении кистозного фиброза продолжает устойчиво развиваться в направлении получения реального терапевтического выбора при заболевании.


Сайт создан в системе uCoz