Посещений:
Врожденные Пороки Сердца

Роль Фолиевой Кислоты

Developmental Consequences of Abnormal Folate Transport during Murine Heart Morphogenesis
L.S,Tang, B.J.Wlodarczyk, D.R.Santillano, R.C.Miranda, R.H.Finnell
Birth Defects Res. A. V.70, No 7, P.449-458, 2004
Фолиевая кислота, член витаминов В комплекса, играет существенную роль в эмбриональном развитии, включая и сердечнососудистую систему. Folic acid-binding protein one (Foplbp1), связанный с мембраной белок, один из первичных медиаторов транспорта фолиевой кислоты в клетки. Нулизиготные по Foplbp эмбрионы обнаруживают разнообразные онтогенетические аномалии, включая и тяжелые сердечнососудистые дефекты и погибают in utero на ст. Е10.5. Congenital heart defects (врожденные пороки сердца, ВПС) имеют мультифакториальную этиологию, средовые агенты взаимодействуют с генетическими факторами. Поставка материнской фолиевой кислоты предупреждает свыше 40% избранных кардиальных дефектов у людей (Show et al., 1995; Botto et al., 1996), демонстрируя тем самым, что является наиболее важным средовым модулятором риска ВПС у людей. Принимая во внимание, что фолиевая кислота оказывает такое влияние на развитие, удивительно, что точная роль добавления фолатов на развитие сердца остаётся неизвестной.
Сложный процесс развития сердца начинается с прекардиогенной мезодермы, которая происходит из клеток мезодермы передних частей латеральных пластинок (Perea-Gomez et al., 2001). Во время нормального эмбриогенеза отдельная популяция клеток, известная как клетки кардиального нейрального гребня происходит из нейральных складок перед слиянием в области развивающегося заднего мозга. Эти клетки мигрируют вдоль каудальных артерий бранхиальных дуг и достигают тракта оттока сердца и развивающихся артерий аортальных дуг (Kirby et al., 1993; Boot et al., 2003a). Эти клетки кардиального нейрального гребня вносят вклад в формирование truncus arteriosus, который последовательно подразделяется на аорту и пульмональную артерию. Эти клетки являются также инструментом в формировании conotruncal части межжелудочковой перегородки. Т.к. конотрункальный гребень участвует также в формировании межжелудочковой перегородки, то дефекты тракта оттока всегда сопровождаются дефектами межжелудочковой перегородки (Kirby and Waldo, 1995).
Биохимически фолиевая кислота действует как кофактор во многих важных клеточных реакциях, включая синтез нуклеотидов и реакции переноса methyl (Mudd et al., 1995; Rosenblatt, 1995). Нехватка фолиевой кислоты, как известно, снижает биосинтез тимидина в гепатоцитах, а также ингибирует скорость пролиферации проэритробластов, указывая тем самым, что фолиевая кислота м. непосредственно модулировать клеточный цикл (Jackson et al., 1997). Собственно развитие сердца нуждается в точных взаимодействиях нескольких биологических процессов, включая индукцию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку кардиомиоцитов (Markwald et al., 1977; DeRuiter et al., 1992; Ya et al., 1998). Использовав своих уникальных модельных мышей с нехваткой фолиевой кислоты во время беременности, вторичной по отношению к блоку транспорта фолиевой кислоты, мы предположили, что преждевременная гибель и/или ингибирование клеточной пролиферации кардиальных предшественников ведет к аномальному морфогенезу, наблюдаемому у Folbp1-дефицитных эмбрионов. Эти клетки, следовательно, не способны генерировать соотв. количества клеток и м. претерпевать раннее ограничение потенциала клеточных седеб, всегда нарушающее нормальное развитие и приводящее к наблюдаемым сердечнососудистым дефектам.
Были определены относительные уровни гибнущих и пролиферирующих клеток предшественников с помощью жидкостной цитометрии и Western blot анализа. Пространственные распределения этих клеток также были изучены с помощью TUNEL и некоторых иммуногистохимических маркёров, включая cleaved caspase-3 и proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Кроме того, была изучена роль Folbp1 в миграции презумптивных клеток кардиального нейрального гребня и их последующее вовлечение в развитие сердца. Был использован Рах-3 в качестве маркёра для отслеживания путей миграции презумптивных клеток кардиального нейрального гребня у нокаутных мышей. Раз-3 хотя и небезупречный маркёр, но экспрессируется на высоком уровне в этой популяции клеток. Рах-3 кодирует транскрипционный фактор, экспрессирующийся на высоком уровне в дорсальной части нервной трубки, из которой и мигрируют клетки кардиального нейрального гребня. На клеточном уровне Рах-3 играет роль в модулировании миграции, жизнеспособности, пролиферации и взаимодействий клеток нейрального гребня (Conway et al., 1997b; 2000; Li et al., 1999). Наконец, мы тестировали защитный эффект материнской фолиевой кислоты на развитие сердца. Мы осуществляли сравнительное исследование кинетики клеточной пролиферации у мутантов Folbp1 и мутантов мыши Splotch, которые также характеризуются ВПС. Для этого мы использовали нашу Рах-3 мутантную линию (CXL-Sp) (Gefrides et al., 2002).
Было установлено, что нарушения транспорта фолиевой кислоты вызывают экстенсивную обусловленную апоптозом гибель клеток, которая концентрируется в межжелудочковой перегородке и truncus arteriosus. Это вместе со снижением пролиферативной способности кардиомиоцитов, ограниченными размерами доступного пула клеток предшественников может вносить вклад в наблюдаемые дефекты сердца. Отмечается также существенное снижение экспрессии Рах-3 в области презумптивного мигрирующего кардиального нейрального гребня, указывая тем самым, что эта популяция клеток может подвергаться серьёзной массивной гибели. Полученные результаты впервые демонстрируют важную роль гена Folbp1 в обеспечении чувствительности к дефектам сердца.

DISCUSSION


Во время эмбриогенеза мышей апоптоз является существенным морфогенетическим процессом, необходимым и для развития сердца. Обнаружение апоптоза в дефектной кардиальной ткани у мутантов Folbp1 согласуется с предыдущими исследованиями, где усиленный апоптоз лежал в основе ВПС и эмбриональной летальности у нокаутных по рецептору PDGF-α (Sriano, 1997) и Fgf8 ( Frank et al., 2002). Мы продемонстрировали, что усиление активности активированного белка caspase-3 в сердцах Folbp1-/- связано с апоптическим путём и , следовательно, апоптоз кардиомиоцитов осуществляется caspase-3-зависимым способом. Это подтверждается сообщением (Knaapen et al., 2001), что кардиомиоциты подвергаются caspase-зависимой гибели клеток у эмбрионов мышей. Метод TUNEL и cleved caspase-3 исследование иммунореактивности показывают, что апоптические клетки концентрируются в дефектной межжелудочковой перегородке и truncus arteriosus сердца Folbp1-/- мышей. Принимая во внимание, что повышенные уровни апоптоза были анатомически ограничены трактом оттока и областями перегородки, в которых возникают дефекты, то это доказывает, что апоптоз вносит вклад в возникновение этих аномалий. Ранее было предположено, что активность теломеразы, а , следовательно, стабильность хромосом необходимы для предупреждения преждевременного старения клеток. В нашем исследовании мы наблюдали сходные степени активности теломеразы в кардиальной ткани нормальных и Folbp1-/- эмбрионов. Значит изменения потенциала роста и хромосомная нестабильность, говорящие о низкой активности теломеразы, не вносят своего вклада в индуцированные апоптозом ВПС у эмбрионов Folbp1-/-. Снижение пролиферативной способности высоко митотических кардиомиоцитов вместе с возникновением истончения стенки желудочков подтверждает нашу гипотезу, что ограничение доступа к пулу предшественников м. вносить свой вклад в ВПС.
В сердце позвоночных и клеточная пролиферация и выход из клеточного цикла образуют четкий пространственный и временной паттерн. Известно, что выход из митоза происходит тогда, когда регуляторные гены, которые ингибируют переход от G1 к S фазе, активно экспрессируются, вызывая переход кардиомиоцитов от предшественников к постмитотическим клеткам (Zhang, 1999). Мы полагаем, что с инактивацией гена Folbp1 наступает общая нехватка фолиевой кислоты и кардиомиоциты прекращают синтезировать достаточные количества ДНК, останавливаются клеточные деления и инициируется ранний выход из клеточного цикла. Это м. вести к преждевременной гибели клеток и снижению пролиферации и приводить впоследствие к наблюдаемым ВПС. Без добавления фолиевой кислоты Folbp1-/- эмбрионы не м. жить после ст. Е10.5. Это указывает на остановку роста, которая, по-видимому, обусловлена неадекватным эмбриональным кровообращением и недостаточностью сердца. Ранняя эмбриональная гибель Folbp1-/- указывает не только на то, что смерть м.б. обусловлена снижением пролиферации вентрикулярных миоцитов. При добавлении низких доз фолатов выживаемость эмбрионов Folbp1-/- увеличивается до ст. Е14.5, у таких плодов сохраняется truncus arteriosus и обнаруживаются дефекты межжелудочковой перегородки При нормальном кардиогенезе truncus arteriosus расщепляется на ст. Е12 и днём позднее аорта и пульмональный ствол оказываются полностью разделенными. На ст. Е14.0 вентрикулярная перегородка полностью закрывается (Harvey, 2002). Это указывает на то, что аномалии разделения truncus arteriosus и образования камер сердца у мутантов Folbp1-/- м. вносить вклад в гибель плода на поздних стадиях развития.
Pax-3 кодирует транскрипционный фактор, экспрессирующийся в дорсальной части нервной трубки, важной для пролиферации клеток предшественников нейрального гребня. Уменьшение интенсивности сигнала Рах-3 вдоль пути миграции клеток кардиальной нейрального гребня у эмбрионов Folbp1-/- согласуется с предыдущими сообщениями, что Рaх-3 мутантных Splotch (Sp2H) мыши отсутствует экспрессия Рах-3 в кардиальном нейральном гребне. Такие Sp2H эмбрионы обнаруживают конотрункальные дефекты в сердце, включая персисентцию truncus arteriosus (Conway et al., 1997b). Наш CXL-Sp гомозиготный фенотип согласуется с др. линиями Splotch. И наши Splotch гомозиготные эмбрионы и Folbp1 мутантные эмбрионы обнаруживают довольно сходные дефекты сердца, включая персистенцию truncus arteriosus, и обладают сходным паттерном экспрессии Рах-3 и распределения апоптических клеток. Это указывает на то, что Folbp1-/- плоды м. обладать общим с Splotch путём, ведущим к кардиальным дефектам, ассоциированным с нейральным гребнем. Это подтверждает наш аргумент, что нарушения презумптивных кардиальных клеток нейрального гребня у эмбрионов Folbp1-/- м. вносить вклад в обнаруживаемые кардиальные дефекты. Когда ген Folbp1 инактивирован, то последующая нехватка фолиевой кислоты негативно влияет на миграцию презумптивных клеток кардиального нейрального гребня и последующее образование сердца и магистральных сосудов.
Как показано в Табл. 2 относительная интенсивность сигнала Рах-3 в презумптивных клетках кардиального нейрального гребня эмбрионов Folbp1-/- усиливается с повышением дозы фолиевой кислоты, даваемой матерям (6.25-25.0 мг/кг), указывая тем самым, что этот угрожающий жизни дефект производных нейрального гребня м.б. устранён адекватными уровнями фолиевой кислоты во время критического периода развития сердца. Добавление 25 мг/кг фолиевой кислоты ведет к тому. что эмбрионы Folbp1-/- м. сохранять жизнеспособность вплоть до ст. Е14.5. Это указывает на то, что защитная активность фолиевой кислоты на миграцию презумптивных клеток нейрального гребня зависит от дозы.
Деплеция фолатов обусловливает повышенный уровень сывороточного гомоцистеина, который играет центральную роль в метаболизме methionine (Miller et al., 1994). Hyperhomocysteinemia ассоциирует с преждевременной болезнью коронарных сосудов у взрослых людей (Boushey et al., 1995). От средних до высоких концентрации гомоцистеина в крови, по-видимоу, играют критическую роль в патогенезе атеросклероза (McCully, 1996). Считается, что гомоцистеин сам м. индуцировать ВПС (Rosenquist et al., 1996) и что повышенные уровни гомоцистеина м. понижать количества клеток нейрального гребня (Tierney et al., 2004) и ингибировать дифференцировку клеток нейрального гребня (Boot et al., 2003b)? поэтому мы полагаем, что нарушения миграции кардиального нейрального гребня, индуцируемые недостатком фолиевой кислоты у эмбрионов Folbp1-/- м.б. обусловлены и посредством аномальной ферментативной активности в цикле homocystein/methionine. В самом деле, индукция аномальных, производных нейрального гребня гладких мышц к взаимодействию эндотелиальных клеток в артериях за счёт повышенных концентраций гомоцистеина (Boot et al., 2004) строго подтверждает выдающуюся роль клеток кардиального нейрального гребня в персистенции truncus arteriosus у эмбрионов Folbp1-/-. Усиление дифференцировки клеток нейрального гребня в гладкомышечные клетки после добавления фолиевой кислоты in vitro (Boot et al., 2003b) подкрепляет аргументы нашей работы. Более того, наше предыдущее исследование Wnt-1, маркёра дорсальной срединной линии в нервной трубке в месте, где возникают клетки нейрального гребня, мы нашли, что эмбрионы Folbp1-/- имеют тот же самый паттерн экспрессии Wnt-1, что и в контроле (Tang, Finnell, 2003). Это указывает не только на то. что клон клеток нейрального гребня не только специфицирован, но и что влияние на количество мигрирующих клеток нейрального гребня у эмбрионов Folbp1-/- не связано с тотальной потерей клонов клеток нейрального гребня. Т.к. миграция клеток нейрального гребня нуждается в непосредственных межклеточных коммуникациях (Maschhoff, Baldwin, 2000), то исследование молекул внеклеточного матрикса, таких как Сх43 и neurotrophin 3, сейчас идут полным ходом, чтобы определить не зависит ли нарушение миграции клеток нейрального гребня у Folbp1-/- от вспомогательных факторов, направляющих их по пути миграции.
Сайт создан в системе uCoz