DiGeorge/velocardiofacial syndrome (DGS/ VCFS), широко распространенный генетический делеционный синдром у людей, встречающийся с частотой 1 на 4000 живых новорожденных, является второй ведущей причиной врожденных пороков сердца у детей (Scambler, 2000). Большинство DGS/VCFS характеризуется микроделецией в длинном плече человеческой хромосомы 22 (22q11.2). DiGeorge синдром является, как полагают, результатом онтогенетических дефектов, связанных с третьей и четвертой фарингеальными дугами (Lammer and Opitz, 1986), т.к. затронуты органы онтогенетически происходят из этой области. Фарингеальные дуги являются временными выпячиваниями эмбриональной oropharyngeal области, дающей специфические наборы тканевых производных взрослых.

Транскрипционные факторы, экспрессирующиеся в фарингеальных дугах играют критическую роль в развитии фарингеальных дуг. Tbx1, один из генов, входящих в del22q11 локус у людей, по-видимому, является одним из самых ранних генов, участвующих в развитии фарингеальных дуг (Piotrowski et al., 2000). У людей, Tbx1 участвует в этиологии синдрома DiGeorge. У мышей, Tbx1 необходим для сегментации эмбриональной глотки, формирования каудальных фарингеальных дуг, артерий дуг, роста, расположения и образования перегородки тракта оттока (Vitelli et al., 2002).

Мутационный анализ показал, что Tbx1 мутации у пациентов с 'pharyngeal' фенотипом, являются идентичными с фенотипом, ассоциированным с del22q11 (Yagi et al., 2003). Гомозиготные нулевые мутации Tbx1 у мышей и рыбок данио обнаруживают общие с DGS признаки, характеризующиеся дефектами глоточных дуг и ассоциированных с ними структур (Vitelli et al., 2002; Merscheret al., 2001; Piotrowski et al., 2003). Как результат всех этих исследований сегодня Tbx1 является наиболее вероятным геном кандидатом для DGS/VCFS.

Однако, знание остается ограниченным из-за неясности вышестоящей регуляции Tbx1 во время развития фарингеальных дуг. Предыдущие исследования показали, что sonic hedgehog (Shh) может регулировать экспрессию Tbx1 (Garg et al., 2001; Wendling et al., 2000), но остаются и др. потенциальные кандидаты регулировки Tbx1. Формирование фарингеальных дуг критически зависит от retinoic acid (RA)(Mark et al., 2004). RA, активное производное витамина A, переносимое с помощью ядерных рецепторов, участвует в различных онтогенетических и гомеостатических процессах у позвоночных. Её тканевое распределение является результатом балансировки активностей RA синтезирующего энзима RALDH (retinaldehyde dehydrogenases) и cyp26 (RA-catabolizing cytochrome P450 hydroxylases) (Duester, 2000; Reijntjes et al., 2004). Известно, что плоды человека, подвергнутые воздействию ретиноидов во время беременности, могут иметь фенотип DGS (Rosa et al., 1986). Дефекты, вызываемые избытком или недостатком RA, у мышей воспроизводят типичные фенотипы, наблюдемеые при синдроме DGS/VCFS у людей (Mendelssohn et al., 1994; Ghyselinck et al., 1997; Mark et al., 1998; Niedereither et al., 2003). Сходным образом, RALDH2 нокаут и экспериментальные манипуляции с ретиноидными рецепторами у рыбок данио продуцируют фенотипы DGS (Begemann et al., 2001; Lohnes et al., 1994). Эти характерные дефекты все приписываются потере задних фарингеальных дуг, похожие с таковыми у пациентов с DGS (Mulder et al., 2000). Эти результаты строго подтверждают, что передача сигналов RA определенно не безразлична для развития фарингеальных дуг.

Меняется ли экспрессия Tbx1 вследствие воздействия RA во время развития фарингеальных дуг, нарушая развитие каудальных бранхиальных дуг, является открытым вопросом, хотя он не раз понимался в литературе. Рыбки данио, Danio rerio, обладают многочисленными преимуществаим для изучения развития сердца, включая наружное оплодотворение, быстрое развитие и оптическую прозрачность эмбрионов (Thisse and Zon 2003; Fishman, 2001). Изучали влияние RA на временно-пространственный паттерн экспрессии Tbx1 с помощью RTQ-PCR и гибридизации in situ в целом. Выявляемые регуляторные взаимодействия между RA и Tbx1 внесут вклад в наше понимание молекулярных путей, нарушаемых при DGS/VCFS, а также генетических основ врожденных пороков сердца, связанных с трактом оттока.

Сообщалось, что RA необходима для инициального образования фарингеальных дуг и играет важную роль в спецификации энтодермы. Ретиноид-зависимая передача сигналов регулируется ткане-специфическим способом (Grandel et al., 2002). Чувствительность генов и тканей к ретиноевой кислоте точно коррелирует со временем, когда синтезируется RA (Grandel et al., 2002). Предыдущие исследования показали, что критический временной период, в течение которого передача сигналов RA может вызывать трансформации энтодермальной судьбы. приходится на конец гаструляции у рыбок данио (Grandel et al., 2002).

Наши результаты также показывают, что эмбрионы, обработанные RA во время поздней гаструляции или ранней сегментации обнаруживают избирательные дефекты в виде аномальных желудочков и тракта оттока, онтогенетически происходящих из 3rd и 4th фарингеальных дуг. Эти результаты показывают, что RA играет важную роль в формировании фарингеальных дуг во время узкого онтогенетического окна, соответствующего поздней гаструляции и ранней сегментации, у эмбрионов рыбок данио. Дефекты, индуцируемые с помощью гипер- или гипо-RA, обнаруживают ограниченный набор признаков, характерных для фенотипа DGS у людей (Begemann et al., 2001; Walsh et al., 2001; Lohnes et al., 1994).

Передача сигналов RА контролирует экспрессию многочисленных транскрипционных факторов в фарингеальных дугах. Нарушение передачи сигналов retinoic acid может вызывать аномальную экспрессию генов в глоточной энтодерме и вторично нарушать миграцию клеток нервного гребня в фарингеальные дуги у мышей. Hoxa1 и Hoxb1 являются генами мишенями для RA и являются критическими для формирования нормального паттерна фарингеальной энтодермы (Marshall et al., 1994; Huang et al., 1998). Предыдущие исследования показали, что RA может регулировать экспрессию Hoxa1 и Hoxb1 во время спецификации фарингеальной энтодермы. Паттерны экспрессии Pax1, Pax9, Fgf8 и Fgf3 драматически меняются у panRAR (блокирование активности всех трех RARs) антагонистом обработанных эмбрионов мышей (Wendling et al., 2000). Tbx1, по-видимому, является одним из самых ранних генов, участвующих в этом процессе, т.к. нарушение его функции затрагивает сегментацию энтодермальных карманов (Piotrowski and Nьsslein-Volhard, 2000), что явялется одним из самых ранних событий в морфогенезе дуг. Tbx1 экспрессируется в фарингеальной энтодерме и действует автономно в энтодерме фарингеальных дуг (Vitelli et al., 2002). Полученные результаты показали, что уровни экспрессия Tbx1 достигают пика во время периода между 24 hpf и 48 hpf. Кроме того, гибридизация in situ целых эмбрионов показала, что Tbx1 экспрессируется в фарингеальных дугах, фарингеальных карманах, сердечно-сосудистой структуре и отических пузырьках во время очень ранних стадий развития. Паттерн экспрессии Tbx1 находится в тесном согласии с морфогенетическими перемещениями кардиального примордия и развития фарингеальных дуг у рыбок данио. Этот паттерн экспрессии подтверждает также, что tbx1 может играть критическую роль в сердечно-сосудистом развитии. Избыточная экспрессия и гаплонедостаточность Tbx1 также вызывают сходные DGS-подобные дефекты с теми, что вызываются воздействием RA и у мутантов Tbx1^-/-.

Предыдущие исследования показали, что фарингеальная энтодерма у RALDH2hypo мутантных мышей обнаруживает пониженную экспрессию Tbx1. Сходным образом нарушения уровней RA подавляют экспрессию Tbx1 у эмбрионов птиц (Roberts et al., 2005). Мы предприняли детальный анализ эффектов RA на паттерн экспрессиии Tbx1 во время развития фарингеальных дуг. Полученные результаты демонстрируют, что уровни экспрессии Tbx1 преимущественно подавляются во время периода между 36 hpf и 60 hpf при воздействии RA. Наши результаты также подтвердили, что экзогенная RA может менять паттерн пространственной экспрессии Tbx1 у рыбок данио. Следовательно, может предположить, что имеется генетическая взаимосвязь между передачей сигналов RA и Tbx1 во время развития дуг у рыбок данио. RA может регулировать экспрессию Tbx1 прямым или косвенным способом. При воздействии RA во время 12.5 hpf, репрессия экспрессии Tbx1 становится очевидной на ст. 36 hpf, это открывает возможность того, что RA не может вызывать изменения Tbx1 прямым и специфическим способом. Возможный косвенный механизм может быть связан с действием RA, изменяющим уровни др. транскрипционных факторов, которые вторично меняют экспрессию Tbx1. Эффект передачи сигналов retinoic acid опосредуется не только регуляцией транскрипционных факторов, но и также с помощью Shh, который экспрессируется в дискретных слоях фарингеальных дуг (Wendling et al., 2000). Др. результаты также подтверждают, что Shh может регулировать экспрессию Tbx1 во время развития фарингеальных дуг у рыбок данио. Fgf8 , как было установлено, взаимодействует с Tbx1 генетически (Funke et al., 2001; Vitelli et al., 2002). Поэтому мы полагаем, что RA может влиять на экспрессию Tbx1 посредством Shh.

Roberts также предполагает прямое RAR-обусловленное (retinoic acid receptor, RAR) влияние на контролирующие последовательности Tbx1 или прямое действие на др. транскрипционные регуляторы для Tbx1 (Roberts et al., 2005). Однако, многие вопросы остаются связанными с механизмом, с помощью которого Tbx1 контролирует развитие PA, и необходимы дальнейшие топические исследования. Установлено, что добавление 5x10-8mol/L RA четко супрессирует экспрессию Tbx1 в каудальных PA, но экспрессия в передних дугах не затрагивается. i10-7 mol/L RA могут репрессировать экспрессию Tbx1 как в каудальных дугах, так и передних. RTQ-PCR результаты показали, что 10-7 mol/L RA вызывают более тяжелые эффекты на экспрессию Tbx1, чем 5x10-8mol/L RA. Анализ эффектов разных концентраций RA на экспрессию Tbx1 показал, что RA регулирует Tbx1 дозово-зависимым образом; др. словами, более высокие дозы RA, вызывают более существенную репрессию Tbx1. Пространственные изменения Tbx1 в основном существуют в каудальных фарингеальных дугах, но не в передних дугах, указывая тем самым, что каудальные фарингеальные дуги более чувствительны к RA, чем передние. Следовательно, может предположить, что образование передних фарингеальных дуг может быть связано с RA рецепторами и RA , контролируемыми клеточными и молекулярными механизмами, отличными от тех, что используются в каудальных дугах.

Несмотря на частое возникновение 22q11.2 делеций при DGS у пациентов, DGS давно распознается как этиологически гетерогенный синдром, который может быть связан и с др. генетическими локусами, а также с эпигенетическими или средовыми причинами. Вариабельность фенотипа говорит в пользу влияния эпигенетических факторов на онтогенетические события (Vincent et al., 1999). Добавки более чем 10,000 IU VitA ежедневно во время беременности тесно связаны с повышенным риском TGA (transverse grand artery, TGA) (Botto et al.,2001). Наши данные подтверждают, что экзогенная RA может вызывать изменения паттерна экспрессии Tbx1; вторично нарушая развития фарингеальных дуг. Следовательно, биологически доступные уровни RA д. точно регулироваться, чтобы сигнал передавался через соответствующие ретиноидные рецепторы.