DOWN SYNDROME AND GENETICS — A CASE OF LINKED HISTORIES
David Patterson , Alberto C. S. Costa Nature Reviews Genetics6, 137-147 (2005); doi:10.1038/nrg1525
Down syndrome, the most common genetic cause of intellectual disabilities, was first described in 1866, during an era of great change in our understanding of genetics and evolution. Because of its importance, the history of research on Down syndrome parallels the history of human genetics. In many instances, research on Down syndrome has inspired progress in human genetics. In this article, we describe the interplay between advances in the understanding of genetics and the understanding of Down syndrome from its initial description to the present, and on the basis of this historical perspective, speculate briefly about the future of research on Down syndrome.
Рис.1. | Systems biology or the study of "complex webs of biochemical processes"
Табл.1Features in people with Down syndrome and Ts65Dn mice
Box 1 | Prenatal diagnosis and screening
It is beyond the scope of this article to attempt to review the ethical and legal issues surrounding the termination of pregnancies that involve the possibility of a foetus with Ts21. We can point out, however, that this debate continues to this day. A sobering reminder of this fact is that recent evidence indicates that an increasing number of prospective parents are deciding not to avail themselves of prenatal diagnosis, even when at risk for birth of a child with Down syndrome132 (because of a positive screening test or advanced maternal age). This trend is likely to accelerate as progress in research and medical care continues to improve the outcome for people with Down syndrome.
Prenatal diagnosis by amniocentesis has been offered since the early 1970s. By the mid 1980s, prenatal diagnosis using chorionic villus sampling also has become an option133. In fact, most prenatal diagnosis is offered when there is the possibility of the birth of a child with Down syndrome. Generally, because these procedures are not without risk, they are only routinely offered to pregnant women that are older than thirty-five.
Because of the frequency of Down syndrome and the risk from invasive testing, researchers have attempted to devise non-invasive screening procedures to detect a foetus with Down syndrome. The possibility of using biochemical markers in maternal blood for screening became a reality in 1984, when Merkatz et al. reported an association between low maternal serum α-foetoprotein and foetal chromosomal abnormalities134. Since that time, further biochemical markers (up to six) have been added to screening tests for Down syndrome to increase specificity and to reduce false positive and false negative results135. Also, in 1992, the use of ultrasound to detect to screen for chromosomal aneuploidies was reported136. The biochemical screens have been combined with ultrasound in an attempt to improve the success of screening. In addition, detection of foetal cells in maternal blood has also been examined as a possible method of non-invasive screening for Down syndrome137. All these tests and combinations thereof have significant false positive rates and do not detect all cases of Down syndrome.
It seems imperative that more bioethical debate occurs before non-invasive prenatal diagnostic techniques for Down syndrome are developed and widely implemented. Issues to be considered include, but should not be limited to, the possibility that such tests devalue the humanity of people with Down syndrome and that they might increase legal or other forms of discrimination against people with Down syndrome (see for example, Ref. 138).
Box 2 | One-carbon and folate metabolisms
In 1999, a provocative and controversial study was published suggesting that mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR) that decrease the activity of the encoded enzyme might increase the risk of birth of a child with Down syndrome139. Many studies have been done to confirm or refute this claim, and there remains noteworthy disagreement140. One-carbon and folate metabolism might be altered in children with Down syndrome141. One intriguing study suggests that in families in which a neural tube defect had been observed there was an increase in the risk of a birth with Down syndrome and vice versa142. Given the known ability of folic acid supplementation before conception to decrease the risk of birth of children with neural tube defects, this indicates that altered folate metabolism might also have a role in conception or development of people with Down syndrome.
Most cases of Down syndrome arise from errors in maternal meiosis I, which occurs during female foetal development. The oocytes remain 'frozen' in meiosis I until ovulation143. It could be proposed that it is the nutritional status of the maternal grandmother that is important, and that no effect of folate supplementation would be seen until the second generation after supplementation141. In this regard, two studies suggest that there is a maternal grandmaternal-age effect in Down syndrome. That is, there is an increased incidence of births of children with Down syndrome as the maternal (but not paternal) grandmother's age increases144, 145. This indicates that indeed the environment of the foetal development of the mother might be important for Down syndrome.
Мы знаем с конца 1950s, что , который возникает ~ 1 на 800 живорожденных1 является результатом trisomy of chromosome 21 (Ts21)2. Однако, молекулярные факторы, которые лежат в основе специфических фенотипических компонентов этого нарушения остаются неизвестными. Последние 15 лет достигнут определенный прогресс в качественном описании специфических свойств, которые ассоциированы с Down syndrome, в разработке жизнеспособных мышей, моделирующих Down syndrome, а наши всё усложняющиеся знания о геномах человека и мыши возобновили интерес к этой области (Timeline).
Несмотря на увеличение качества жизни индивидов с синдромом Дауна средний возраст гибели пациентов с этим синдромом с 30 лет увеличился всего на 1 год3, большинство людей с синдромом Дауна были наделены законным статусом, но многие врачи и исследователи уверены, что пациенты с синдромом Дауна никогда не достигнут большинства из обычных рубежей (milestones) развития. Сегодня почти все дети с Down syndrome в развивающемся мире воспитываются своими родителями и посещают школы с изучением полных или неполных программ. Также благодаря в основном успехам здравоохранения и изменениям позиции средний возраст гибели этой популяции увеличился до 49 лет (Ref. 3), и ожидается, что жизнь сегодняшних однолетних персон с синдромом Дауна м. достичь более 60 лет4. Т.к. вероятная продолжительность жизни продолжает расти, то интеллектуальная неспособность и нейродегенеративные нарушения у людей с синдромом Дауна становятся всё более важной персональной и социальной проблемой. Современные тенденции указывают на то, что до тех пор, пока наше понимание механизмов, которые лежат в основе нерасхождения хромосом, не достигнет той точки, когда мы сможем эффективно предупреждать это критическое событие продукции Ts21, количество индивидов с синдромом Дауна в популяции скорее всего возрастёт 4.
Общие клинические аспекты Down syndrome рассмотрены в др. обзорах5,6 и не будут обсуждаться.
The early history of Down syndrome
В 1859 Чарлз Дарвин опубликовал Происхождение Видов, где изложил теорию эволюции7. Классическая работа Дарвина имела дело почти исключительно с животными, но он участвовал в дебатах о происхождении и эволюции человека. John Langdon Down предоставил Дарвину с избытком субъектов для его плодотворного труда The Descent of Man8, так что очевидно, он был осведомлен об интеллектуальных брожениях относительно эволюции и генетики.
В 1865 Георг Мендель опубликовал свои законы генетики9. Down опубликовал Observations on an Ethnic Classification of Idiots; свое описание синдрома Дауна10. Down верил, что синдром Дауна представляет собой расовую "retrogression", обусловленную "instances of degeneracy arising from tuberculosis in the parents." Он сгруппировал людей с синдромом Дауна как имеющих "Монголоидные" признаки, поэтому и закрепился несоответствующий термин 'Монголоиды', для обозначения людей с синдромом Дауна. Down обсуждал философское значение этой терминологии в терминах, могт ли быть люди сгруппированы в непреложные расы или "...races are merely varieties of the human family having a common origin." Он пришел к заключению "I cannot but think that the observations which I have recorded are indications that the differences in races are not specific but variable. These examples of the result of degeneracy among mankind, appear to me to furnish some arguments in favour of the unity of the human species."
C John Langdon Down вступил в спор Owen Conor Ward11, который писал "He was a man of his time, with great insight compared to many of his contemporaries, but with some of the inevitable limitations that are to be expected when so much of the knowledge and the means of acquiring knowledge - which we now take for granted - were simply not available." Объяснение Ward's включает две неопровержимые мелочи: сын Down's, Reginald Langdon Down, впервые описал классическую картину ладонных складок у людей с синдромом Дауна; а сын Reginald Langdon Down's - также названный John Langdon Down - имел синдром Down.
Несколько десятилетий спустя после публикации пионерского труда Down's было предположено, что причина синдрома Дауна заключена в плода или др. эндокринных дисфункциях, сифилисе, средовом инсульте во время беременности, социтальном положении, алкоголизме, кровном родстве, расовых признаках и маточном истощении12. Интересно, что ассоциации между синдромом Дауна и преждевременным снижением познавательной способности были распознаны только в 1876 (Ref. 13), более чем за 30 лет до того, как Alois Alzheimer описал neuropathological-neuropsychiatric состояние, которое сегодня носит его имя14, и более чем за 70 лет до ассоциации с Down syndrome15.
В 1961 когда стала доступна солидная эпидемиологическая и цитогенетическая информация о синдроме Дауна, престижная группа из 20 биомедицинских исследователей подписала письмо, которое было опубликовано в The Lancet16, призывая своих коллег прекратить использовать термин 'mongolism' и его производные для описания людей с синдромом Дауна и предложила среди прочих термин "trisomy 21 anomaly". На 1965 World Health Assembly, делегация от Монгольской Народной Республики неформально обратилась а Генеральному Директору World Health Organization (WHO) с просьбой, чтобы термин Mongol и mongolism был устранен17. Хотя этот термин исчез из публикаций WHO после этого запроса, он продолжал появляться в научной литературе до начала 1970s пока постепенно не исчез частично благодаря постоянному давлению родительских групп и ученых из Японии и Китая.
Chromosomes and Down syndrome
Роль хромосомной трисомии при синдроме Дауна выявлялась медленно. В 1882, Walther Flemming описал хромосомное поведение во время деления клеток18. В 1900, вновь открыты Менделевские законы, а в 1903, Walter Sutton отметил, что хромосомы следуют Менделевским законам и предположил, что гены м. располагаться на хромосомах19. В 1915, Thomas H. Morgan с коллегами опубликовал The Mechanism of Mendelian Heredity20, которое сделало почти неопровержимым факт, что гены расположены на хромосомах. В 1920 концепция хромосом, как носителей генов стала общепринятой.
В 1921 Theophilus S. Painter представил доказательства того, что люди имеют от 45 до 48 хромосом21. В 1923 он пришел к выводу, что правильным количеством хромосом является 48 исходя из анализа тканей только двух индивидов - больных из Texas State Insane Asylum22. В 1932, Charles B. Davenport высказал предположение, что хромосомные аномалии м. вызывать интеллектуальную неспособность, включая Down syndrome. Он получил образцы ткани от индивидов с синдромом Дауна и отослал их Painter, который не нашел очевидных хромосомных нарушений23. В тот же год Petrus J. Waardenburg высказал предположение, что нерасхождение, которое ведет к трисомии или моносомии м. вызывать синдром Дауна24. Прошло более 25 лет прежде чем было установлено правильное количество хромосом у человека и была подтверждена гипотеза Waardenburg's.
В 1956 Joe H. Tjio and Albert Levan проанализировали 261 хромосомных пластинок от 4 случайных абортированных плодов и пришли к выводу, что человек имеет только 46 хромосом25. Они отметили, что количество в 48 настолько укоренилось, что исследователи, которые находили 46 хромосом в своих выборках подозревали, что отсутствующие 2 хромосомы они просто не нашли. Это открытие было воспринято с трудом. Напр., Masuo Kodani сообщил, что люди м. иметь 3 разных набора хромосом; 46, 47 и 48 (Ref. 26). In 1958, Tjio and Theodore T. Puck опубликовали результаты анализа нескольких сотен метафазных пластинок из 5 тканей 7 индивидов и подтвердили, что правильное число хромосом 46 (Ref. 27). В этом же году Jerome Lejeune установил, что синдром Дауна вызывается трисомией HSA21 (Ref. 2). Почти одновременно Patricia Jacobs с коллегами опубликовала манускрипт28, в котором подтверждала находки Lejeune's. Несколько исследований сообщали о синдроме Дауна в результате хромосомных транслокаций, которые затрагивают HSA21 и о мозаицизме по Ts2129-31.
В течение декады эти цитогенетические открытия привели к технической возможности пренатального тестирования синдрома Дауна на базе кариотипа метафазных пластинок от выборок клеток плода. Ясно, что главной причиной этих тестов стало предоставление возможности родителям решить о прекращении беременности, хотя были и др. причины; напр., это позволяло запланировать рождение ребенка с синдромом Дауна (Box 1).
Genotype-phenotype correlations
В 1960s, описаны многочисленные примеры т.наз. тандемных транслокаций между двумя HSA21s, которые приводили к трисомии разных областей HSA21. В 1970 Caspersson и др. внесли banding хромосом в цитогенетику человека, так что индивидуальные хромосомы оказалось возможным подразделить на специфические регионы или полосы32. В том же году Caspersson et al.33 проанализировали выборки крови от нескольких индивидов с синдромом Дауна и без оного, но с трисомией части HSA21 - но не дистальной части длинного плеча - и установили, что "the genetic material, which in triplicate gives Down syndrome, is on the distal part on the long arm of chromosome 21." Вскоре и др. исследователи также подтвердили, что трисомия дистальной трети HSA21, диска 21q22, м. вызывать синдром Дауна и что тяжесть синдрома м. зависеть от длины трисомной области34,35. Это были первые попытки определение генотип-фенотипических корреляций при синдром Дауна.
Др. исследователи расширили концепцию генотип-фенотипических корреляций. Путём сравнения множества индивидов с частичными Ts21 была выявлена критическая для синдрома Дауна область36,37. Важную модификацию в оригинальную концепцию внесли Korenberg с коллегами, разработав гипотезу, что специфические аспекты фенотипа синдрома Дауна м.б. ассоциированы со специфическими регионами HSA21 (напр., врожденный порок сердца), тогда как др. (напр., умственная отсталость) м. б. не связаны38,39.
Origins of the phenotypic features
Имеется две принципиальные гипотезы того, как Ts21 обусловливает синдром Дауна. Обе исходят из предположения, что если ген присутствует в трех копиях, то уровень экспрессии этого гена д.б. повышен - в простейшем случае на 50%. Гипотеза эффекта дозы гена предполагает, что повышенная экспрессия специфических трисомных генов непосредственно ведет к специфическим проявлениям синдрома Дауна. Гипотеза амплифицированной онтогенетической нестабильности утверждает, что в целом наиболее важной причиной набора фенотипических свойств, которые ассоциируют с синдромом Дауна, не является результатом непосредственного вклада специфических генов на HSA21, а скорее результатом того, что повышенная активность набора генов, независимо от их идентичности, д. приводить к снижению генетической стабильности или гомеостаза40,41. Следовательно, большие количества трисомных генов делают плоды более чувствительными к формированию аномалий. Эти две гипотезы в действительности не являются взаимо исключающими. Главные сторонники гипотезы амплифицированной геномной нестабильности готовы признать, что м. существовать некоторые фенотипы синдрома Дауна, которые в значительной степени испытывают влияние со стороны специфических трисомных генов.
Гипотеза амплифицированной генетической нестабильности д. объяснить два наблюдения - факт, что фенотипическая общность (commonalities) обнаруживается при многих состояниях; и что фенотипические признаки синдрома Дауна появляются у эуплоидных людей, но со значительно меньшими частотами. Некоторые признаки синдрома Дауна обнаруживаются при др. анеуплоидиях, а некоторые нет. Др. анеуплоидные состояния не дают в результате проявление нейропатологических признаков болезни Альцгеймера или повышенный риск этого заболевания. Этот уникальный повышенный риск патологии, подобной болезни Альцгеймера, и деменции, подобной при болезни Альцгеймера, у людей с синдромом Дауна ведет к гипотезе, что ген на HSA21 д. участвовать и в возникновении болезни Альцгеймера42 и было продемонстрировано, что мутации в гене, который кодирует amyloid precursor protein, , вызывают болезнь Алцгейцмера с ранним началом 43. Хотя это м. расценить как аргумент, что эта очевидная уникальность патологии, сходной с болезнью Альцгемера, у взрослых с синдромом Дауна является простым следствием увеличения продолжительности жизни у этих индивидов по сравнению с людьми с др. аутосомными анеуплоидными состояниями, но наблюдаются и некоторые др. самостоятельные признаки. Напр., и , которые ассоциированы с синдромом Дауна, имеют уникальные клинические характеристики44 и редко, если вообще, встречаются при др. анеуплоидных состояниях. Наиболее частыми формами пороков сердца, которые встречаются у людей с синдромом Дауна, являются дефекты атриовентрикулярного канала, в то время как среди наиболее распространенных пороков сердца при трисомии 13, 18 и 22 являются дефекты межжелудочковой перегородки5,6,45. Также , которая не характерна для др. анеуплоидий, затрагивает 2-5% детей с синдромом Дауна, тогда как 20-30% от всех детей с duodenal atresia имеют синдром Дауна5,6.
Mapping and sequencing of HSA21
Somatic-cell hybrid mapping. Обнаружение, что слияние соматических клеток грызунов и человека часто приводит к тому, что гибридные клетки сохраняют одну или немного человеческих хромосом, существенно повлияло на картирование HSA21. В 1973 были картированы первые два гена на HSA21 с помощью этого подхода - ген рецептора interferon () и ген indophenol oxidase B, сегодня известной как cytosolic superoxide dismutase ()46. Линия гибридных клеток, которая была описана в этом сообщении и её производные используются еще и сегодня.
В 1977 Moore et al.47 картировали ген фермента пуринового биосинтеза phosphoribosylglycineamide synthase () в HSA21, используя гибриды между клетками человека и клетками Chinese hamster ovary (CHO), которые были дефектны по гену GARS нуждались в пуринах для своего роста. Таким образом HSA21 или его фрагменты (такой длины, что содержали GARS) м. избирательно поддерживаться в гибридах соматических клеток. Этот подход для большого количества гибридов соматических клеток, которые содержали разные фрагменты HSA21 стал быстро использоваться многими лаб. для картирования генов на HSA21. В 1990 набор из 4-х гибридов был адоптирован исследователями HSA21 как наиболее подходящий для картирования HSA21 гибридов соматических клеток48. В 1995 эта панель содержала 27 хорошо охарактеризованных гибридов соматических клеток49,50.
Radiation hybrid mapping. В 1975 Goss and Harris опубликовали элегантную работу, описывающую использование гибридов соматических клеток для определения относительного физического сцепления и порядка генетических маркеров вдоль хромосом51. Этот метод с использованием облученных клеток человека, непосредственно слитых с клетками CHO, в которых отсутствует активность hypoxanthine phosphoribosyltransferase (), позволил выявить большое количество гибридных клеток, которые содержали человеческий HPRT selectable маркер и затем измерить, как часто др. маркеры на X хромосоме ко-сегрегировали вместе с маркером HPRT marker (который, как известно, находится в X хромосоме).
В 1990 описан общий метод радиационного гибридного маркирования52. Во-первых, CHO/human гибридные соматические клетки, которые содержали HSA21 облучали, а затем сливали с HPRT-дефицитными CHO клетками. Во-вторых, HPRT позитивные клоны, которые содержали функциональный HPRT ген от облученных гибридов, отбирали. Затем статистически анализировали присутствие и ко-сегрегацию HSA21 маркеров, чтобы определить расстояние между ДНК маркерами и последовательность маркеров. Этот метод и стал оплотом картирования генома человека.
Linkage mapping. Генетическое маркирование сцепления HSA21 позволило определить порядок маркеров вдоль хромосомы и получить указания на возможную роль мейотической рекомбинации, которая м.б. важной для понимания событий нерасхождения, которые ведут к Down syndrome53. Напр., сейчас ясно, что мейотическая рекомбинация варьирует по уровню и положению вдоль HSA21. Анализ полиморфных маркеров также важен для установления, что огромное большинство добавочных HSA21s при синдроме Дауна предопределяется матерински54. Т.к. ДНК клоны, содержащие маркеры, используемые для определения сцепления, становятся доступны, то карты сцепления были быстро интегрированы с цитогенетическими, somatic-cell гибридными и физическими картами хромосом.
Physical mapping. Первоначально физическая карта HSA21 была цитогенетической, которая всё ещё обладает преимуществами для выявления связи хромосомных аномалий с последовательностями ДНК55. Др. карты были сопоставлены с цитогенетической картой разрешения светового микроскопа. Однако, создание физической карты HSA21 в терминах пар оснований ДНК нуждается в дальнейших технических усовершенствованиях; в частности, в методе для разделения крупных фрагментов ДНК по размеру на геле с использованием рестрикционных энзимов, которые бы разрезали ДНК человека с редкими интервалами, и в методах клонирования крупных фрагментов ДНК (порядка сотен kilobases ДНК). Разработанные между 1984 и 1992 эти методы быстро были использованы для картирования HSA21 (Refs 56 B57 B58 B59 B60 B61 B62 B63 B64, 56-64).
Критической ступенью как при картировании, так и секвенировании HSA21, и даже всего генома человека, была разработка методов клонирования крупных фрагментов ДНК. Первый успешный метод связан с созданием YACs58, это позволило клонировать фрагменты ДНК, которые были больше 1 миллиона п.н., в дрожжевых клетках. Затем они анализировались в отношении ДНК маркеров и собирались в непрерывные (contiguous) клоны, которые покрывали большие области генома. HSA21q был одним из первых из двух плеч, для которого был сконструирован contiguous набор перекрывающихся YAC клонов60.
YACs были огромным техническим прорывом, но они имели тенденцию перестраиваться и содержать ДНК из разных геномных областей, благодаря чему возникали химерные клоны. technical breakthrough but they had a tendency to rearrange and to contain DNA from different genomic regions, thereby producing chimaeric clones. Это делало чрезвычайно трудным продукцию минимальных наборов YACs, которые бы перекрывали HSA21q без пропусков50,65. К счастью, были вскоре разработаны методы клонирования несколько меньших фрагментов ДНК бактерий до нескольких сотен т.п.н.62,64, тем самым были решены проблемы с перестройками и химеризмом.
В 1990 HSA21 сообщество создало Chromosome 21 Joint Yeast Artificial Chromosome Effort48; достижение, с помощью которого библиотеки large-insert ДНК клонов были скринированы в отношении специфических клонов от всех исследователей, работающих с HSA21. За 3 года более 1200 large-insert клонов стали доступными более чем 70 лабю по всему миру.
Sequencing. Успехи своей долгой истории совместных усилий сообщество HSA21 обсудило (в 1994) и официально создало (в 1996) консорциум для секвенирования HSA21 (Ref. 66). Действительные ДНК последовательности HSA21q были получены в первую очередь лаб. Японии и Германии, но они базировались на работе всего HSA21 сообщества исследователей. Публикация ДНК последовательностей HSA21 представила собой кульминацию усилий по картированию67. Эта публикация интегрировала физические карты, карты сцеплений и карты гибридов соматических клеток и предоставила инициальную аннотацию генного содержимого HSA21q и некоторых др. физических признаков HSA21, таких как содержание , содержание повторяющихся последовательностей и распределение транскриптов. Это представило собой плодотворное достижение исследований синдрома Дауна и создало базу для изучения структуры. экспрессии и функции генов и привело к созданию мышиных моделей синдром Дауна, к анализу паттерна метилирования68 и изучению новых РНК транскриптов с HSA21 (Ref. 69).
Анализ последовательностей ДНК HSA21 подтвердил несколько предположений о HSA21. Напр., многие исследователи предполагали, что одной из причин Ts21 является совместимость с жизнью, т.е. что HSA21 м.б. относительно бедна генами. На фоне кажущиеся чрезмерной важности 21q22, было предположено, что этот диск м.б. относительно богат генами по сравнению с др. областями хромосомы. Оба предположения оказались верными67. Публикация мышиных геномных последовательностей позволила сравнить мышиного генома с HSA21 (Ref. 70), это усилило всё продолжающуюся аннотацию HSA21 и оказалось очень важным для оценки соответствия мышиных моделей синдрома Дауна71.
В 2001 Patil et al.72 использовали последовательности HSA21 и генетическую технику соматических клеток для изучения распределения SNPs на HSA21 у разных индивидов. Этот подход выявил блоки ограниченного разнообразия гаплотипов. С помощью использования технологии гибридных соматических клеток для отдельных индивидуальных HSA21s, они оказались способны элиминировать неопределенности, связанные с присутствием двух HSA21s эуплоидных клетках человека. Это было первое исследование для выявления в целой хромосоме. Эта находка оказала мощное выраженное влияние на всесторонние , предназначенные для картирования локусов, которые имеют отношение к болезни, т.к. из-за однажды установленных блоков количество SNPs, которое необходимо изучить, заметно уменьшилось.
The transcriptome and proteome
The transcriptome. Измерение уровней мРНК является наиболее прямым методом выявления альтераций генной экспрессии при синдроме Дауна. Mao et al.73 провели такой анализ материала плодов Ts21 человека. Результаты показали глобальное усиление активности экспрессии генов, которые картируются в HSA21, но не др. генов генома. Анализ микромассивов Ts21 и Ts13 клеточных линий показал едва различимое увеличение экспрессии трисомных генов по сравнению с диплоидными клеточными линиями74. В противоположность находкам of Mao et al.73 этот подход предоставил доказательства широко распространенной, более крайней дисрегуляции генов, которые не находятся на трисомной хромосоме. Авт. сообщили о существенных различиях для генов, которые дисрегулируются в трисомных клетках. Было важно определить не только, экспрессируются ли HSA21 гены в соответствии с дозой генов при синдроме Дауна, но и установить паттерны пространственной и временной экспрессии этих генов. Ведутся работы по решению этих вопросов75,76.
Использована технология микромассивов для изучения транскриптома HSA21 и HSA22 (Refs 69,77). Эти работы предоставили доказательства, что транскриптом HSA21 значительно больше, чем полагали ранее, с лишь 31.4% транскрибируемых нуклеотидов, кодирующих хорошо известные гены69. Природа дополнительных транскриптов пока не совсем ясна. Это наблюдение м. привести к пересмотру количества генов, присутствующих на HSA21 и вообще к расширению наших представлений о том. что представляет собой ген.
The proteome. In 1975, O'Farrell описал (2DGE)78. 2DGE быстро был применен для анализа синдрома Дауна79-83, но в целом заключения были скорее разочаровывающими. За исключением SOD1, белки не были идентифицированы. Белки или увеличивались или снижались благодаря присутствию добавочной HSA21, но в тот момент истории точная количественная оценка была почти невозможна. Не было проведено исследований выборок тканей от индивидов с синдромом Дауна, а исследования на клеточных культурах были ограничены из-за их релевантности к паттернам белков in vivo84
Многие из этих трудностей были преодолены благодаря техническим успехам, таким как использование и поискам по базам данных для идентификации белков. Сложность протеома требует дальнейших методов фракционирования белков и прогресс в этой области уже наметился. Мышиные модели м. служить в качестве пригодной альтернативы для преодоления трудных проблем, связанных с получением соотв. выборок от людей. Вопрос количественной оценки м.б. решен с помощью новых экспериментальных подходов, таких как (DIGE)85.
The use of mouse models
Нарушение познавательной способности является одним из наиболее нуждающихся в экспериментальном изучении признаков синдрома Дауна. Имеется настоятельная связь познания с нейробиологией и нейрофизиологией. Для этого необходимы модельные организмы. Наиболее пригодными моделями являются мыши 86. Тем не менее мыши, не люди и для каждого нового изученного фенотипа, сходного с синдромом Дауна, необходимо определять приложимость результатов от мышиных моделей к ситуации у людей.
Чтобы животная модель была пригодна для изучения синдрома Дауна необходимы два признака. Во-первых, фенотип животной модели, д. обладать свойствами, которые характерны для синдрома Дауна. Во-вторых животные модели д.б. трисомными по гену или генам, присутствующим в HSA21. Вплоть до 1969 не было доказательств, что эти признаки встречаются у кого-либо кроме людей. В этот год была описана шимпанзе, которое имело многие фенотипические признаки, ассоциированные с синдромом Дауна87. Проверка хромосом этого шимпанзе показала, что он является трисомиком по небольшой , напоминающей HSA21, хромосоме 22 шимпанзе. Это было первым указанием на то, что аутосомы млекопитающих м.б., по крайней мере, частично законсервированы и что фенотипы, которые напоминают синдром Дауна, м. наблюдаться и у др. видов. Предположение, что эти две хромосомы сходны было подтверждено, когда последовательности ДНК хромосомы 22 шимпанзе были проанализированы88. Этот анализ был расширен и на др. hominoids и позволил сделать заключение о эволюции hominoids и некоторые логические выводы о неожиданной сложности геномных изменений после видообразования88,89. Важно, что консервация хромосомных областей м. распространяться и на др. млекопитающих, включая и мышей.
Trisomy mouse models. В 1970s Alfred Gropp с сотр. получили линии мышей, которые позволили получать трисомию по любой из мышиных хромосом90. В 1978 Charles Epstein91предположил, что "For studying human trisomy 21, it would be useful to have a mouse model of aneuploidy for a chromosome or chromosome segment homologous to that part of human chromosome 21 that gives rise to Down syndrome. Once the human chromosome 21 loci, such as superoxide dismutase-1, the antiviral genes, and glycinamide ribonucleotide synthase, are mapped on the mouse genome, it will be possible to study systematically the consequences of aneuploidy on the functions of these loci." Первый ген, локализованный на HSA21 был картирован на mouse chromosome 16 (MMU16) в 1979 (Ref. 92). В 1980 на базе фенотипического сходства между Ts16 у мышей и синдромом Дауна и синтении между частями HSA21 и MMU16, Ts16 мыши были идентифицированы в качестве потенциальной модели синдром а Дауна 93,94. Ts16 мыши обладают многими признаками, которые напоминают синдром Дауна и м. использоваться для изучение некоторых аспектов синдрома Дауна. Однако, модель имеет несколько недостатков. MMU16 содержит множество генов помимо тех, что присутствуют на HSA21, а также не содержит всех генов из HSA21. Более того, Ts16 мыши обычно погибают при рождении, так что они не м. б. пригодны для многих исследований синдрома Дауна95.
The Ts65Dn mouse. Более живучи и и широко используются модельные мыши Ts65Dn, полученные группой Muriel Davisson's96,97. Мыши Ts65Dn имеют добавочную хромосому, занимающую большую часть MMU16, которая гомологична HSA21, транслоцированную на MMU17 центромеру. Они обладают многими физическими, поведенческими и нейрологическими признаками, которые напоминают синдром Дауна, включая , связанную с возрастом потерю в базальной части переднего мозга и очевидный дефицит обучения и памяти98-105 (Табл. 1). Трисомная область распространяется от Mrp139 до Znf295 и содержит приблизительно 136 генов, которые являются ортологами человеческих генов на HSA21 (Ref. 106).
Other segmental trisomy mouse models. Др. модельные мыши с сегментной трисомией также используются, но всё ещё не достаточно охарактеризованы. Ts1Cje мыши получены в лаб. Charles Epstein, они имеют транслокацию между мышиной хромосомой 12 и 16. Точка разрыва транслокации в MMU16 находится внутри Sod1, и инактивирует этот ген. Следовательно, эти мыши являются трисомными по сегменту от разорванного Sod1 до Znf295 (Ref. 107). Ts1Cje мыши содержат ~97 генов ортологов HSA21. С помощью разумного разведения Ts1Cje и Ts65Dn мышей возможно получать мышей, которые трисомны по области между Mrp139 и разорванным Sod1, которая содержит примерно 39генов108. Сравнение фенотипов этих мышей проводится активно, уже ясно, что трисомия разных областей MMU16 ведет к заметным отличиям фенотипов104,107,108.
Мыши с сегментной трисомией были использованы для определения изменений в транскриптоме благодаря трисомии со смешанными результатами. При анализе микромассивов мозжечка Ts65Dn мышей Saran et al.109сообщили, что они м. выявлять альтерации ортологов HSA21, как и ожидалось, но что изменения в индивидуальных генах едва обнаружимы. Они также сообщили об изменениях экспрессии тысяч генов в мозжечке Ts65Dn мышей, что указывает на глобальную дестабилизацию транскрипции. Lyle et al.110 использовали количественную (RT-PCR) чтобы показать, что у Ts65Dn мышей только ~33% трисомных генов обнаруживают 1.5-кратную избыточную экспрессию, возможно благодаря дозе генов. Kahlem и др.106 использовали анализ массива кДНК и количественную RT-PCR и получили сходные результаты. Amano et al.111 установили, что в головном мозге Ts1Cje мышей, уровни экспрессии большинства генов в трисомной области повышены ~1.5-кратно, тогда как экспрессия генов в др. хромосомах в основном не меняется.
Transgenic mice. Получено несколько трансгенных мышей, которые экспрессируют от одного или нескольких генов до всего сегмента HSA21 (YAC трансгенные мыши). Как и ожидалось, ни один из них не воспроизводит всего фенотипа синдрома Дауна, но многие имеют свойства, напоминающие аспекты фенотипа. Трансгенные мыши, содержащие SOD1 человека были впервые получены, как содержащие ген, кодируемый на HSA21 (Ref. 112). Такие мыши имели некоторые признаки, которые сходны с таковыми у людей с синдромом Дауна113,114. Многие исследователи получили трансгенных мышей, которые экспрессировали нормальные и мутантные формы APP, и продемонстрировали дефицит обучения и памяти у этих мышей, включая производительность, снижающуюся с возрастом. Недавно созданы компаундные трансгенные мыши, которые экспрессировали SOD1 и APP человека115. Рабочая память и долговременная память тяжело нарушена у этих двойных трансгенных мышей; они имели дефекты процессинга APP, накапливали lipofuscin и имели митохондриальные аномалии. Эти находки являются интригующими в свете всё увеличивающихся доказательств связи между дисфункцией митохондрий, оксидативными стрессами, процессингом APP и синдромом Дауна116.
Др. гены, которые вызывают фенотипы, напоминающие таковой синдрома Дауна, во время избыточной экспрессии у трансгенных мышей включают 117, 118, (Ref. 119), 120 и (Ref. 121).
Идеально трансгенные модельные мыши должны содержать одиночную добавочную копию соотв. гена и регуляторные элементы, которые д. б. достаточно сходными с генами дикого типа, чтобы достичь типичного пространсвенно-временного паттерна экспрессии. Эти состояния достигаются редко. Кроме того, большинство трансгенных мышей содержат трансгены человека, а они м. несоотвественным образом экспрессироваться у мышей. Несмотря на это замечательно, что эти индивидуальные трансгены, а иногда и комбинации трансгенов, имеют фенотипы которые напоминают синдром Дауна.
Future research
Безусловной целью исследований синдрома Дауна д.б. улучшение жизни людей с синдромом Дауна и их семей. Необходима интеграция многочисленных дисциплин, таких как cognitive нейрология, психиатрия, мышиная и человеческая генетика, биоинформатика и компьютерное моделирование регуляции метаболических и/или сигнальных путей. Важно количественное определение более специфических признаков, которые ассоциированы с синдромом Дауна. Как уже отмечалось122, "being able to measure accurately the outcome of an experiment is half of the battle."
В последние годы достигнут существенный прогресс по точному определению специфических нейрофизиологических недостатков, которые ассоциируют с синдромом Дауна.Напр., Pennington и сотр.123 показали, что у людей с синдромом Дауна функция гиппокампа диспропорционально поражена в общем контексте их познавательной неспособности. Количественные neuroimaging исследования у детей и взрослых с синдромом Дауна предоставили морфометрические подтверждения этой идеи124,125. Функциональные imaging исследования и in vivo radioligand binding imaging с помощью (PET) д. предоставить нам ключевую информацию для выбора стратегии будущих исследований на молекулярном и клеточном уровнях на животных моделях.
На молекулярном уровне различные глобальные подходы для достижения транскриптома и протеома открывают новые возможности. Мы сегодня способны искать возможные альтерации объективным способом и использовать эти подходы для выдвижения гипотезы, которая будет затрагивать всю биологическую систему. Привлекательными свойствами этих подходов является то, что они м. выявлять альтерации в экспрессии генов, которые не на HSA21 при синдроме Дауна. Изменения всей биологической системы - напр., метаболических путей, передачи сигналов, функции протеосом, регуляции транскрипции, генерации энергии и митохондриальной функции - или некоторые еще нераспознанные пути м. б. выявлены с помощью этих объективных подходов.
Разрабатываются новые модельные линии мышей для более глубокого понимания нейробиологии мышей, моделирующих синдром Дауна (Ref. 126). Особенно элегантный набор экспериментов на базе некоторых мышиных моделей используется для анализа ранних аномали, ассоциированных с болезнью Алцгеймера102. Эти аномалии рассматриваются некоторыми исследователями как самые ранние обнаружимые аномалии при болезни Альцгеймера , они обнаруживаются также и у Ts65Dn мышей. Интересно, что Ts1Cje мыши не обнаруживают этих аномалий, это указывает на то, что один или более генов располагаются в Ts65Dn трисомном сегменте, но не в Ts1Cje сегменте, они и м. б. необходимы для продукции этих аномалий. Cataldo et al.102> показали, что редукция App от трёх копий до двух у Ts65Dn мышей элиминирует эндосомную аномалию. Однако, только повышенная экспрессия одного App у трансгенных мышей не м. вызывать эндосомную аномалию, это указывает на то, что трисомия по App необходима, но не достаточна для фенотипической экспрессии эндосомных аномалий.
Большинство анеуплоидных мышиных моделей синдрома Дауна м. оказаться очень пригодными. Все сегментные трисомии мышей, которые сегодня существуют являются трисомными для областей MMU16. Т.к. MMU16 не содержит всех генов, которые присутствуют в HSA21, то мыши содержат сегменты MMU16, которые никогда не смогут представить полную модель синдрома Дауна. Следовательно, мыши, которые трисомны по MMU10 и MMU17 (которые содержат ~22 и ~53 HSA21 генов ортологов, соотв.y71) м. предоставить ключевую информацию о Down syndrome-подобных признаках, которые отсутствуют у Ts65Dn мышей (напр., пороки сердца). В двух лабораториях предприняты прямые подходы по введению HSA21 в эмбриональные стволовые клетки мышей; т.е. мыши содержат HSA21 (Refs 127,128).
Conclusions
The history of research about Down syndrome is inextricably linked, both on a conceptual and technical basis, with the history of genetics. For example, it was impossible to think productively about the cause of Down syndrome until the presence and nature of chromosomes was known. Both the increased developmental instability and gene dosage hypotheses on Down syndrome depended on this conceptual breakthrough. The concept that certain regions of HSA21 might be particularly important in Down syndrome - the genotype-phenotype correlation - required the technical advances associated with the development of chromosomal banding methods.
On the other hand, many advances in genetics, especially human genetics, were pioneered by studies of HSA21, and the interest in this chromosome was, and continues to be, driven by its causal role in Down syndrome. For example, somatic-cell hybrid mapping, radiation hybrid mapping, the chromosome-wide discovery of haplotype blocks, the discovery of the unexpected complexity and size of the transcriptome, and the concept of synteny of mammalian autosomes, were all pioneered by studies of this chromosome. The first purposeful construction of a segmental trisomy mouse model of human aneuploidy - the Ts65Dn mouse - was carried out as a means to study Down syndrome.
Techniques such as large-DNA insert cloning and pulsed-field gel electrophoresis were applied to HSA21 as soon as they were developed, and often refinements in techniques were discovered during the course of these experiments. For example, the extensive nature of the difficulties in using YACs for building physical maps was largely determined by the application of this technology to HSA21.
Some long-lasting incorrect findings were the result of the technical limitations of their time. For example, the incorrect "determination" of the number of human chromosomes was largely due to technical issues. Therefore, the incorrect determination of 48 chromosomes became entrenched scientific dogma for more than 30 years. The lesson from this, which is certainly not new, is that one needs to be willing to challenge concepts and 'facts'. It can take decades not only to correct such errors, but for some knowledge to become accepted.
Некая путеводная нить будущих исследований уже становится видимой. Напр., кажется мало вероятным, что существует критическая область для синдрома Дауна. Особенно впечатляющ эксперимент Olson et al.129, который показал, что у мышей критической области синдрома Дауна недостаточно и по большей части она не необходима для продукции черепно-лицевого фенотипа у Ts65Dn мышей. Всё еще выявляются витальные одиночные гены, которые оказывают заметный эффект на фенотип, такие как App. Учитывая, что генные продукты с HSA21 участвуют в биологических системах, которые интегрированы с белками, кодируемыми на др. хромосомах, то идентификация систем, которые влияют на фенотип, д.б. критической (напр., Ref. 130). Такие системы м. непосредственно вовлекать гены с HSA21 или с др.биологических путей, которые нарушаются косвенно при трисомии. Это увеличивает сложность и д. рассматриваться как возможность расширения вероятных терапевтических мишеней (напр., Box 2). Очевидно, что это будет 'systems biology' подходом к синдрому Дауна. Этот подход сегодня наиболее неподдающийся для экспериментальной атаки, является концепцией, которая станет одной из центральных идей генетики на многие годы (Рис. 1).
Благодаря беспрецендентным экспериментальным и теоретическим инструментам, которые сегодня доступны, было бы неразумным спекулировать, что даже сложная познавательная неспособность (cognitive disabilities), которая характерна для синдрома Дауна. м.б. предметом для терапевтических вмешательств, предназначенных помочь людям с синдромом Дауна максимально повысить свой потенциал. Это м. потребовать множественные способы вмешательств, которые уже известны в медицине. Реализация такой точки зрения д. иметь важные биоэтические последствия. Как пишет Timothy Reynolds (Queen's Hospital, Staffordshire, UK)131 "The ethics of screening for cystic fibrosis are already being queried because the CFTR gene has been sequenced and a possible cure is expected. Who knows whether the human genome project will make trisomy 21 a treatable condition? We can only wait and see."
, Alberto C. S. Costa)
