Как упоминалось выше класическое картирование сцеплений привело к идентификации гена RET, как главного локуса в семьях как с S-HSCR, так и с L-HSCR. Однако, эти исследования оказались неспособны объяснить значительно более часток появление S-HSCR. Поэтому были изучены серии братьев-сестер с S-HSCR в скрининге по всему геному по факторам чувствительности, иным чем RET. Все 67 пар сибсов, за исключением двух, обнаруживали гаплотип общий по 10q11.2. В 40% таких пар сибсов выявлена мутация в кодирующей последовательности RET, что опять же подтвердило центральную роль RET в HSCR. Идентифицированы два дополнительных локуса чувствительности в 3p21 и 19q12, отвечающие за более низкий риск, чем RET (32) (Table 3). Это исследование показало, что то, что кажется как ‘‘simple’’ доминантное наследование, в действительности не имеет места в малых изученных семьях с HSCR: гетерозиготные мутации в трех разных локусах работают сочетанно и объясняют мультпликативную модель генетики S-HSCR. Более того, мультпликация подсчитанных частот этих трех аллелей чувствительности согласуется с частотой HSCR в популяции. Более того, когда только RET-негативные сиблинги и сиблинги с ‘‘mild’’ RET изменениями были проанализированы, то было подтверждено не случайное распределение 9q31. Это снова подтверждает наличие локуса модифкатора в 9q31, т.к. это уже было подтверждено в семьях со многими поколениями с L-HSCR (29).

Непосредственный анализ мутаций показал, что мутации в гене RET также являются нраиболее распространенной генетической причиной HSCR в спорадических случаях, хотя они обнаружены только в 15–35% (30,31). Для генетического вычленения спорадических форм HSCR был использован подход gene/association анализа. Т.к. только 50% RET-сцепленных семей имели мутации, то участие RET без очевидных мутаций также рассматривалось и при спорадических случаях HSCR. Следовательно, были предприняты case–control или trio designs исследования законсервированных гаплотипов, включающих и RET локус. Все исследования (все осуществленные на европейских пациентах с HSCR из Spain, Italy, Germany, и Netherlands) обнаружили одни и те же аллели/гаплотипы избчточно представленные в спорадических случаях HSCR (33–37). Свыше 60% пациентов были ностелями того же самого гаплотипа и следовательно того же самого неидентифицированного варианта. Данные четко показывают, что ген RET также является главным геном в спорадических случаях HSCR, даже когда не могут быть четко идентифицированы мутации. Только один вариант или одна комбинация родоначальных вариантов в RET, более специфичная на 5'конце или вышестоящем гене, вносит вклад в развитие большинства HSCR в Европе. Удивительно, но по-видимому, присутсвует эффект дозовой зависимости; гомозиготность по определенным RET гаплотипам ассоциирует с более высоким перевесом в соотношении (odds ratio) (37). Непосредственный анализ мутаций в GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) и Neurturin, кодирующих лиганды RET белка и, следовательно, рассматриваемых как возможные функциональные гены кандидаты, показал, что мутации редко обнаруживают у пациентов со спорадическими HSCR. Одиночные мутации в этих генах, как полагают, вносят вклад в фенотип, но не достаточны, чтобы вызвать HSCR (38, 39).

Синдром Waardenburg’s type 4 или Shah–Waardenburg синдром (OMIM 277580) характеризуется sensorineural глухотой, пигментными аномалиями кожи, глаз (гетерохромия радужки) и волос (poliosis или белая прядь), и HSCR(40, 41). Синдром Shah–Waardenburg традиционно классифицируется как ‘‘neurocristopathy’’;

Table 3. Oligogenic inheritance in Hirschsprung’s disease (HSCR)

---

---

меланоциты и ганглиолярные клетки, которые мигрируют в кишечник являются производными нервного гребня (13). Первый локус для этой синдромальной формы HSCR был картирован на хромосоме 13q22 путем идентификации с помощью descent подхода в инбредной популяции Mennonite со значительнрой степенью кровосмешения (consanguinity) и с 10 кратным превышением случаев HSCR, указывающим на высокую частоту носителей определенных связанных с HSC мутаций (42). Пациенты имели общего предшественника 12 поколений тому назад и т.о. могут быть классифицированы как очень молодой генетический изолят (менее 20 поколений). Это дает преимущество тем, что генетическая компенсация изолированной популяции очень сильно напоминает ту, сто имеется в генеральной популяции (7). Однако, в случае меннонитов важно учесть, что основатели были швейцарскими иммигрантами и , следовательно, сходство с общей популяцией белых в США возмоожно д.быть ограниченным (43). Снова, как и в случае с идентификацией локуса HSCR на хромосоме 10, находки аберраций в хромосоме 13 при HSCR помогли засечь эту область как HSCR-связанный локус (44, 45). Идентификация гена EDNRB (endothelin receptor B) в 13q22 (46) как гена болезни в этой инбредной популяции было облегчено знанием, базирующемся на фенотипическом сходстве с мутантными мышами (47). Т.к. только 87% затронутых индивидов в ибредной популяции меннонитов несли миссенс мутацию в в EDNRB гене, то были предпринято изучение ассоциаций по всему геному в 43 трио меннонитских семей, что привело к идентификации локуса на хромосоме 16q23, который вместе с EDNRB ассоциировал с чувствительностью к HSCR в этой родословной (48) (Table 3). Более того, была продемонстрирована четкая ассоциация с определенными RET аллелями. Не было идентифицировно мутаций в гене RET у Mennonite HSCR пациентов. Помимо RET и EDNRB, ни один из др. HSCR генов или локусов (в 9q31, 3p21, 19q31) не обнаруживал ассоциации. Следовательно, даже в этой инбредной популяции множественные гены в трех локусах вызывают HSCR опять же с участием гена RET или одного или более HSCR-susceptibility вариантов в неравновесном сцеплении с RET. Эти данные показывают, что варьирующая экспрессия и неполная пенетрантность синдромальных HSCR (i.e. Shah–Waardenburg syndrome) не только ассоциируют с вариантами синдромального HSCR гена (т.е. EDNRB), но и, что наиболее вероятно, обусловлены аномалиями гена, участвующего в не-синдромальной HSCR болезни (RET), который действует на др. родственном пути развития нервного гребня. Ассоциация с 16q23 не была подтверждена в non-Mennonite базе данных; , следовательно, остается неясным является ли этот локус чувствительности уникальным для этой инбредной популяции или он обусловливает низкий риск и в генеральной популяции. Не получено доказательств гаплотипа общего с 16q23 у 67 пар братьев-сестер с несиндромальным S-HSCR (32). Однако, вычленение гена, расположенного в 16q23, могло бы прояснить характер как и др. ключевых белков, вовлеченных в генез HSCR, которые играют роль в генаральной популяции.

Обнаружение мутаций в гене, кодирующем лиганд EDNRB, т.е. EDN3 (endothelin-3) у пациентов с Shah–Waardenburg не явилось сюрпризом. Xорошо известный функциональный подход к гену кандидату и знание мышиной модели помогло его идентификации (49–51). Было показано, что два разных гена одного и того же онтогенетического пути могут вызывать сходный фенотип. Менее чем у 5% популяции не-синдромальной HSCR были найдены гетерозигтные мутации по этим двум генам. Это иллюстрирует, что хотя и редко, но мутации этих генов в самом деле обусловливают риск не-синдромальных форм HSCR (52–56).

Известны 4 аутосомно доминантные формы с преимущественно de novo мутациями у пациентов с синдромальной HSCR. Для расшифровки молекулярных основ трех, критическим оказалось знание животных моделей.

У одного пациента с HSCR, сложным пороком сердца и аутономной дисфункцией, была описана мутация в ECE1 (endothelin-converting enzyme 1) (57). ECE1 рассматривается как ген кандидат, т.к. известно, что Ece1^+/– мыши нормальны, тогда как Ece1^–/– мыши обнаруживают гибель новорожденных из-за черепно-лицевых и кардиальных дефектов. Кроме того, Ece1^–/– новорожденные лишены энтерических ганглиев в конце колона (58).

Доминантная форма Shah–Waardenburg синдрома (иногда с дополнительными нейрологическими признаками, такими как ataxia, leukodystrophy и polyneuropathy) вызывается мутациями в SOX10 (sex-determining region Y-related HMG-box gene 10) (59). SOX10 рассматривается как ген кандидат, т.к. мутантен у пациентов с HSCR, что согласуется с Dom мышами, спонтанными мутантными мышами с aganglionosis (60). В 75% случаев мутации являются de novo и доминантными (57). Однако, в 25% случаев с наследуемыми мутациями родители не имели клинических признаков синдрома Shah–Waardenburg. Находка большинства de novo мутаций может быть обусловлена тяжестью фенотипа, ассоциированного с большинством SOX10 мутаций; эти дети могут не воспроизводиться, что объясрняет высокую долю мутаций de novo в SOX10. Наследование мутаций SOX10 может быть объяснено, исходя из предположения, что эти мутации обнаруживают неполную пенетрантность или варьирующую экспрессивность с только едва заметными признаками у родителей. Это подтверждает существование модифицирующих факторов у родителей и/или пациентов. of modifying factors in the parent and/or the patient.

Congenital central hypoventilation syndrome (CCHS) или Ondine’s curse (OMIM 209880) является опасным для жизни нарушением, характеризующимся неспособностью автоматического контроля дыхания, особенно во время сна (61). Наблюдение HSCR в 15–20% случаев CCHS подтверждает онтогенетическую связь и общий патогенез болезней. Эта специфическая комбинация называется также Haddad синдромом (62, 63). Поэтому некоторые известные HSCR гены (RET, GDNF и EDN3) были рассмотрены в качестве генов кандидатов для CCHS (64,65). Недавно был идентифицирован CCHS ген, PHOX2B (the paired-like homeobox) ген или PMX2b (66). PHOX2B считается геном кандидатом CCHS, т.к. у мышей формирование рефлекторных дуг автономной нервной системы зависит от Phox2b (67). Сегодня описаны мутации PHOX2B у 89 CCHS пациентов, 20 из этих случаев также имели гистологически подтвержденную HSCR (66, 68, 69). В самой большое серии из 66 CCHS случаев с PHOX2B мутациями, 4 родителя из 43 пар родителей, доступных для анализа ДНК, продемонстрировали мозаицизм по мутации. Это указывает на то, что не все мутации у пробандов с CCHS со здоровыми родителями являются de novo пациентами (69).

Аккуратное вычленение синдрома в случаях с делециями хромосомы 2q22, HSCR, микроцефалией и умственной отсталостью привело Mowat et al. (70) к заключению, что эта совокупность д.быть отделена от клинической сокупности, первоначально описанной Goldberg and Shprintzen (71) как аутосомно рецессивный синдром. De novo мутации в ZFHX1b (zinc finger homeo box 1B известного также как Smad interacting protein или Sip1) были описаны у HSCR пациентов с микроцефалией. Этот ген локализован в делетированном сегменте 2q22 у пациентов с de novo t(2;13)(q22;q22) и HSCR. Снова хромосомная аномалия помогла идентификации гена виновника с помощью позиционного клонирования (72). На сегодня описано свыше 50 случаев с мутациями ZFHX1b и вариабельным клиническим проявлением – теперь названным Mowat–Wilson syndrome (73–76). Болезнь Hirschsprung’s была варьирующим признаком в 60%. Goldberg–Shprintzen синдром на самом деле явился др. клинической совокупностью, не связанной с 2q22 (A. S. Brooks, unpublished data). В частности, лицевые признаки при Goldberg–Shprintzen синдроме, по-видимому, отличаются от таковых при Mowat–Wilson синдроме. Наиболее заметным различием является конфигурация бровей. При Goldberg–Shprintzen синдроме, брови дугообразны и могут пересекать срединную линию (synophrys), тогда как при синдроме Mowat–Wilson брови горизонтальны. Более того, существенная часть пациентов с синдромом Mowat–Wilson имеет эпилепсию, агенез мозолистого тела, тогда как эти признаки редки при синдроме Goldberg–Shprintzen (70, 71, 73–76).

В последние 10 лет идентификация 9 генов и 4 локусов для чувствительности к HSCR демонстрирует сложность генетической этиологии этого врожденого уродства. Только благодаря комбинации параметрических методов и непараметрических подходов исследования генов HSCR оказались успешными. Однако, практическое использование для генетического тестирования предрасположености к HSCR всё ещё ограничено.

Возникает вопрос, какая польза пациенту от установления мутаций гена предрасположенности к HSCR. Гетерогенная природа HSCR вместе с низким общим урожаем мутаций делает стандартное генетическое тестирование у каждого HSCR пациента время-затратным и дорогим с ограниченными клиническими последствиями. В Нидерландах генетическое тестирование с лиагностической целью возможно для RET, EDNRB, EDN3 и SOX10. К стати, 24 RET мутаций было идентифицировано у 192 пациентов со спорадическим HSCR (13%) в нашей лаб., Department of Medical Genetics, University of Groningen. В 31 семейном случае, идентифицировано 14 RET мутаций (45%). В общем, 10 мутаций было найдено в др. трех генах. Основанием генетического тестирования у пациентов с HSCR может быть исключение редкой возможности MEN 2A-ассоциированной RET мутации, которая связана с повышенным риском medullary thyroid carcinoma (77). Др. причиной молекулярного тестирования может быть получение более аккуратных подсчетов повтороного риска для родителей пациента с HSCR. Напр., находка патогенной RET мутации у пробанда мальчика с L-HSCR и исключение этой мутации у родителей м. позволить уменьшить риск повторного возникновения с 13–17% до менее, чем 1%, принимая во внимание теоретическую возможность мозаичной мутации в зародышевой линии одного из родителей (17). Модуляция риска в этом особом случае оправдана только исходя из предположения, что RET является главным геном в возникновении HSCR.

Мы не знаем о показаниях к пренатальной диагностике для RET с целью избирательного прерывания беременности, когда мутация сегрегирует в семье. Это возможно связано с варьирующей экспрессией и неполной пенетрантностью, ассоциированными с мутациями RET и хорошим прогнозом после хирургического вмешательства у большинства пациентов с HSCR (78). Это однако лишь наш скромный опыт, что родители, которые потеряли ребенка с тотальным кишечным aganglionosis, желают обсудить условия пренатальной диагностики. Тестирование полных кодирующих последовательностей гена RET, по-видимому, возможно в семьях со множественными случаями и у пациентов со спорадическим L-HSCR (79). В отсутствие генетического тестирования, пока все гены, участвующие в генезе HSCR не будут выявлены, подсчеты риска могут быть осуществлены с помощью упомянутого выше сегрегационного анализа по Badner et al. (17). Безусловно мы ожидаем, что повторные риски не будут отличаться существенно, исходя из предположения, что RET всё ещё главный ген. Все др. гены обусловливают низкий риск. EDNRB, EDN3 и SOX10 тестируются только, когда имеются дополнительные клинические признаки, такие как пиогментные аномалии.

As discussed, the genetic study of HSCR as a complex disorder shifted from family-based designs towards sib-pair and population-based studies. Although it is shown that HSCR is oligogenic and that RET is involved in almost all cases, additional HSCR loci and genes are likely to be identified in the future (29, 32). However, finding these HSCR susceptibility loci and genes might turn out to be difficult. A single approach might not suffice to find the remaining susceptibility genes. Three approaches may be proposed that could identify new HSCR genes.

First, searches for new genes will focus on the localization of HSCR loci in the genome (3p21, 9q31, 16q23, and 19q12). Linkage-based analysis such as sib-pair analysis in independent data sets using high number of single nucleotide polymorphisms or microsatellites encompassing the four loci might be instrumental for the identification of the genes.

Secondly, potential candidates are genes encoding proteins that are part of the signaling cascade for already identified HSCR genes (GDNF/RET, EDN3/EDNRB, and SOX10 pathway), and genes encoding proteins that play a role in relevant (related) developmental processes (e.g. neural crest formation). In this respect, it is important to realize that genes involved in these developmental processes may not always lead to HSCR. Hirschsprung’s disease can be a variable feature in several syndromes which was clearly illustrated in cases with CCHS related to PHOX2B mutations and children with Mowat–Wilson syndrome caused by mutations in ZFHX1b (66, 69, 73, 80, 81). The fact that HSCR can be a variable feature even in syndromes that are ‘‘mandatory’’ associated with HSCR, may erroneously lead to ‘‘splitting’’ instead of ‘‘lumping’’ syndromic cases.

Thirdly, phenotypical overlap between rareMendelian syndromic forms of HSCR (e.g. Mowat–Wilson syndrome and Goldberg–Shprintzen syndrome) may also allow ‘‘educated guesses’’ for candidate gene approaches combined with classical linkage approaches. Studies of rare phenotypes caused by mutations in genes with Mendelian inheritance (e.g. EDNRB and EDN3) have made only a limited contribution to our understanding of HSCR in the general population. However, studying families with rare presumptive singlegene associations of HSCR and other congenital abnormalities can be worthwhile. The genes involved in these syndromes will shed further light on the pathways underlying HSCR and may be useful in the understanding of the non-syndromic form of HSCR as well.