Посещений:
Nieman-Pick С

Niemann-Pick disease type C
M.T.Vanier (vanier@lyon.inserm.fr) and G.Millat
Clin.Genet. V. 64. No 4, P. 269-281, 2003

См. также:
NPC

pagano_lab


Рис.  | 

Davies, J. P., Chen, F. W. & Ioannou, Y. A. Transmembrane molecular pump activity of Niemann-Pick C1 protein. Science 290, 2295-2298 (2000) | Article | PubMed | ISI |
Naureckiene, S. et al. Identification of HE1 as the second gene of Niemann-Pick C disease. Science 290, 2298-2301 (2000) | Article | PubMed | ISI |
FURTHER READING Marx, J. Disease genes clarify cholesterol trafficking. Science 290, 2227-2229 (2000) [contents page] | PubMed | ISI |


Более 95% пациентов с Niemann-Pick disease type C имеют дефект в гене NPC1, тогда как у небольшого набора пациентов дефект обнаруживается в др. гене NPC2. В обоих случаях аберрантно накапливается cholesterol в лизосомах.
Yiannis Ioannou и др. изучали функцию белка при NPC1 болезни, они нашли, что белок содержит 6 копий сайта присоединения липидов, который обнаруживается также у членов семейства resistance-nodulation-division (RND) прокариотических пермеаз. Эти белки участвуют в накачивании гидрофобных компонентов, таких как антибиотики, детергенты и жирные кислоты из цитозоля Gram-отрицательных бактерий.
Два члена семейства RND - Escherichia coli AcrB и Pseudomonas aeruginosa MexD - обнаруживают слабую гомологию с белком NPC1 по всей его длине. Более того, NPC1 и MexD имеют сходную мембранную топологию и вторичную структуру. Ioannou и др. установили, что накопление флюоресцентной окраски acriflavine эндосомно/лизосомной системы блокируется в отсутствие NPC1 и что эта накачка является активным процессом, нуждающимся в proton-motive силе.
Авт. создали E. coli, экспрессирующих ген NPC1 человека. Затем, учитывая, что дефект при болезни NPC1 связан с накоплением холестерола, они предприняли попытку установить, м.ли он служить субстратом для NPC1. Ioannou и др. не наблюдали образование холестерола в NPC1-экспрессирующих E. coli, но они обнаружили накопление oleic кислоты, это указывало на то, что подобно своим прокариотическим гомологам NPC1 м. транспортировать жирные кислоты поперек мембран.
В др. работе Naureckiene et al. описан белок, ответственный за NPC2 заболевание. Пытаясь охарактеризовать лизосомные протеомы, они идентифицировали белок человека, названный HE1. Гомолог этого белка у свиней , как известно, связывает холестерол, поэтому учитывая его лизосомную локализацию авт. задались вопросом, участвует ли HE1 в возникновении NPC2 болезни. HE1 не выявлен в фиброластах двух пациентов с этим заоблеванием, сиквенс анализ показал, что оба пациента имеют мутации в HE1 гене.
Исследования с холестерол-связывающим антибиотиком, filipin, показали, что аномальное накопление холестерола в фибробластах от пациентов с NPC2. Но когда Naureckiene и др. обработали эти фибробласты рекомбинантным HE1, то это накопление снижалось. Среда кондиционированная HE1 не оказывала эффекта на накопление холестерола в NPC1-дефицитных фибробластов, однако, подтверждала, что дефекты при двух формах болезни NPC разные.
Эти результаты не исключают возможности, что NPC1 и HE1 м. взаимодействовать и то, что они м. действовать последовательно в общем метаболическом пути. Неясно, как эти мутации вызывают накопление холестрола.
'Nieman-Pick disease' соответствует группе болезней накопления лизосомных липидов с аутосомно рецессивным наследованием. Crocker в 1961 г предложил классификацию из 4-х подгрупп, типы A-D (1,2). Пациенты типа А обнаруживали тяжелое нейрологическое заболевание, тогда как пациенты с типом В имели хроническое течение с вовлечением только висцеральных органов. Общее массивное накопление сфингомиэлина в не-нейральных органах таких пациентов (1) и позднее проявление генерализованного дефицита кислой (лизосомной) sphingomyelinase (3,4), что делает типы А и В болезнями хранения сфингомиэлина. Пациенты с типами С и В имеют подострое вовлечение нейральных тканей, менее выраженную органомегалию, чем при типа А и и более умеренный уровень накопления липидов и отсутствие генерализованной недостаточности sphingomyelinase (1,2,4). Тип D, вычлененный от общих Acadian предшественников, неотличим ои типа С (позднее было установлено, что он аллелен типу С) (1,2). Метаболическая основа типа С и D Nieman-Pick болезни до сих пор полностью не установлена, хотя их отнесли к болезням трафика липидов (5,6). Сегодня 'Nieman-Pick disease type C' означает нарушение, характеризующееся уникальными аномалиями внутриклеточного транспорта эндоцитозированного холестерола с секвестрацией неэфиризированного холестерола в лизосомах и/или поздних эндосомах (5-10). Описаны две генетические группы комплементации (11, 12) и выделены затем два гена. NPC1, локализованный на 18q11, затрагивается в большинстве семей, включая и с типом D (13,14). HE1/NPC2 локализован на 14q24.3 и затрагивается в очень редких семьях (15-17). Предполагается, что эти белки функционируют на двух близких этапах одного пути и что они участвуют в клеточном постлизосомном/позднем эндосомном транспорте холестерола и др. грузов (6,18, 19).
C практиеской точки зрения существенно помнить, что диагноз б-ни Nieman-Pick без спецификации подгруппы м. приводить к ошибочному генетическому консультированию. Сегодняшняя классификация противопоставляет две матаболически отличающиеся группы: Nieman-Pick типа А/В, настоящие дефекты sphingomyelinase с мутациями в гене sphingomyelinase, и Nieman-Pick б-ни типа С с нарушениями доставки эндоцитозированного холестерола благодаря мутациям NPC1 или NPC2/HE1. Тип D не рассматривается в качестве самостоятельного.

Epidemiology


Nieman-Pick type C disease (NPC) является панэтническим. Оно превалирует в Зап. Европе (Франция. Великобритания, Германия) 1/120000 - 1/150000 живорожденных. Эта картина, по-видимому, занижена, т.к атипические случаи м. не распознаваться. Большинство пациентов (95% и более) имеют мутации в гене NPC1. Среди низ известны 2 генетических изолята. Один у Франц. Acadians, выходцев из Нормандии, и первоначально возникший в Nova Scotia (описан как тип D) характеризуется мутацией G992W (1,14). Др. изолят с мутацией I106T у испанцев, проживающих в New Mexico и Colorado, выходцев из долины Upper Rio Grande в США (20, 21).

Clinical phenotype and natural history


Возрастное распределение пациентов с болезнью Нимана-Пика типа С на момент диагноза. Данные по 200 пациентам.
Описывается широкий спектр клинических проявлений (22-35). Возраст начала м. варьировать от перинатального периода до взрослого (Рис. 1). Первоначальным проявлениями м.б. печеночные, нейрологические или психиатрические. Системное (печень, селезенка и лёгкие) вовлечение и нейрологические заболевания следуют независимыми путями. Варьирующее по тяжестви вовлечение печени часто присутствует в первые месяцы жизни и затем составляет главное проявление б-ни. Умеренная, иногда временная гепатоспленомегалия общераспространена, но м. отсутствовать у 10-15% пациентов. У типичных пациентов нейрологические нарушения представлены в основном мозжечковой атаксией, dysarthria, dysphagia и прогрессирующей деменцией. Cataplexy и судороги наблюдаются часто, дистония и психические расстройства случайно. В большинстве случаев обнаруживаются характерные вертикальные supranuclear gaze palsy. Задержка моторного развития и гипотония, сопровождаемые пирамидальными проявлениями являются главными признаками редкого с ранним началом быстро текущего прогрессивного варианта (32). Нет специфических различий между пациентами с NPC1 и NPC2 мутациями, хотя последние страдают более острой и тяжелой формой, часто с выраженными лёгочными проявлениями (16).
За некоторыми исключениями классификацию клинических фенотипов м. осуществить по возрасту начала и представленности нейрологической симптоматики.

Perinatal presentation


Перинатальный период является безсимптомным у более половины пациентов. У др. половины печеночная болезнь является основным проявлением. Плодный асцит или плодная водянка (hydrops). Продолжительная неонатальная choleostatic желтуха (icterus) ассоциирует с прогрессирующей гепатоспленомегалией наиболее часто (22, 26). Спонтанно разрешается в 2-4 мес. возрасте у большинства пациентов, он м. приводить к быстрой фатальной печеночной недостаточности примерно в 10% случаев б-ни печени. Дети с быстрой фатальной формой погибают до 6 мес. без нейрологических симптомов. Редки случаи тяжелой неонатальной респираторной недостаточности. Возможна ассоциация и с нейрологическими формами разной тяжести.

Infantile presentations


У детей изолированная гепатоспленомегалия м.б. единственным признаком б-ни в течение ряда лет. NPC м.б. заподозрена, если исключена Nieman-Pick В и б-нь Gaucher. Менее часта 'severe infantile nuerological onset form' идентифицируется примерно в 20% случаев в Европе (22,25). У таких детей гепатоспленомегалия присутствует практически всегда. Гипотония и задержка моторного развития становится заметной с 12-18 мес. Последующее клиническое течение включает потерю необходимых моторных навыков, и пропорционально менее выраженный ментальный регресс, сопровождаемый выраженной спастичностью с признаками вовлечения пирамидальных путей. Частый тремор при напряжении, supranuclear gaze palsy обычно отсутствует и судороги редки. Многие из таких детей не м. научиться ходить. Налицо признаки leukodystrophy. Большинство пациентов с этой формой погибают до 5 лет.

Classical disease with neurological onset in chailhood and adolescence


Наиболее распространёнными проявлениями (примерно 60-70%) являются нейрологические формы с поздним детским и юношеским началом. М. наблюдаться временная неонатальная желтуха. Гепатоспленомегалия м. не проявляться в течение ряда лет. У детей с нейрологическим началом в возрасте 3-5 лет первым проявлением часто бывает атаксическая походка, обычно сопровождаемая сплено- или гепатоспленомегалией. Если нейрологическая форма проявляется между 6 и 12 годами, то плохая успеваемость в школе обусловлена интелектуальными нарушениями и нарушениями тонких движений, часто является первым проявлением. Судороги или cataplexy случано м. стать первым проявлением. Отсутствие клинически обнаружимой органомегалии встречается в 10% случаев, в сопровождении или в последующем появлении симптомов, включая атаксию и дизартрию. Gelastic cataplexy с или без нарколепсии наблюдается примерно в 20% случаев. Падения м. приводить к повреждениям, показано лечение clomipramine и/или modafinil. Эпилептические проявления (absens, частичные или генерализованные судороги) развиваются примерно у половины "классических" пациентов и м. стать существенной проблемой. Supranuclear vertical gaze palsy (36, 37) присутствуют практически всегда и часто очевидны , но необходима проверка волевого вертикального быстрого скачкообразного движения глаз. Возможны сhoreothetoid движения и dystonic postures. По мере прогрессирования болезни развиваются пирамидальные признаки и спастичность. Моторные нарушения значительны, тогда как интеллектуальные нарушения очень изменчивы. М. возникать психотические эпизоды. Дисфагия выражена и часто необходима гастростомия. Многие из эти х пациентов погибают в тинейжерском возрасте, пациенты с поздним детским началом или с неподдающейся лечению эпилепсией погибают раньше. Некоторые из них доживают, однако, до 20-30 лет.

Adult presentation


Обычная симтоматология нейрологической формы с началом у взрослых (30) ослаблена по сравнению с ювенильной формой с незаметным началом и прогрессирующей деменцией. Психозы нередки и м.б. первым проявлением. Нарушения движений и экстрапирамидальные проявления более часты. чем в юношеской форме. Мегалия органов клинически не выявляется почти в половине случаев, у ряда пациентов отсутствуют парезы вертикального gaze.
У двух пациентов в возрасте 53 и 63 г. с изолированнной спленомегалией и с неоднозначным биохимическим и молекулярным диагнозом Nieman-Pick С предполагается существование не-нейронопатической формы болезни (38-40).

Animal models


Известны две спонтанные модели NPC1 у мышей (BALB/c-npc1nih и C57/BL/KsJ-npc11spm, а также у кошек и собак. Основополагающая роль трафика холестерола в клеточной патологии NPC впервые была продемонстрирована при изучении BALB/c мутантов (5,6). Симптомы у таких мышей проявляются в возрасте 4-5 недель. Первоначальный тремор сопровождается параличами задних конечностей, слабым питанием и гибелью между 70 и 80 днём. Мутация npc11nih даёт укороченный белок между sterol-sensing domain (SSD) и 11-м из 13 трансмембранных доменов (41). Головной мозг обеих линий мутантных мышей меньше, чем в контроле с атрофией мозжечка и областью средного мозга, включая colliculi (42,43). Прогрессивная потеря нейронов, особенно клеток Пуркинье в мозжечке является характерным. Присутствует и димеэлинизация. У NCP2 нокаутных мышей фенотип в целом сходен с таковым у моделей NPC1. Мышиные модели воспроизводят тяжелую инфантильную нейрологическую форму NPC людей. Тогда как у кошек с миссенс мутацией C955S развивается менее тяжелая ювенильная нейрологическая форма (44).

Biochemistry


Lipid storage profiles


Хотя мало исследований проведено с пациентами NPC2, профили хранения, по-видимому, сходны при NPC1 и NPC2. Паттерн накапливания липидов варьирует в зависимости от ткани (5, 6, 29, 45). Селезенка и печень обнаруживают умеренное накопление неэфиризированного холестерола и sphingomyelin (2-4-кратное увеличение) и (monoacylglycero) phospate (LBPA) и гликолипидов (главным образом glycosylceramide, lactosylceramide и ganglioside GM3). Эти изменения обнаруживаются уже у плода. В тканях головного мозга ни сфингомиэлин, ни холестерол не накапливаются откровенно, но наблюдается значительное изменение гликозсфинголипидов (glycosylceramide, lactosylceramide и ganglioside GM3 и GM2 ). Эти альтерации не обнаруживаются в тканях плодов, но постепенно появляются и усиливаются в течение двух первых лет постнатального периода. Избыток GM2 ганглиозида считается главной причиной эктопического дендритогенеза и образования меганейритов при некоторых болезнях лизосомного накопления, включая и NPC (46,47). Липиды миэлина заметно изменены только при тяжелой инфантильной форме. У мышей увеличение нейронального холестерола было незамечено из-за одновременного уменьшения белого вещества, связанного с экстенсивной демиэлинизацией и т.к. имеется увеличение холестерола в головном мозге новорожденных. Не выявлено достоверного увеличения холестерола в сером веществе пациентов с NPC, это хорошо согласуется об общем нормальном содержании неэфиризированного холестерола в культивируемых нейронах от npcnih мышей (49,50). Тем не менее, слегка аномальное окрашивание filipin нейронов NPC всё-таки было отмечено (47,49,51). Недавно было показано, что холестерол накапливается в телах нейронов NPC мышей, но снижается в дистальных частях аксонов, указывая тем самым, что дисбаланс обусловлен нарушениями переноса эндогенно синтезируемого холестерола (49,50).
Среди др. признаков (6) нейропатология NPC характеризуется сходством с б-нью Алцгеймера присутствием нейрофибриллярных tangles со спаренными спиральными филаментами белка tau (52) и накоплением амилдоид-β-белка (53). Взаимосвязь с аномалиями метаболизма холестерола дискутируется, т.к. последняя находка м.б. связана с повышенными уровнями холестерола в поздних эндосомах. Обсуждается также роль аро Е &epsulon;4 генотипа в ускорении таких изменений (54).

Cellular cholesterol homeostasis and transport


Первые исследования (7-9) и последующие работы др. лаб. (10) показали нарушения внутриклеточного транспорта эндоцитозированного холестерола в NPC фибробластах. Интернализация, транспорт в эндоцитотические пузырьки и гидролиз law-density lipoprotein (LDL), по-видимому, не нарушены. Однако, дальнейший транспорт неэфиризированного холестерола в др. сайты нарушен неизвестным способом. В результате свободный холестерол накапливается в лизосомах и/или поздних эндосомах (Рис. 2). Эта аномалия наиболее характерное специфическое свойство клеток NPC1 или NPC2.
Последующая индукция всех LDL-обусловленных гомеостатических реакций (а именно, образование cholesteryl ester) задержана в NPC клетках. Однако, нормальные гомеостатические ответы индуцируются с помощью мембран-проницаемого oxysterol и с помощью mevalonate, указывая тем самым на сохранение способности клеток отвечать (10). Недавно было предположено, что роль NPC1 и NPC2 заключается в регуляции гомеостаза стерола путём генерации LDL cholesterol-derived oxysterols (55). Однако, всё ещё спорят о том, облегчает ли NPC1 инициальный транспорт LDL холестерола в плазматическую мембрану или LDL холестерола сначала транспортируется в плазматическую мембрану, а затем интернализуется в NPC1-содержащем компартменте для дальнейшей диспозиции (19, 56-59). Считается, что мутации в NPC1 нарушают транспорт лизосомного холестерола в плазматическую мембрану и эндоплазматический ретикулём, однако в др. исследованиях (60,61) предполагается, что NPC1 м. фактически принимать участие в postplasma membrane-recycling пути, который до определенной степени также участвует в транспорте эндогенного холестерола. Самые последние сообщения не решают затронутого противоречия. Одни полагают (62), что в NPC1 клетках перенос LDL холестерола осуществляется непосредственно эндосомами в лизосомы, обходя плазматическую мембрану и оказываются отловленными здесь в случае дисфункции NPC1. Др. (63) показали, что NPC1 играет существенную роль в распределении происходящего из плазматической мембраны холестерола. Третьи (64) считают, что эндогенно синтезированный холестерол м. вносить существенный вклад в общее накопление холестерола, наблюдаемое в NPC различных типах клеток, включая и глиальные клетки. Т.к. холестерол головного мозга в основном поставляется с помощью эндогенного пути (65), то выяснение точных этапов, в которых участвует NPC1 компартмент, является очень важным для понимания патофизиологии нейродегенеративного заболевания.
Лизосомное накапливание неэфиризированного холестерола комбинируется с задержанной LDL-обусловленной регуляторной реакцией, специфической для NPC б-ни, но оно м. обнаруживать изменчивость по тяжести (Рис. 2). Некоторые аномалии, такие как накопление сфингомиэлина и свободного цистеина, по-видимому, находятся в зависимости от уровня накапливания лизосомного холестерола (6).
Фибробласты при I-клеточной болезни, как было установлено. ведут себя очень сходно с NPC клетками (66). Возможным объяснением является то, что NPC2, который нуждается манноза-6-фосфатном маркёре, не м. подвергаться обычному процессингу в таких клетках. Некоторые фармакологические агенты, или гидрофобные амины (67,68) или прогестерон (69), также индуцируют NPC фенотип при добавлении к нормальным фибробластам и в ряде исследований это используется в качестве экспериментальной модели NPC.

Molecular genetics


Выявлены две группы комплементации NPC1 и NPC2 (11,12). Более 95% пациентов связаны с NPC1.

NPC1 gene and protein


Топология мутаций NPC1. Схематическая модель белка NPC1 по Davies and Ioannou (72).

Ген NPC1 картирован на хромосоме 18q11-q12, занимает 56 т.п.н., содержит 25 экзонов (13,70,71). Он кодирует интегральный мембранный белок в 1278 аминокислот с 13 трансмембранными доменами, тремя большими просветными гидрофильными петлями, одной цитоплазматической петлёй, просветным N-концом и цитоплазматическим хвостом с dileucine мотивом (72). Область между аминокислотными остатками 615 и 797 обнаруживает строгую гомологию с SSD, идентифицированным в некоторых др. интегральных мембранных белках, которые отвечают на холестерол эндоплазматического ретикулёма (SCAP и HMG-CoA reductase). N-терминальная просветная петля содержит высоко законсервированную область (аминокислоты 55-1650 с мотивом лейциновой застёжки (аминокислоты 73-94), названным NPC1 доменом. Наконец, выявлено функциональное значение третьего домена, большой богатой цистеином просветной петли, соответствующей аминокислотам 855-1098, которая сожедит ring-finger мотив и скорее всего является местом межбелкового взаимодействия (40,73-75). Нативный NPC1 является большим трансмембранным гликопротеином (170-190 кДа), который располагается преимущественно в поздних эндосомах и взаимодействует временно с лизосомами и транс-Гольджи сетью (76,77).

Spectrum of NPC1 mutations
Выявлено 133 мутации, вызывающие NPC1, большинство из них (71%) миссенс мутации (13,14.20,40,70,71,73,74,78-83) (Рис. 3). Эти мутации разбросаны по всему гену NPC1 и затрагивают все функциональные домены за исключением мотива лейциновой застёжки. Более трети мутаций концентрируются в богатой цистеином просветной петле с горячей точкой внутри области между аминокислотными остатками 927 и 958, где локализованы 14 различных мутаций. Выявлено только 3 наиболее частых мутации. I1061T найдена у пациентов Зап. Европы (примерно 20%) аллеля в Великобритании и Франции и 15% в США. Он очень сильно превалирует у пациентов из Испанско-Американского изолята в юж. Колорадо и Нью Мехико (20). Две др., ассоциированные с умеренным нарушением трафика холестерола: Р1007А, вторая по частоте мутация в Европе. G992W типичная для Nova Scotian пациентов, менее редкая в др. популяциях и ни разу не выявленная во Франции (40,70,73,74,79-81,83). Нередко встречаются мутации R404Q, Y825C, D874V, R934Q, S940L, D958N, S954L, R978C, M1142T, N1156S, R1186H, одна из мутаций (R518Q) (83) превалирует у японцев, а P474L у итальянцев (81). Молекулярный анализ NPC1 пациентов затруднён из-за размера гена, большого числа частных мутаций и многочисленных полиморфизмов. При первичном секвенировании кДНК, мутации, дающие очень нестабильные транскрипты, м. б. пропущены (81).

NPC1 genotype-phenotype correlations
Мутации NPC1, идентифицированные у пациентов и исследования экспрессии мутантных кДНК пролили свет на взаимоотношения между структурой и функцией этого белка. Корреляции показывают, что три NPC1 домена являются критическими для функционирования: SSD, большая просветная богатая цистеином петля и просветный домен NPC1. Все мутации, локализованные в SSD, включая миссенс мутации, очень вредны, соответствуют гомозиготному состоянию отсутствия зрелого NPC1 белка, и имеют очень тяжелый биохимический и клинический фенотип (40,83). Изучение экспрессии SSD мутантов подтвердило критическую роль этого домена (84). Богатая цистеином просветная петля содержит приблизительно 50% всех описанных миссенс мутаций (включая 3 наиболее распространённые мутации), ассоциированных с изменчивой клинической и биохимической картиной. В гомо-аллельном состоянии I1061T коррелирует с нейрологической формой, начинающейся в юношеском возрасте, но сопровождается фатальной перинатальной б-нью печени. Пациенты, гетеро-аллельные по I1061T представлены всеми клиническими фенотипами, за исключением тяжёлой инфантильной нейрологической формы (20,40). Мутации, ассоциированные с биохимическим вариантом ( умеренные нарушения переноса клеточного холестерола) локализуются в петле, богатой цистеином, за 2 исключениями (40,73,74,80,81) (Рис. 3). Обзор опубликованных данных показывает образование кластера внутри небольшой области этой петли (Рис. 3). Гомозиготы по Р1007А и V950M соответствуют начинающейся у взрослых нейрологической форме. Гомозиготность по G992R описана у 63-летней женщины с не-нейрологической формой. Присутствие одиночного варианта этого аллеля, по-видимому, достаточно для обеспечения отличающегося биохимического фенотипа, который часто ассоциирует с медленно прогрессирующей начинающейся у юношей или взрослых формой, хотя это не всегда так (40,85). С др. стороны, классический биохим. фенотип постоянно наблюдается при более тяжелых нейрологических формах, но м. также ассоциировать с любой клинической формой болезни, включая взрослую форму без нейрологических проявлений. Мутации NPC1 домена (C63R, Q92R, C113R и Т137М), по-видимому, коррелируют с тяжелой инфантильной нейрологической формой (74,79,80,86).. Избыточно экспрессирующийся C113R белок не локализуется в поздних эндосомах, а скорее в эндоплазматическом ретикулёме, Rab7-негативных эндосомах и на клеточной поверхности (86). Мутации, затрагивающие или законсервированные остатки цистеина или мотив лейциновой застёжки в этом домене дают неактивный белок,, направляемый в лизосомные мембраны, окружающие холестеролом-нагруженные сердцевины (84,87).

NPC1 polymorphisms
Описано более 50 экзонных и интронных SNPs (70,71,80-83). Наиболее превалирующими полиморфизмами являются Y129Y, H215R, P237S, I642M, I858V, N931N и R1266Q. Неожиданно I642M был описан в качестве мутации, вызвавшей болезнь у одного пациента (78). P237S SNP впервые описан как вредная мутация (40,83), и лишь позднее переклассифицирован в полиморфизм (68). В финской и шведской популяции 5% аллелей несут замены P237S, а некоторые NPC1 пациенты описаны, как имеющие две мутации в дополнение к P237S замене (74,86). Избыточная экспрессия P237S определенно указывает на то, что P237S является доброкачественным полиморфизмом, а не повреждающей мутацией (86).

NPC2 gene and protein


Используя протеомный подход, ген НЕ1 картирован в хромосоме 14q24.3, который кодирует белок, первоначально описанный как главный секреторный белок человеческого epididymis, он оказался мутантным у NPC2 пациентов (15) и был переименован в NPC2. Он длиной в 13.5 т.п.н. и состоит из 5 экзонов. Зрелый в 132 аминокислоты NPC2 генный продукт является растворимым гликопротеином, экспрессирующимся повсеместно во всех изученных тканях (15). NPC2 связывается с манноза-6-фосфатными рецепторами и мигрирует совместно с лизосомными маркёрами в сахарозном градиенте (15). У нормальных фибробластов иммунореактивность NPC2 обнаруживается в транс-Гольджи сети, Lamp-1-позитивных эндосомах и Lamp-1-негативныйх периферических органеллах (86). Предполагается потенциальная роль NPC1 в качестве регулятора транспорта NPC2 (86). НЕ1 гомолог свиней соединяется с холестерлом с макромолекулярным сродством (88). Недавно получены доказательства (89) для значительно более высокого сродства связывания и идентифицирован гидрофобный связывающий холестерол карман около аминокислоты К97 (соответствует К116, если считать от инициирующего кодона). В независимом исследовании с кристаллической структурой высокого разрешения телячьего NPC2 эти данные подтверждены и выявлена рыхло упакованная область в белке ниже предполагаемого incipient холестерол-связывающего сайта (90). NPC2 обнаруживает 63% гомологию с Der p 2 dust-mite аллергеном. Хотя кристаллическая структура NPC2 и Der p 2 обнаруживает важные отличия, эти белки определенно составляют семейство для связывания гидрофобных лигандов. Предполагается, что NPC2 нуждается в конформационном изменении для связывания холестерола (90). Три области NPC2 белка считаются важными для функционирования, включая один для эффективной секреции (89).
Всего 11 семей известно с мутациями NPC2, все они обнаруживают заметные аномалии процессинга клеточного холестерола. Ни одна из известных на сегодня мутаций NPC2 не затрагивает какой-либо из 4-х законсервированных доменов, но молекулярные исследования показывают высокие генотип/фенотипические корреляции (15-170. Большинство описанных NPC2 пациентов имеют начинающуюся после рождения тяжелую (часто летальную) респираторную или печеночную форму и/или тяжелую нейрологическую болезнь с гибелью до 4-летнего возраста. Почти все они обнаруживают нонсенс или сдвига рамки мутации, а Е20Х отвечает почти за половину мутантных аллелей. Две сестры с начинающейся в юношестве нейрологической формой и медленным течением имели splice-мутацию, ведущую к множественным транскриптам и менее тяжелой дисфункции белка (16). Два др. родственника с медленно прогрессирующим течением и начинающейся во взрослом возрасте нейрологической формой имели миссенс мутации (17).

Putative function(s) of the NPC1 and NPC2 proteins


Точные функции этих белков не установлены (6,8,19,91). NPC1 компартмент выглядит динамической, стерол-модулирующей сортинг-органелой. NPC1 белок в живых фибробластах показывает, что этот компартмент подвергается быстрым движениям, которые заметно нарушены в NPC1-мутантных клетках. Процесс, участвующий в продукции тубуло-везикулярных структур, который обнаруживает потерю гибкости и медленную скорость движения в мутантных клетках (92,93). Хотя точная схема остаётся неясной и некоторые результаты противоречивы, в целом же всё указывает на роль NPC1 в регуляции или осуществлении ретроградного транспорта множественных лизосомных грузов по позднему эндосомному/лизосомному пути (6,77). Помимо холестерола, гликолипиды также являются кандидатами для транспорта, зависимого от NPC1 (94,95), особенно если учесть. что они вместе с холестеролом и кавеолином, являются компонентами плотиков (raft). NPC1 компартмент обогащён гликолипидами, а интернализация GM2 ганглиозида в эндоцитотические пузырьки, как было установлено, нуждается в функциональном NPC1 белке (95). Показано, что транспорт эндосомы→Гольджи сфинголипидов м.б. блокирован с помощью высоких уровней внутриклеточного холестерола (96). Гомология NPC1 с прокариотическими пермеазами из resistence-nodulation-division (RND) семейства указывает на то, что белок NPC1 является трансмембранным молекулярным насосом, который м. действовать как пермеаза-транспортирующая жирные кислоты через клеточную мембрану (91). Как это согласуется с ролью NPC1 в клеточном перераспределении эндоцитозированного холестерола и гликолипидов, пока неясно (19). Регуляция транспорта субклеточных липидов м.б. фактически более сложной. Имеются строгие доказательства того, что NPC1 и NPC2 белки м. функционировать в тесном взаимодействии, т.к. их мутации не обнаруживают качественных отличий в их способности отвечать на нагрузку экзогенного LDL холестерола и на его тканевые липидные хранилища (12). Роль и NPC1 и NPC2 в регуляции гомеостаза стеролов, как полагают, в генерации из LDL холестерола продуцируемых oxystyerols (55). Недавно (89) подтверждено, что NPC2 специфически соединяется с холестеролом с высоким сродством. Некоторые белки, располагающиеся в эндосомно-лизосомной системе, NPC1, NPC2, MLN 64 и MENTHO (97,98) м. последовательно или альтернативно вовлекаться в перемещения клеточного холестерола (19). Постулируется (19), что активность NPC1 v/ зависеть от предварительного действия NPC2, чтобы ввести стерол в эндосомные/лизосомные мембраны.
Хотя точная причина, вызывающая нейродегенеративный синдром при NPC остаётся неизвестной, но хорошо известно, что дефекты при NPC1 или NPC2 вызывают 'traffic jam' липидов в поздние эндосомы (58). Было показано (99), что внутриклеточный перенос холестерола и гликолипидов в NPC фибробластах м.б. драматически улучшен с помощью избыточной экспрессии Rab7 или Rab9/ Сходные результаты получены и в др. исследовании (100) с Rab9. Хотя эти данные вызывают ряд нерешенных вопросов (101) они м. указывать на новые пути терапии.

Diagnosis


Диагностика NPC легка у пациентов с типичными симптомами, такими как комбинированная спленомагалия, атаксия и вертикальные gaze параличи. Но имеются очень разные клинические проявления, особенно у детей и новорожденных, а нейрологическое начало м.б. задержанным вплоть до созревания или взрослого периода. NPC часто не обнаруживаются в отсутствие органомегалии, нечастой ситуации у детей позднего возраста и взрослых. Нет скрининг-теста с мочой и кровью для диагноза NPC, хотя активность chitotriosidase обычно повышена в 10-20 раз. Активность кислой sphingomyelinase всегада нормальная в лейкоцитах (что позволяет исключить Nieman-Pick И или А) и иногда частично дефицитна в культивируемых фибробластах. Обычно присутсвуют foam клетки и sea-blue histiocyte в костном мозге, но м. и отсутствовать. Если они присутствуют, то foam клетки окрашиваются позитивно folipin. Ультраструктурные исследования биоптатов конюктивы, кожи или печени м. дать строгое подтверждение диагноза, но при биопсии печени возможны ложно-отрицательные результаты (26). Анализ липидов в печеночных биоптатах является не специфическим (102). Картины магнитного резонанса и компьютерной томографии м.б. нормальными или обнаруживать атрофию мозжечка или коры или при тяжелых нейрологических инфантильных формах, изменения белого вещества мозга.
Выявление аномального процессинга клеточного холестерола важно для специфической диагностики NPC1 или NPC2. Процедура нуждается в живых культивируемых клетках, обычно в фибробластах кожи. Убедительная диагностика м.б. достигнута при демонстрации накопления лизосомами неэфиризированного холестерола по интенсивной околядерной флюоресценции после окрашивания filipin (polyene антибиотика, который связывает гидроксильную группу неэфиризированного холестерола, чтобы сформировать флюоресцентный комплекс (Рис. 2) в сочетании с изучением внутриклеточного гомеостаза холестерола, определяемого по ранней скорости (4-6 ч) образования LDL-индуцированного choledteryl ester (66). В обоих тестах клетки сначала культивируются в среде, дефицитной по липопротеину, а затем помещаются в среду обогащённую LDL. Filipin тест, по-видимому, более специфичен (нарушение эфиризации м. происходить и при др. нарушениях) и более чувствителен. Большинство пациентов (80-85%) обнаруживают выраженные аномалии при в filipin тесте и в тесте на эфиризацию (классический фенотип). Остальные (отклоняющиеся фенотипы) обнаруживают умеренное накопление в тесте на filipin при скорости эфиризации от 30 до 80% от номы. Диагностика в этиз случаях трудна. Фибробласты при I-клеточной болезни ведут себя очень сходно с клетками NPC (66).
Сходные тесты м.б. использованы для пренатального обнаружения затронутых плодов, используется обычно культивируемые клетки хориональных ворсинок и клетки амниотической жидкости (103). Если мутация идентифицирована у пробанда, то пренатальная диагностика преимущественно достигается использованием молекулярно генетического тестирования. Некультивируемы хориональные ворсинки позволяют дать быстрый ответ в том числе в семьях с неклассическими формами (104). Свыше 200 беременностей с риском NPC было исследовано по всему миру, в большинстве случаев с помощью обычных биохимических методов. Идентификация мутаций у пробандов позволяла точное генотипирование у его родственников.

Treatment


Не существует специфического лечения для NPC. Трансплантации печени корректируют дисфункцию печени, но не влияют на прогрессирование нейролоической болезни. Определенный успех, достигнутый с помощью трансплантаций печни у npcnih модельных мышей (105), неубедителен. Не выявлено одним из авторов долговременного благоприятного эффекта этой процедуры у пациентов . Сходным образом, трансплантации костного мозга у людей (106) у у животных моделей2 не оказывали существенного влияния на нейрологическое прогрессирование б-ни.
Фармакологические испытания были направлены на 2 мишени: снижение клеточного притока холестерола или снижение притока менее сложных гликолипидов. Изучение диеты с низким содержанием холестерола и варьирующими комбинациями холестерол-снижающих агентов (lovastatin, niacin и cholesteylamine) вызывают заметное снижение накопления в печени неэфиризированного холестерола (107), но не выявляется чётких доказательств успешности терапии при длительном использовании (6,29). Не выявлено успеха подобных диет и у модельных животных (108,109). В связи с дисфункцией головного мозга казалось рациональным использование substrate balance терапии с применением ингибиторов glucosylceramide synthase. У npcnih мышей это не приводило к улучшению (51). С др. стороны, оральное применение N-butyldeoxynojirimycin у npcnih мышей приводило к 20% задержке начала симптомов и увеличению выживаемости (110). Испытания с терапией с помощью N-butyldeoxynojirimycin (OGT 918) проводились для лечение пациентов с типом I Gaucher б-ни (111). Это лекарство (Miglustat, Zavesa) недавно было одобрено Европейским сообществом, Израилем и США. Клинические испытания этого агента проводятся сейчас и с NPC. В др. терапевтическом испытании на мышах использование neurosteroid ALLO, 3α 5α tetrahydroprogesterone задерживало начало и прогрессирование нейрологических симптомов и увеличивало количество клеток Пуркинье (112).
Подобной терапии на людах не проводили. NPC2 белок является растворимым и соединяется с манноза-6-фосфатными рецппторами и его добавление в культуральную среду клеток вызывало корректное клеточное накопление холестерола (15). Стратегии, разрабатываемые для дефицитов по лизосомным энзимам, следовательно, м.б. приложимы и к данному заболеванию. Дополнительные проблемы возникают с NPC1 белком, т.к. он, по-видимому, не секретируется и не замещается. Недавно избирательная избыточная экспрессия NPC1 трансгена в головном мозге npcnih мышей показала устранение как нейродегенерации, так и нейрологической симптоматики у трансгенных животных (113). Исследование подтвердило независимость нейральной и висцеральной патологии и показало, что избыточная экспрессия гена хорошо переносится.
Сайт создан в системе uCoz