RNA interference, local gene knockdown and mouse models
РНК интерференция, локальный нокаут гена и мышиные модели
|
Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Hommel, J. D. et al.
Nature Med. 9, 1539–1544 (2003)
Перевод И.Г. Лильп (lilp@mail.ru) |
RVLM cells Confocal image of cells in the rostral ventrolateral medulla labelled for tyrosine hydroxylase
Рис. |
|
См. также:
| |
Schematic representing the phosphorylation of tyrosine hydroxylase (TOHase) by four protein kinase systems.
Мышиные модели, несомненно, важны для понимания механизмов заболеваний человека. Однако использование трансгенных и нокаутных мышей не дает полного представления о пространственно-временном контроле экспрессии генов. Чтобы избежать этих проблем у млекопитающих авторы рассмотрели возможность использования посттранскрипционного «молчания генов» (gene silencing) – RNA интерференции (РНК вмешательства) (RNA interference – RNAi). Результаты показали, что RNAi-опосредованный нокдаун фермента тирозин гидроксилазы (tyrosine hydroxylase), участвующего в синтезе дофамина, в среднем мозге мышей приводит к фенотипу, напоминающему фенотип пациентов с болезнью Паркинсона (Parkinson's disease), для которой характерна нейродегенерация черной субстанции.
RNAi основана на высококонсервативном защитном механизме, при котором короткие двунитевые фрагменты РНК ферментативно отрезаются от постороннего генетического материала и затем нарушают трансляцию своей оригинальной mRNA. Авторы сконструировали hairpin-shaped (шпилькоподобные) фрагменты RNA, которые специфическим образом поражали уникальные 24-нуклеотидные отрезки mRNA тирозин гидроксилазы. Эти фрагменты коэкспрессировались с зеленым флуоресцентным белком (enhanced green fluorescent protein – EGFP) в аденовирусном векторе, который позже инъецировали в средний мозг мыши.
Через 12 дней после инъекции в черную субстанцию (substantia nigra pars compacta) иммуноокрашивание и обратная полимеразная цепная реакция (real-time reverse transcription-polymerase chain reaction) показали, что экспрессия тирозин гидроксилазы была заметно снижена в инфицированных вирусным вектором дофаминовых нейронах (т.е. нейронов, позитивных по EGFP и dopa-decarboxylase – маркера дофаминовых нейронов). Такое ослабление экспрессии продолжалось, по крайней мере, в течение 50 дней. Уровни тирозин гидроксилазы в областях nucleus accumbens, иннервированных инфицированными нейронами среднего мозга, также были снижены. В то же время в контрольных нейронах, инфицированных вектором, содержащим «зашифрованные» не-тирозин гидроксилаза-специфические короткие фрагменты РНК, сохранялись высокие уровни экспрессии тирозин гидроксилазы.
Важно то, что вмешательство в экспрессию тирозин гидроксилазы коррелировало с редуцированной реакцией на амфетамин и с нарушенными двигательными функциями, которые оценивали во «вращательном» тесте (rotarod test). Фенотип мышей был похож на фенотип моделей болезни Паркинсона, полученных в результате индукции нарушений нейротоксинами. Данные свидетельствуют о том, что утраты дофамина в этой области мозга достаточно для возникновения аномального двигательного поведения.
Таким образом, авторы получили полезную модель для изучения болезни Паркинсона и продемонстрировали возможность использования RNAi для быстрого и эффективного зондирования молекулярных механизмов заболеваний.
| | Click on a photo below for more photos and story... |
