Allergic Asthma
АСТМА
Microarray profile of differentially expressed genes in a monkey model of allergic asthma Jun Zou, Simon Young, Feng Zhu, Ferdous Gheyas, Susan Skeans, Yuntao Wan, Luquan Wang, Wei Ding, Motasim Billah, Terri McClanahan, Robert L Coffman, Robert Egan, Shelby Umland Genome Biology. 2002 3(5): research0020.1-0020.13 http://genomebiology.com/2002/3/5/research/0020
Ингаляция антигена Ascaris suum аллергичными обезьянами вызывает немедленное сужение бронхов и задержку аллергической реакции, включая легочные воспалительные инфильтраты. Для идентификации генов, участвующих в этом процессе гены, экспрессрующиеся в легких аллергичных обезьян, были профилированы с помощью microarrays. Брали легочную ткань спустя 4, 8 или 24 ч. после ингаляции A. suum антигена или спустя 24 ч после введения interleukin-4 (IL-4) . Из приблизительно 40,000 кДНК, представленных в microarray, изменялся уровень экспрессии 169 более чем в 2.5-раз; эти кДНК принадлежат к 149 генам, из которых 2/3 известны. Самое большое количество регулируемых генов обнаруживается спустя 4 ч после ингаляции. Подтверждение дифференциальной экспрессии в исходной ткани получено для 95% из набора этих генов с помощью real-time PCR. Кластерный анализ выявил по крайней мере 5 групп генов с уникальным паттерном экспрессии. Один кластер содержит гены нескольких хемокиновых медиаторов, включая eotaxin, PARC, MCP-1 и MCP-3. Гены, участвующие в ремоделировании ткани и в antioxidant ответе, также идентифицированы, как регулируемые антигеном и IL-4 или только антигеном. (Табл.1) cDNA elements differentially expressed in challenged monkey lungs (Табл.2) Validation of microarray expression levels by RT-PCR in multiple 4-h challenged monkeys (Рис.1.) \| Cluster analysis of 161 genes whose expression in challenged monkey lungs changed >2.5-fold in at least one of the experimental conditions (Рис.2.) \| Comparison of gene-expression level by microarray and RT-PCR (Taqman) (Рис.3.) \| Gene-expression levels in multiple individual monkey lungs determined by RT-PCR (Табл.3) Comparison of microarray versus RT-PCR (Табл.4) Primer and probe sequences used for RT-PCR (Taqman)	Характерным признаком atopic астмы является циркуляция специфических антител IgE, позитивный кожный тест на общие аллергены и инфильтрация слизистой бронхов эозинофилами и Th2 клетками. Возникающее в результате легочное воспаление ведет к сужению бронхов, гиперчувствительности воздушных путей и к безусловному ремоделировани воздушнцх путей. Многие клеточные медиаторы, включая цитокины и хемокины, участвуют в возникновении астмы; Th2-типа цитокины, такие как interleukin-4 (IL-4), IL-5, IL-9 и IL-13 м. вносить вклад в патофизиологические изменения при астме. Сложность астмы происходит от взаимодействия неизвестного числа генов со средовыми факторами. Изучение близнецов показало, что величина конкордантности для астмы значительно выше у монозиготных близнецов, чем у дизиготных и что наследуемость астмы м.б. порядка 75% . Анализ сцепления астмы внутри семей показал, что имеются множественные хромосомные области, содержащие потенциальные гены-кандидаты , ассоциируемые с различными астматическими фенотипами. Microarray технологии открывают новые возможности пролить свет на профили глобальной экспрессии генов при астме и привести к идентификации генов, асстциированных с астмой. Microarrays являются технологией, базирующейся на 'gene-chip', при которой кДНК последовательности, представляющие индивидуальные гены рассеиваются на поверхности стекла с высокой плотностью. Эти последовательности затем гибридизируются с зондами кДНК, полученными от интересующих paired RNA выборок. Два набора зондов кДНК м.б. мечены двумя различными флюоресцентными красителями. Конкурентная гибридизация флюоресцентно меченных зондов пары микромассивов (microarray) позволяет сравнивать относитальные количества транскриптов этого гена в каждой выборке. Таким путем, миакромассивы м. выявлять различные уровни экспрессии одновременно тысяч генов. Кластерный анализ часто используется для анализа данных microarray. При этом методе используются статистические алгоритмы, чтобы ранжировать гены в соответствии со сходством их паттернов экспрессии. Комбинация данных microarray и кластерного анализа создает генетический портрет болезни, это было использовано, напр., при характеристике опухолей груди, чтобы categorize субтипы диффузной large B-cell лимфомы , и чтобы идентифицировать гены, чья экспрессия ассоциирует с нарушениями регуляции митозов и старением у человека. Аллергические cynomolgus обезьяны(Macaca, fascicularis) использовались как модель для изучения воспалительной реакции в легких вследствие воздействи аллергена. Эти обезьяныобладают природной гиперчувствительностью к антигенам нематод Ascaris suum. Ингаляция экстракта A. suum вызывает IgE-обусловленную непосредственную и задержанную аллергческие реакции и приток воспалительных клеток в легие. Возникающие при этом воспаление воздушных путей, эозинофилия и сверхчувствительные сужения бронхов сходны с симптомами и процессами, наблюдаемыми у человека при астме. Изучали профили дифференциальной экспрессии генов в острой фазе аллергической реакции на антеиген Ascaris в легких обезьян. Т.к. цитокин IL-4 является важным воспалительным медиатором приастме, то анализировали также реакию легих обезьян на IL-4. Results and discussion Реакция RT-PCR осуществлялась на базе человеческих последовательностей, которые прикарсно работают с кДНК обезьян. Всего 149 генов были представлены 169 кДНК элементами. Из 149 генов, 52 были ноыыми и 97 уже известными (Табл. 1). Table 1. Спустя 4 ч. после воздействия наблюдалось наивысшее количество подавляемых кДНК элементов (92), тогда как наивысшим числом активируемых кДНК элементов (51) наблюдалось при воздействии IL-4. Наивысшее количество диференциально экспрессируемых кДНК элементов (127) наблюдалось спустя 4 ч после применения аллергена, а самое низшее спустя 18 ч (46 кДНК элементов) или 24 ч (31 кДНК элементов). Второе наивысшее числорегулируемых генов (97) появлялось у обработанных IL-4 обезьян спустя 24 ч. Cluster analysis of microarray data Рис. 1a иллюстрирует результаты кластерного анализа. Все гены со сходным паттерном пространсвенной и временной экспрессии образуют совместный кластер. Чтобы установить паттерн временной экспрессии кластеров использовалиуровни генной экспрессии для генов с известной функцией (Рис. 1b). Один из кластеров, который обладает наибольшим количеством активируемых генов - кластер А (Рис. 1b). 4 ч. спустя после воздействия аллергена гены этого кластера увеличивали уровень своей экспрессии в 2-4 раза по сравнению с нормой. Спустя 18 ч наблюдалось снижение их экспрессии и возвращение к норме происходило примерно спустя 24 ч. Большинство генов этого кластера увеличивает свою экспрессию и на воздествие IL-4. В кластере A is преобладают гены для chemokines и адгезивных молекул, которые участвуют в воспалительной реакции. Более специфичны, MCP-1, MCP-3, eotaxin, pulmonary and activation-related chemokine (PARC) и vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1. Большинство генов в кластере А у IL-4-обработанных обезьян в целом экспрессируются выше нормального уровня. Некоторые из этих генов - те, что для eotaxin, VCAM-1, MCP-1 и MCP-3 - ранее были известны как индуцибельные IL-4 в клетках, имеющих отношение к воспалнию легких. Др. гены кластера A участвуют в ремоделировании ткани (те, что кодируют tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) chitinase или в заживлении ран (tumor-associated antigen L6). В др. microarray исследовании с использованием Incyte UniGEM-V чипа, PAI-1 был идентифицирован как высоко экспрессирующийся индуцибельный ген в поддерживающих клетках человека. Этот ген, как известно, участвует в пути, который контролирует фибрроз и регулирует внеклеточный матрикс во время ремоделировния ткани. Изучение PAI-дефицитных или избыточно экспрессирующих мышей показало, что PAI-1 регулирует количество отложений коллагена в легких. Др. геном кластера А является alpha₁-antichymotrypsin (ACT), член семейства serine proteinase inhibitor (serpin), который ингибирует neutrophil proteinase cathepsin G и chymases поддерживающих клеток и защищает нажнюю часть респираторного тракта от повреждений протеолитическими ферментами. Установлено, что ACT или ген в тесной близости от него на хромосоме 14 является геном asthma-susceptibility у людей, страдающих астмой. Наконец, идентифицировано несколько антиоксидантных генов (Mn superoxide dismutase-1 (SOD-1), SOD-2, glutathione peroxidase (GPx)). Имеются доказательства того, что аксидативный стресс и реактивные виды кислорода м. вносить вклад в воспаление при астме. Паттерн экспрессии генов кластера B напоминает таковой для кластера A. Одним из основных отличий является то, что большинство генов кластера B в основном регулируются с помощью IL-4. Экспрессия генов кластера B также в 2-4 раза спустя 4 ч после воздействия аллергена. Однако, усиление экспрессии гено возвращалось к норме спустя 18 ч. В отличие от трех антиоксидантных генов в кластере А, которые индуцибельны с помощью IL-4, ген glutathione-S-transferase (GST), член кластера B, не регулируется с помощью IL-4. Дополнительными генами, участвующими в ремоделировании, являются в кластере В такие гены как MMP-7 (matrilysin ), thrombospondin и haptoglobin-alpha. Haptoglobin-alpha экспрессируется на высоком уровне в альвеолярных макрофагах и эозинофилах в воспаленной легочной ткани человека. Адгезивная молекула ICAM-1 кластера В повышает свою концентрацию в эпителиии воспаленных дыхательных путей у приматов. Следует отметить, что гены цитокинов, такие как IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13, которые как известно участвуют в аллергическом легочном воспалении, обнаруживаются или в кластере А или В, не обнаружены, т.к. их кДНК последовательности не присутствовали в использованном микромассиве (microarrays). Гены кластера D подавляются в ответ на воздействие аллергена (Рис. 1b). Уровень экспрессии генов этого кластера снижается в пределах от 2.5 раз до 12 раз спустя 4 ч. после воздействия. Изменения нормализуются спустя 18 ч. Наибольшие изменения наблюдались для генов: CCAAT-binding transcription factor-B (NF-YB) (12 раз), SYBL1 (8 раз) и aminopeptidase A (5 раз). Воздействие IL-4 оказывало минимальный ээфект на гены этого кластера. Не установлена их связь в каким-либо одним клеточным путем, они скорее затрагивают множественные процессы. Один из генов, в частности, SLAM, является сигнальной молекулой активации лимфоцитов. Исследования in vitro поляоизованных Th1 и Th2 CD4⁺ T-клеток человека показали, что высокие уровни SLAM обнаруживаются в Th1 клетках. Подавление экспрессии гена SLAM и здесь обнаруживается после воздействия аллергена, который индуцирует Th2 ответ. Кроме того, уровни растворимого SLAM в сыворотке были ниже у пациентов с повыленным уровнем IgE, а низкая продукция SLAM ассоциирует с Th2 ответом in vivo. Кластеры C и E представлены генами, которые регулируются спустя 24 ч после ингаляции IL-4, но не обнаруживают достоверной регуляции воздействием антигена, даже в то же самое время. Кластеры отличаются по генам кластера С, которые усиливают свою активность, и генам кластера Е, которые подавляются с помощью IL-4. Гены для комплемента C3 и IP-10 (IFN-индуцируемый белок в 10 kDa), не-ELR CXC хемокины, находятся среди генов, активность которых усиливается IL-4 в легких обезьян. Как известно IL-4 увеличивает уровни продукции мРНК и белка C3 в A549 клетках, линии легочных эпителиальных клеток. мРНК IP-10, которая индуцируется в различных типах клеток с помощью interferon-γ (IFN-γ), увеличивает свой уровень с помощью IL-4 в клетках стромы костного мозга и кератиноцитах, но не в первичных эпителиальных респираторных клетках или линиях клеток. Усиление активности IP-10 мРНК, обнаруживаемое у обезьян, вызывается ингаляцией IL-4. Необходимы дальнейшие исследования для определения типа клеток и механизма регуляции с помощью IL-4 IP-10 in vivo. Наконец, ингибитор циклин-зависимой киназы p27 активируется с помощью IL-4 в легких обезьян. Белок p27 является негативным регулятором роста cytokine-stimulated T-клеток у мышей. Усиоление активности p27 мРНК с помощью IL-4, выявленое в microarray исследовании, подтверждает, что p27 является IL-4-индуцибельным геном. Необхоимы дальнейшие исследования IL-4-обусловленной регуляции этого и др. генов в каластере А, таких как PAI-1 и TIMP-1, и в кластере E, таких как angiotensin I-converting enzyme (ACE), tyrosine kinase receptor (TEK), и leukemia inhibitory factor receptor (LIF-R), на базе полученных microarray результатов. Validation of microarray gene-expression data Качество данных microarray определяетя проверкой малого субнабора элемнтов кДНК, которые присутствуют дважды или трижды в микромассиве. Каждый из реплицированных кДНК элементов микромассива кодирует разные области одного и того же гена. Следовательно,д.б. сходство их уровней экспрессии. Напр., среди 149 генов, кодируемых 169 кДНК элементами, 9 представлены двумя кДНК элементами и два гена - тремя кДНК элементами. Для 7 из этих 11 генов их множественные кдНК элементы были локализованы в разных микромассивах в общем наборе из 6 использованных микромассивов. Считывания microarray между этими удвоенными и утроенными кДНК элементами были сходными др. сдр., так что стандартные отклонения были в целом ниже 30% средних значений экспрессии для групп 4-, 18-, 24-ч и IL-4-обработанных групп. Более того, все реплицировнные кДНК элементы, кодирующие один и тот же ген, группировались в одном и том же кластере в целом в соседних рядах кластера. Верификация дифференциальной экспресси генов в легких оуществлялась для небоьшого набора известных генов. Во-первых, правильность технологии микромассивов тестировалась с использованием количественной real-time RT-PCR (Taqman). Уровни генной экспрессии RT-PCR нoрмализовались так, что ген энзима hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) экспрессировался как отражение нормального контроля. 20 известных генов были выбраны из 5 кластеров; большинство было из кластера A. Уровни Microarray экспрессии генов сравнивали с теми, что были получены с помощью RT-PCR. Рис. 2 представляет резултаты для 8 из 20 генов. Паттерны экспрессии генов (up- or down-регуляция) были сходными, при сравнении двух методов. Различия обнаруживались лишь при низких уровнях экспрессии. Важно, что направление и степень дифференциальной экспрессии 19 из 20 генов, первоначально выявленные с помощью microarray, подтверждены количественно RT-PCR (Рис. 2, Табл. 2. Таблица 3 сцммирует соотношение уровеней экспрессии генов, представленных в Табл.2 Среди 80 сравниваемых пар 55% данных пар практически идентичны. В остальных 45% отличия парами были 1.5-раза или более при использовани двух методов. Выявлены занчительно меньшие динамические ранги для microarray технологии по сравнению сRT-PCR. Затем подтверждено, что гены, идентифицированные с помощью технологиии микромассивов, действительно регулируются ингаляцией антигена. Для этого подтверждали, что уровни регулируемой экспрессии, выявленные технологией microarray для одного животного, сходны с таковыми при RT-PCR многих животных (4 ч после воздействия антигена)(Табл.1). Репрезентативные гены показаны на Рис.3 а все 20 генов суммированы в Табл.2. 10 из 20 генов обнаруживают достоверные отличия (p < 0.05) от контрольных значений (Табл.2; 8 из 10 генов первоначально идентифицированы с помощью microarray как экспрессирующиеся #&8805; 2.7 раз выше контроля (MCP-3 (400-раз), MCP-1 (14-раз), eotaxin (13-раз), thrombospondin (8-раз), PAI-1 (5-раз), и alpha₁-antichymotrypsin (4-раза)). Оставшиеся два достоверно регулируемых гена (для orphan nuclear hormone receptor BD73 и pepsinogen C) были сначала идентифицированы как подавляемые более чем в 4 раза. Для 10 др. генов, которые не обнаруживают достоверных отличий от контроля, высоко конкордантные результаты получены для microarray и RT-PCR у многократно обработанных обезьян. Среди этих анализируемых генов имеется два из кластера E: для fibronectin и calcitonin gene-related peptide receptor-1 (CGRP-R1). Удивительно, что эти гены не попали в разрыд достоверно регулируемых, т.к. экспрессионный сигнал, управляющий группировкой генов в кластер E, происходит от IL-4, как реакция на воздействие антигена. Итак, оценка показывает, что дифференциальная экспрессия, выявляемая с помощью микромассов, высоко предсказуема (> 80% подтверждений) для RT-PCR и м.б. использована для идентификации генов, регулирующих комплексно in vivo моделируемые болезни. Правда нет точного соответвия болезни у модельных животных и человека. Модели имеют свои преимущества и недостатки. Ингаляци антигена обезьянам вызывает IgE-опосредованное сужение бронхов и воспалительный ответ в легких с притоком эозинофилов. Правда нет доказательств, что используемый антиген будет давть ту же самую аллергическую реакцию у людей. На модели невожножно также изучать хронические аспекты астмы.

Характерным признаком atopic астмы является циркуляция специфических антител IgE, позитивный кожный тест на общие аллергены и инфильтрация слизистой бронхов эозинофилами и Th2 клетками. Возникающее в результате легочное воспаление ведет к сужению бронхов, гиперчувствительности воздушных путей и к безусловному ремоделировани воздушнцх путей. Многие клеточные медиаторы, включая цитокины и хемокины, участвуют в возникновении астмы; Th2-типа цитокины, такие как interleukin-4 (IL-4), IL-5, IL-9 и IL-13 м. вносить вклад в патофизиологические изменения при астме. Сложность астмы происходит от взаимодействия неизвестного числа генов со средовыми факторами. Изучение близнецов показало, что величина конкордантности для астмы значительно выше у монозиготных близнецов, чем у дизиготных и что наследуемость астмы м.б. порядка 75% . Анализ сцепления астмы внутри семей показал, что имеются множественные хромосомные области, содержащие потенциальные гены-кандидаты , ассоциируемые с различными астматическими фенотипами.

Microarray технологии открывают новые возможности пролить свет на профили глобальной экспрессии генов при астме и привести к идентификации генов, асстциированных с астмой. Microarrays являются технологией, базирующейся на 'gene-chip', при которой кДНК последовательности, представляющие индивидуальные гены рассеиваются на поверхности стекла с высокой плотностью. Эти последовательности затем гибридизируются с зондами кДНК, полученными от интересующих paired RNA выборок. Два набора зондов кДНК м.б. мечены двумя различными флюоресцентными красителями. Конкурентная гибридизация флюоресцентно меченных зондов пары микромассивов (microarray) позволяет сравнивать относитальные количества транскриптов этого гена в каждой выборке. Таким путем, миакромассивы м. выявлять различные уровни экспрессии одновременно тысяч генов.

Кластерный анализ часто используется для анализа данных microarray. При этом методе используются статистические алгоритмы, чтобы ранжировать гены в соответствии со сходством их паттернов экспрессии. Комбинация данных microarray и кластерного анализа создает генетический портрет болезни, это было использовано, напр., при характеристике опухолей груди, чтобы categorize субтипы диффузной large B-cell лимфомы , и чтобы идентифицировать гены, чья экспрессия ассоциирует с нарушениями регуляции митозов и старением у человека.

Аллергические cynomolgus обезьяны(Macaca, fascicularis) использовались как модель для изучения воспалительной реакции в легких вследствие воздействи аллергена. Эти обезьяныобладают природной гиперчувствительностью к антигенам нематод Ascaris suum. Ингаляция экстракта A. suum вызывает IgE-обусловленную непосредственную и задержанную аллергческие реакции и приток воспалительных клеток в легие. Возникающие при этом воспаление воздушных путей, эозинофилия и сверхчувствительные сужения бронхов сходны с симптомами и процессами, наблюдаемыми у человека при астме.

Изучали профили дифференциальной экспрессии генов в острой фазе аллергической реакции на антеиген Ascaris в легких обезьян. Т.к. цитокин IL-4 является важным воспалительным медиатором приастме, то анализировали также реакию легих обезьян на IL-4.

Results and discussion

Реакция RT-PCR осуществлялась на базе человеческих последовательностей, которые прикарсно работают с кДНК обезьян.

Всего 149 генов были представлены 169 кДНК элементами. Из 149 генов, 52 были ноыыми и 97 уже известными (Табл. 1). Table 1. Спустя 4 ч. после воздействия наблюдалось наивысшее количество подавляемых кДНК элементов (92), тогда как наивысшим числом активируемых кДНК элементов (51) наблюдалось при воздействии IL-4. Наивысшее количество диференциально экспрессируемых кДНК элементов (127) наблюдалось спустя 4 ч после применения аллергена, а самое низшее спустя 18 ч (46 кДНК элементов) или 24 ч (31 кДНК элементов). Второе наивысшее числорегулируемых генов (97) появлялось у обработанных IL-4 обезьян спустя 24 ч.

Cluster analysis of microarray data

Рис. 1a иллюстрирует результаты кластерного анализа. Все гены со сходным паттерном пространсвенной и временной экспрессии образуют совместный кластер. Чтобы установить паттерн временной экспрессии кластеров использовалиуровни генной экспрессии для генов с известной функцией (Рис. 1b).

Один из кластеров, который обладает наибольшим количеством активируемых генов - кластер А (Рис. 1b). 4 ч. спустя после воздействия аллергена гены этого кластера увеличивали уровень своей экспрессии в 2-4 раза по сравнению с нормой. Спустя 18 ч наблюдалось снижение их экспрессии и возвращение к норме происходило примерно спустя 24 ч. Большинство генов этого кластера увеличивает свою экспрессию и на воздествие IL-4. В кластере A is преобладают гены для chemokines и адгезивных молекул, которые участвуют в воспалительной реакции.

Более специфичны, MCP-1, MCP-3, eotaxin, pulmonary and activation-related chemokine (PARC) и vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1. Большинство генов в кластере А у IL-4-обработанных обезьян в целом экспрессируются выше нормального уровня. Некоторые из этих генов - те, что для eotaxin, VCAM-1, MCP-1 и MCP-3 - ранее были известны как индуцибельные IL-4 в клетках, имеющих отношение к воспалнию легких.

Др. гены кластера A участвуют в ремоделировании ткани (те, что кодируют tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) chitinase или в заживлении ран (tumor-associated antigen L6). В др. microarray исследовании с использованием Incyte UniGEM-V чипа, PAI-1 был идентифицирован как высоко экспрессирующийся индуцибельный ген в поддерживающих клетках человека. Этот ген, как известно, участвует в пути, который контролирует фибрроз и регулирует внеклеточный матрикс во время ремоделировния ткани. Изучение PAI-дефицитных или избыточно экспрессирующих мышей показало, что PAI-1 регулирует количество отложений коллагена в легких. Др. геном кластера А является alpha₁-antichymotrypsin (ACT), член семейства serine proteinase inhibitor (serpin), который ингибирует neutrophil proteinase cathepsin G и chymases поддерживающих клеток и защищает нажнюю часть респираторного тракта от повреждений протеолитическими ферментами. Установлено, что ACT или ген в тесной близости от него на хромосоме 14 является геном asthma-susceptibility у людей, страдающих астмой. Наконец, идентифицировано несколько антиоксидантных генов (Mn superoxide dismutase-1 (SOD-1), SOD-2, glutathione peroxidase (GPx)). Имеются доказательства того, что аксидативный стресс и реактивные виды кислорода м. вносить вклад в воспаление при астме.

Паттерн экспрессии генов кластера B напоминает таковой для кластера A. Одним из основных отличий является то, что большинство генов кластера B в основном регулируются с помощью IL-4. Экспрессия генов кластера B также в 2-4 раза спустя 4 ч после воздействия аллергена. Однако, усиление экспрессии гено возвращалось к норме спустя 18 ч. В отличие от трех антиоксидантных генов в кластере А, которые индуцибельны с помощью IL-4, ген glutathione-S-transferase (GST), член кластера B, не регулируется с помощью IL-4. Дополнительными генами, участвующими в ремоделировании, являются в кластере В такие гены как MMP-7 (matrilysin ), thrombospondin и haptoglobin-alpha. Haptoglobin-alpha экспрессируется на высоком уровне в альвеолярных макрофагах и эозинофилах в воспаленной легочной ткани человека. Адгезивная молекула ICAM-1 кластера В повышает свою концентрацию в эпителиии воспаленных дыхательных путей у приматов.

Следует отметить, что гены цитокинов, такие как IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13, которые как известно участвуют в аллергическом легочном воспалении, обнаруживаются или в кластере А или В, не обнаружены, т.к. их кДНК последовательности не присутствовали в использованном микромассиве (microarrays).

Гены кластера D подавляются в ответ на воздействие аллергена (Рис. 1b). Уровень экспрессии генов этого кластера снижается в пределах от 2.5 раз до 12 раз спустя 4 ч. после воздействия. Изменения нормализуются спустя 18 ч. Наибольшие изменения наблюдались для генов: CCAAT-binding transcription factor-B (NF-YB) (12 раз), SYBL1 (8 раз) и aminopeptidase A (5 раз). Воздействие IL-4 оказывало минимальный ээфект на гены этого кластера. Не установлена их связь в каким-либо одним клеточным путем, они скорее затрагивают множественные процессы. Один из генов, в частности, SLAM, является сигнальной молекулой активации лимфоцитов. Исследования in vitro поляоизованных Th1 и Th2 CD4⁺ T-клеток человека показали, что высокие уровни SLAM обнаруживаются в Th1 клетках. Подавление экспрессии гена SLAM и здесь обнаруживается после воздействия аллергена, который индуцирует Th2 ответ. Кроме того, уровни растворимого SLAM в сыворотке были ниже у пациентов с повыленным уровнем IgE, а низкая продукция SLAM ассоциирует с Th2 ответом in vivo.

Кластеры C и E представлены генами, которые регулируются спустя 24 ч после ингаляции IL-4, но не обнаруживают достоверной регуляции воздействием антигена, даже в то же самое время. Кластеры отличаются по генам кластера С, которые усиливают свою активность, и генам кластера Е, которые подавляются с помощью IL-4. Гены для комплемента C3 и IP-10 (IFN-индуцируемый белок в 10 kDa), не-ELR CXC хемокины, находятся среди генов, активность которых усиливается IL-4 в легких обезьян. Как известно IL-4 увеличивает уровни продукции мРНК и белка C3 в A549 клетках, линии легочных эпителиальных клеток. мРНК IP-10, которая индуцируется в различных типах клеток с помощью interferon-γ (IFN-γ), увеличивает свой уровень с помощью IL-4 в клетках стромы костного мозга и кератиноцитах, но не в первичных эпителиальных респираторных клетках или линиях клеток. Усиление активности IP-10 мРНК, обнаруживаемое у обезьян, вызывается ингаляцией IL-4. Необходимы дальнейшие исследования для определения типа клеток и механизма регуляции с помощью IL-4 IP-10 in vivo. Наконец, ингибитор циклин-зависимой киназы p27 активируется с помощью IL-4 в легких обезьян. Белок p27 является негативным регулятором роста cytokine-stimulated T-клеток у мышей. Усиоление активности p27 мРНК с помощью IL-4, выявленое в microarray исследовании, подтверждает, что p27 является IL-4-индуцибельным геном. Необхоимы дальнейшие исследования IL-4-обусловленной регуляции этого и др. генов в каластере А, таких как PAI-1 и TIMP-1, и в кластере E, таких как angiotensin I-converting enzyme (ACE), tyrosine kinase receptor (TEK), и leukemia inhibitory factor receptor (LIF-R), на базе полученных microarray результатов. Validation of microarray gene-expression data

Качество данных microarray определяетя проверкой малого субнабора элемнтов кДНК, которые присутствуют дважды или трижды в микромассиве. Каждый из реплицированных кДНК элементов микромассива кодирует разные области одного и того же гена. Следовательно,д.б. сходство их уровней экспрессии. Напр., среди 149 генов, кодируемых 169 кДНК элементами, 9 представлены двумя кДНК элементами и два гена - тремя кДНК элементами. Для 7 из этих 11 генов их множественные кдНК элементы были локализованы в разных микромассивах в общем наборе из 6 использованных микромассивов. Считывания microarray между этими удвоенными и утроенными кДНК элементами были сходными др. сдр., так что стандартные отклонения были в целом ниже 30% средних значений экспрессии для групп 4-, 18-, 24-ч и IL-4-обработанных групп. Более того, все реплицировнные кДНК элементы, кодирующие один и тот же ген, группировались в одном и том же кластере в целом в соседних рядах кластера.

Верификация дифференциальной экспресси генов в легких оуществлялась для небоьшого набора известных генов. Во-первых, правильность технологии микромассивов тестировалась с использованием количественной real-time RT-PCR (Taqman). Уровни генной экспрессии RT-PCR нoрмализовались так, что ген энзима hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) экспрессировался как отражение нормального контроля. 20 известных генов были выбраны из 5 кластеров; большинство было из кластера A. Уровни Microarray экспрессии генов сравнивали с теми, что были получены с помощью RT-PCR. Рис. 2 представляет резултаты для 8 из 20 генов. Паттерны экспрессии генов (up- or down-регуляция) были сходными, при сравнении двух методов. Различия обнаруживались лишь при низких уровнях экспрессии. Важно, что направление и степень дифференциальной экспрессии 19 из 20 генов, первоначально выявленные с помощью microarray, подтверждены количественно RT-PCR (Рис. 2, Табл. 2.

Таблица 3 сцммирует соотношение уровеней экспрессии генов, представленных в Табл.2 Среди 80 сравниваемых пар 55% данных пар практически идентичны. В остальных 45% отличия парами были 1.5-раза или более при использовани двух методов. Выявлены занчительно меньшие динамические ранги для microarray технологии по сравнению сRT-PCR.

Затем подтверждено, что гены, идентифицированные с помощью технологиии микромассивов, действительно регулируются ингаляцией антигена. Для этого подтверждали, что уровни регулируемой экспрессии, выявленные технологией microarray для одного животного, сходны с таковыми при RT-PCR многих животных (4 ч после воздействия антигена)(Табл.1). Репрезентативные гены показаны на Рис.3 а все 20 генов суммированы в Табл.2. 10 из 20 генов обнаруживают достоверные отличия (p < 0.05) от контрольных значений (Табл.2; 8 из 10 генов первоначально идентифицированы с помощью microarray как экспрессирующиеся #&8805; 2.7 раз выше контроля (MCP-3 (400-раз), MCP-1 (14-раз), eotaxin (13-раз), thrombospondin (8-раз), PAI-1 (5-раз), и alpha₁-antichymotrypsin (4-раза)). Оставшиеся два достоверно регулируемых гена (для orphan nuclear hormone receptor BD73 и pepsinogen C) были сначала идентифицированы как подавляемые более чем в 4 раза. Для 10 др. генов, которые не обнаруживают достоверных отличий от контроля, высоко конкордантные результаты получены для microarray и RT-PCR у многократно обработанных обезьян. Среди этих анализируемых генов имеется два из кластера E: для fibronectin и calcitonin gene-related peptide receptor-1 (CGRP-R1). Удивительно, что эти гены не попали в разрыд достоверно регулируемых, т.к. экспрессионный сигнал, управляющий группировкой генов в кластер E, происходит от IL-4, как реакция на воздействие антигена.

Итак, оценка показывает, что дифференциальная экспрессия, выявляемая с помощью микромассов, высоко предсказуема (> 80% подтверждений) для RT-PCR и м.б. использована для идентификации генов, регулирующих комплексно in vivo моделируемые болезни.

Правда нет точного соответвия болезни у модельных животных и человека. Модели имеют свои преимущества и недостатки. Ингаляци антигена обезьянам вызывает IgE-опосредованное сужение бронхов и воспалительный ответ в легких с притоком эозинофилов. Правда нет доказательств, что используемый антиген будет давть ту же самую аллергическую реакцию у людей. На модели невожножно также изучать хронические аспекты астмы.

Microarray profile of differentially expressed genes in a monkey model of allergic asthma

Results and discussion

Cluster analysis of microarray data