apo | FH | LDLR | LDLc |

Familial hypercholesterolaemia (FH) аутосомно доминантное генетическое нарушение, затрагивающее одного на 500 человек по всему миру, является результатом любого количества различных мутаций в гене, кодирующем low-density lipoprotein receptor (LDLR). Клинически первичным следствием этого молекулярного дефекта является повышенеи уровней в плазме low-density lipoprotein (LDL) и холестерола. Гетерозиготы, которые наследуют неактивную копию гена LDLR имеют существенно повышенный риск заболевания коронарных артерий. Фенотипически гомозиготы, которые имеют две дефектные копии гена LDLR обнаруживют тяжелый преждевременный атеросклероз. который ведет к гибели от коронарной болезни в очень раннем возрасте. Пациенты с FH характерным образом накапливают отложения LDL cholesterol (LDLc) в сухожилиях, образуя xanthomas (Рис. 1А). Эти повреждения развиваются в течение нескольких перых лет жизни у гомозигот и часто присутствуют уже при рождении

Metabolism of Lipoproteins by the Low-density Lipoprotein Receptor

LDL htwtgnjhsрецепторы тифицированы Brown и Goldstein в их исследовании по генетическим основам FH. Первичным лигандом для рецепторов является LDL, который содержит единственную копию apolipoprotein (apo) B-100. Приблизительно 65–70% холестерола в плазме у людей циркулирует в форме LDL. Др. лигандами для LDLR являются также липопротеиновые частицы, которые содержат множественные копии apoE, такие как β-мигрирующие формы very low-density lipoprotein (VLDL). См. также: Goldstein, Joseph Leonard; Brown, Michael Stuart

Были выявлены рецепторами-опосредуемые пути эндоцитоза, по которым LDL рецепторы переносят липопротеиновые частицы в клетки (Рис. 2). Перед вхождением в клетку рецепторы образуют кластеры рецепторов в специфических сайтах на клеточной поверхности, известных как покрытые клатрином ямки. Последующее вступление рецепторов в клетки через эти покрытые клатрином ямки происходит коституитивно, назависимо от того связаны они или нет с липопротеиныовыми частицами. См. также: Clathrin-coated vesicles and receptor-mediated endocytosis

Как только рецептор-липопротеиновые комплексы вступают в клетку, они поступают в специализированный компартмент клетки, называемый эндосомы. При низком рН среды эндосом рецептор-липопротеиновые комплексы диссоциируют и рецептор возвращается на клеточнубю поверхность в процессе т.наз. рециклинга рецепторов. Вызывающие FH мутации гена, кодирующего LDLR, м. нарушать функцию рецепторов несколькими разными способами, каждый из которых обусловливает клинически выевляемое повышение концентраций в плазме LDL и cholesterol.

Functional domains of the low-density lipoprotein receptor

кДНК LDLR человека кодирует зрелый белок из 839 аминокислот с пятью функциональными доменами (Рис. 3). N-терминальный лиганд-связывающий домен LDLR (остатки 1–292) состоит из семи тандомно повторенных типа A (LDL-A) модулей. Каждый LDL-A модуль примерно в 40 остатков длиной и содержит три дисульфидных мостика (Рис. 3). Эти повторы в 40-остатков обнаруживаются в многочисленных белках, включая рецепторы VLDL, LDL receptor-related белок, компоненты каскада комплементов (C6–C9) и рецепторы клеточной поверхности для вируса саркомы Rous. Делеция любого из LDL-A модулей 3–7 из LDLR влияет на связывание с LDL (который содержит одиночную копию apoB-100). Напротив, делеция только LDL-A модуля 5 не пощзволяет рецептору связывать β-мигрирующие VLDLs (которые в отличие от, LDL, содержат множественные копии apoE). См. также: Complement; Oncogenic viruses

Многочисленные точечные мутации, обнаруженные у пациентов с FH картируются в LDL-A модулях лиганд-связывающего домена рецептора. Биохимические и структурные исследования первого, второго, пятого и шестого из этих модулей пролили свет на то, как одиночная точковая мутация внутри такого модуля вызывает нарушение функции рецептора. Структуры этих модулей установлены с помощью рентгеновской кристаллографии и nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, они выявили компактную архитектуру, обеспечиваемую тремя дисульфидными связями и одиночной связью иона кальция (Рис. 4). См. также: Mutations and the genetic code; Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy of proteins

Кристаллическая структура LDL-A модуля 5 (Рис. 4) показала, что связь иона кальция тонко скоординирована с кластером из четырех кислых остатков, которые являются высоко законсервированными в лигандсвязывающих модулях LDL-A рецепторов LDL и родственных белков. Было установлено, что первичным следствием большинства FH мутаций в LDL-A модуле, которые часто картируются в законсервированных кальций-связывающих остатках или в др. положениях, критических для складывания, мешают складываться корректно в его нативную терехмерную структуру. См. также: Calcium-binding proteins

Соседней с лиганд-связывающим доменом является отдельная область рецептора, которая обладает гомологией с предшественником epidermal growth factor (EGFP; см. Рис. 3). Многие FH мутации появляются также и в этой области рецепторного белка. Этот EGFP домен (остатки 293–693) содержит pH-зависимый switch, который контролирует диссоциацию лиганда в умеренно кислой среде эндосом. Когда домен EGFP делетирован, то лиганды м.б. связанными с рецептором,но они не м. диссоциировать от LDLR в умеренно кислой pH, в результате возникает нарушение рециклинга рецепторов. Финальные три домена белка (остатки 694–839) состоят из: (1) области непосредственно вне плазматической мембраны, которая богата треониновыми и сериновыми остатками и действует как сайт для O-сцепленного гликозилирования; (2) в 22-остатка гидрофобная последовательность, пронизывающая плазменную мембрану; и (3) в 50-остатков цитоплазматический хвост, который управляет эндоцитозом рецепторов в покрытые клатрином ямки. См. также: Tumour antigens recognized by antibodies; Glycosylation and disease

Genetic Basis

FH передается как аутосомно доминантное нарушение с эффектом дозы гена, который, по-видимому, возникает в результате гапло-недостаточности, когда присутствует только один нормальный аллель. Ген LDLR расположен на коротком плече хромосомы 19, он содержит 18 экзонов и в целом 45 kilobases. Идентифицировано более 350 различных мутантных аллелей, которые вызывают FH; список всех известных FH мутаций доступен на LDLR website (см. Further Reading). См. также: Dominant traits and diseases

Детальная характеристика эффектов мутаций FH пролила свет на роль каждого домена LDLR в функции нативного рецептора. Все мутации FH подразделяются на 5 разных классов в зависимости от эффекта мутации на функцию рецептора.

Мутации Class 1 являются нулевыми аллелями, с которых рецепторы не синтезируются вообще. Мутации Class 2 вызывают дефекты внутриклеточного транспорта. Такие рецепторы синтезируются, но не достигают клеточной поверхности. Эти дефекты подразделяются на Classes 2A и 2B в зависимости от того, блокирован ли транспорт полностью (2A) или частично (2B). Мутации Class 3 являются аллелями с дефектами связывания. Эти мутаты, по-видимому, нормально транспортируются на клеточную поверхность, но они неспособны связывать липопротеиновые лиганды. Большинство мутаций класса 3 делетируют целые экзоны из лиганд-связывающего домена. Мутации Class 4 имеют дефекты интернализации. Эти мутации имеют измененные остатки в цитоплазматическом хвосте, который направляет рецепторы для эндоцитоза в покрытые клатрином ямки. Существование этих редких мутаций подтверждает, что хвост рецептора действительно ответственен за эту его функцию. Специфические FH точковые мутации в законсервированном NPxY мотиве устраняют поступление и указывают на то, что эти законсервированные последовательности являются в первуюю очередь ответственными за направление рецепторов в клетки посредством покрытых клатрином ямок. Мутации Class 5 обусловливают дефекты рециклинга рецепторов. Эти мутации кластрируются в домене EGF precursor homology рецептора, который содержит три EGF-подобных модуля и домен YWTD.

Некоторые клинические центры обладют возможностями идентифицировать определенные FH мутации с помощью polymerase chain reaction amplification геномной ДНК, экстрагируемой из плазмы в комбинации с первариванием рестрикционной эндонуклеазой или ДНК секвенированием. Знание специфического типа мутации м. оказаться полезным в формулировании стратегии лечения или генетического консультирования. См. также: Polymerase chain reaction (PCR)

Animal models of familial hypercholesterolaemia

Животные модели, которые воспроизводят FH людей, предоставляют исследователям ценный инструмент для предварительной оценки эффективности будущих терапевтических стратегий. Кролики с Watanabe heritable hyperlipidaemic (WHHL) имеют inframe делецию 12 нуклеотидов в кодирующзей области LDLR. Делеция элиминирует 4 аминокислоты из лиганд-связывающего домена, что делает невозможным рецепторами обусловленное поступление LDL частиц. Кроличья модель очень сильно напоминает FH у людей, т.к. большая часть сывороточного холестерола у normolipidaemic кроликов переносится LDL частицами и WHHL кролики обнаруживают повышенные уровни LDL и умеренную редукцию концентрации HDL точно также как и у пациентов с FH. Т.к. метаболизм липопротеинов у мышей отличается от такового у людей, у них предоминируют HDL в профиле липопротеинов у LDLR нокаутных мышей. В результате мышиные модели, наиболее тесно примыкающие к FH людей, лишены и LDLR и гена, необходимого для процессинга мРНК apoB (гена apobec-1). В результате животные, которые не м. продцировать apoB-48 и вместо этого имеют в основном apoB-100 содержащие липопротеины (т.e. LDL). См. также: Mouse knockouts

Epidemiology

Среди Европейских, Сев. Американских и Японских популяций гетерозиготы по FH появляются с частотой примерно 1 на 500 человек, тогда как гомозиготы или компаундные гетерозиготы притмерно с частотой 1 на 10⁶ индивидов.

Founder populations

В некоторых местах FH превосходят ожидаемое по сравнению с нормальными популяциями, т.к. специфические мутации случайно становятся общераспространенными в популяции. Этот феномен, известный как ‘founder effect’, наблюдается тогда, когда мутантный родоначальный ген размножается среди членов географически или культурно изолированой группы. Если известно, что специфическая популяция обладает определенной мутацией, то м.б. предложен соответствующий скрининг для выявления индивидов и иницииации терапии уже на ранних этапах болезни.

Afrikaner South Africans

FH почти в пять раз чаще у Afrikaners, чем в др. популяциях. Две FH мутации объясняют около 80% от всех случаев в этой популяции. Первая мутация (FH-Afrikaner-1; FH1; class 2B) является missense мутацией (D206E), которая задерживает посттрансляционный процессинг и задерживает транспорт белка на клеточную поверхность. В результате возникает гетерогенная популяция рецепторов, которые достигая клеточной поверхности м.б. активными или неактивными. Муьация FH-Afrikaner-2 (FH2), которая также является одиночной аминокислотной заменой (V408M), вызывает нестабильность белка, в результате он становится неспособным к транспортировке на поверхность клетки и быстро деградирует (class 5).

South African Indians

Одиночная точечная мутация (P664L) объясняет большинство случаев FH среди этой группы людей. Эта мутация располагается в третьем EGF-подобном модуле внутри домена EGFP. Белок P664L подвергается процессингу в Гольджи аномально медленно и обнаруживает повышеннубю скорость деградации (class 2B).

South African Jews

Общераспространенной мутацией в этой популяции является inframe делеция 3-х пар оснований, которая элиминирует glycine-197 в пятом лиганд-связывающем модуле LDLR. Эта мутация ведет к неправильной упаковке пятого модуля лиганд-связывающего домена рецептора а тсследованиях in vitro, наблдается смешанный транспорт и дефект связывания лиганда (class 2B). Превалирование этой мутации особенно высокое в субнаборе пациентов Lithuanian происхождения (8 из 10 случаев). См. также: Protein folding: overview of pathways

French Canadians

Показатель FH гетерозигот в этой популяции варьирует от 1 : 81 до 1 : 154.11 мутаций объясняют 90% всех FH гетерозигот в Quebec. Одной из наиболее распространенных мутаций в этой популяции является та, что обнаруживается у датчан, это открывает интригующую возможность того, что мутация могла быть занесена французским канадцам из Дании.

Finland

Финская популяция очень склонна к эффектам основателя в целом и FH в ней не исключение. Одна мутация обнаруживается у 90% пациентов с FH в Финской провинции North Karelia (FH-NK), это делеция 7 нуклеотидов из экзона 6. Эта делеция вызывает трансляционный сдвиг рамки считывания в результате возникает receptor-negative фенотип (class 1).

Lebanon

Ливанская популяция также обнаруживает превалирование FH. Идентичные мутации у индивидов с FH четко указывают на разное родственное происхождение, как показывает анализ полиморфизма рестрикционных длин фрагментов. Это указывает на то, что имеются горячие точки для этих мутаций, в которых присутствует наследственная восприимчивость к модификациям.

Measurement of Cholesterol

Потребность в реальном и аккуратном измерении уровней хорестерола и LDLc в плазме разработаны благодаря эпидемиологическим данным, который увязали повышенные уровни холестерола и LDLc с болезью коронарных сосудов. National Cholesterol Education Program (NCEP) пригласила две экспертные группы для создания руководства по измерению холестерола, триглицеридов (TGs) и липопротеинов. NCEP Laboratory Standardization Panel сфокусировалась на измерении total cholesterol (TC), а NCEP Working Group on Lipoprotein Measurement на измерении HDL cholesterol (HDLc), LDLc и TGs. См. также: Triacylglycerols

Надежная и униформная для всех клинических лабораторий методика измерения липопротеинов важна по нескольким причинам. Наиболее существенным затруднением было то, что липопротеины являются гетерогенными комплексами, отличющимися по размеру, составу и функции. Следовательно, важным практическим вопросом стало, чтобы измерения м. отслеживаться reference методом и чтобы используемые рутинные методы отличались одинаковой аккуратностью.

Т.к. величины холестерола внутри данной фракции липопротеина легко измерить, то значения липопротеинов обычно описываются в терминах содержания холестерола. На практике, т.к. весь холестерол в кровообращении переносится в виде липопротеиновых частиц, то различные фракции липопротеинов необходимо отделять одну от др., но не от др. компонентов плазмы. Эта часть измерений холестерола была адаптирована из Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Chapter 25 и ссылок в нём.

Measurement of total serum cholesterol levels

CDC reference метод для измерения концентрации общего сывороточного холестерола является colorimetric assay, разработанным Abell и коллегами. Кратко, 0.5-mL aliquot of serum is treated with 5.0 mL alcoholic potassium hydroxide (0.36 mol L^?¹) to hydrolyse the cholesteryl esters. Total cholesterol is then extracted into 10 mL hexane for 15 min. An aliquot of extract is dried under vacuum, and the dry residue is treated with 3.2 mL of Liebermann–Burchard reagent (a mixture of acetic acid, acetic anhydride and sulfuric acid) for colour development. After 30 min, the absorbance of the sample is read at 620 nm in a spectrophotometer, using pure cholesterol as the standard. См. также: Biological macromolecules: UV-visible spectrophotometry

Рутинные измерения TC в сыворотке проводятся в большинстве клинических лабораторий с помощью ферментативного метода, при котором все cholesteryl esters сначала гидролизуются на свободный холестерол с помощью cholesteryl ester hydrolase. Свободный холестерол затем окисляется с помощью cholesterol oxidase в присутствии молекулярного кислорода, чтобы получить перикись водорода. На финальной ферментативной ступени перикись водорода реакитивируется, используя peroxidase, чтобы сформировать окраску, которую м. наблюдать spectrophotometrically. Normally, suppliers provide reagents optimized for use with specific instruments and also provide calibration materials with values traceable to the reference method.

Measurement of serum triglycerides

Т.к. уровни TG используются для непрямого измерения LDLc, то аккуратность измерения концентрации TG является важным компонентом анализа липопротеинов. Т.к. TGs сами по себе являются гетерогенной группой молекул, то измеряется концентрация в сыворотке glycerol остова, общего всем TGs, чтобы определить точно концентрацию TG в molar терминах. Чтобы аппроксимировать уровень TG с mass concentration (traditionally the method of reporting laboratory values at many sites), принимается средняя масса на молекулу TG равная 885.

Рутинные измерения уровней в сыворотке TGs связаны с рядом ферментативных ступеней, что обеспечить окраску, которая м.б. определена колорометрически. Во-первых, TGs гидролизуются, используя липазы для продукции глицерола и свободных жирных кислот. Концентрация глицерола обычно определяется с помощью конверсии в две ферментативные ступени в dihydroxyacetone с одновременной продукцией перикиси водорода. Перикись затем определяется с помощью пероксидазы как показано выше для холестерола.

Measurement of high-density lipoprotein cholesterol

HDL включает липопротеиновые частицы, которые находятся в границах плотности 1.063–1.21 mg dL^-1 HDL имеют два больших субкласса HDL₂ и HDL₃, каждый отличается в терминах lipid и apolipoprotein композиции и каждый способен к дальнейшей субфракцинации.

Уровень HDLc рутинно измеряется определением холестерола в supernatant после преципитации chylomicrons и липопротеинов, содержащих apoB-100 (LDL, IDL, VLDL, lipoprotein (Lp) (a)) непосредственно из плазмы или сыворотки, используя polyanion в присутствии дивалентных катионов. Преципитация завершается в течение 10–15 мин при комнатной температуре. После центрифугирования для удаления преципитата измеряется концентрация HDLc в очищеном супернатанте. Выборки с высокими уровнями TGs (обычно выше 400 mg dL^-1) м.б. предметом ошибки и тогда HDLc д. определяться после удаления TG-богатых липопротеинов с помощьюультрацентрифугирования перед преципитацией оставшихся липопротеинов, содержащих apoB-100. См. также: Ultracentrifuges; Centrifugation techniques

Measurement of low-density lipoprotein cholesterol

По рекомендациям NCEP для терапевтического вмешательства используются уровни LDLc для стратификации пациентов на классы, пока нет reference метода для определения LDLc. LDL частицы не имеют ни уникального мол. в., ни константного содержания холестерола. Хотя частицы варьируют по размеру и составу липидов, каждая частица содержит одиночную молекулу apoB-100.

В общем, измерения LDLc предполагают, что общий холестерол состоит в первую очередь из холестерола, полученного из VLDL, LDL и HDL (т.e. что вклад др. частиц, таких как IDL и Lp(a) ничтожен). Уровень LDLc рутинно подсчитывается на базе первичных измерений тотального холестерола, HDLc и TGs, используя уравнение Friedwald (все конц. приводятся в mg dL^-1):

LDLc = TC ? HDLc ? TG/5

Это уравнение предполагает, что концентрация VLDL cholesterol (VLDLc) составляет приблизительно одну пятую от концентрации TG. На практике это уравнение оказывается менее аккуратным, когда уровни TG превышают 200 mg dL^-1, но работает всё же адекватно, когда уровни TG ниже 400 mg dL^-1, и когда выборки не содержат достоверных количеств chylomicrons.

В лабораториях также определяют уровни LDLc, используя метод называемый ‘? quantification’, который испоьзует препаративное ультацентрифугирование на первой ступени выделения фракции, содержащей и LDL и HDL сыворотки. LDLc затем определяется путем измерения конц. холестерола в этой вборке и вычитания значений HDLc, которые измеряются отдельно после преципитации полианиомами фракции LDLc. Хотя обычно не отмечается, но холестерол, содержащийся в IDL и Lp(a) (атерогенные молекулы, также присутствующие в плазме) является минорным компонентом из тех, которые приписываются LDL в обоих типах выше determinations. Т.о., эти измерения ‘LDLc’ действительно отражают вклад в уровни холестерола плазмы различных атерогенных видов.

NCEP Working Group on Cholesterol Measurement рекомендует, что современные измерения LDLc не нужно корректировать по Lp(a) и IDL, особенно при стартификации на категории риска, которые первоначально использовались при измерении ‘LDLc’, которые включали эти компоненты (или подсчитанные с помощью уравнения Friedwald или определенные с использованием подхода ? quantification). И как результат, прямые методы, которые используютселективную преципитацию LDLc из плазмы, не являются широко используемыми, т.к. не ясно, какие компоненты обычных ‘LDLc’ (которые содержат IDL, Lp(a), и т.д.) также определяются в каждом прямом методе.

Физиологические вариации значений для всех измерений у любого индивида м.б. существенными (приблизительно 5–10% для тотального холестерола и его HDLc и LDLc фракций и более 23% для TGs). Следовательно, измеренные занчения лежат вблизи точки cutoff для разных терапевтических рекомендаций, измерения в сыворотке д. осуществляться, по крайней мере, в паре выборок с недельным интервалом перед назначением лечения.