Посещений:
Гемофилия А

HAEMOPHILIA A: FROM MUTATION ANALYSIS TO NEW THERAPIES
Jochen Graw (graw@gsf.de), Hans-Hermann Brackmann, Johannes Oldenburg, Reinhard Schneppenheim, Michael Spannagl, Rainer Schwaab
Nature Reviews Genetics 6, No 6, P. 488-501 (2005); doi:10.1038/nrg1617
  • Mutations in the X-linked coagulation factor VIII (F8) gene lead to haemophilia A of different grades of severity in humans.
  • Approximately half the severe cases are due to intron-22 inversions. For smaller deletions, insertions or point mutations, the degree of severity depends on the function of the affected domains. Surprisingly, in about 4% of the haemophiliacs no mutation can be found in the coding exons and their flanking sequences.
  • Several hundred missense mutations in the F8 gene have been identified; these are used to understand the function of the various domains of the F8 protein.
  • Many proteins interact with F8 during its transport through cellular compartments, and regulate its activation and inactivation. Mutations in genes that code for these proteins lead to haemophilia-like symptoms (in particular mutations in the VWD, LMAN1 and MCFD2 genes).
  • Because ~2% of haemophiliacs do not carry mutations in the coding regions of the F8 gene, further efforts are needed to analyse the F8 mRNA (and the corresponding cDNA) from its ectopic expression in lymphocytes.
  • Haemophilia A has been a leading model in the field of gene therapy; however, the disappointingly low levels and short time range of F8 expression need to be increased.
  • Current research focuses on increasing the yield of recombinant F8, improving its transport, extending its half-life and reducing its antigenicity.




    • ANTI.IDIOTYPIC ANTIBODIES
    Antibodies that bind to the specific antigen-binding sites of other antibodies.

    CD4+ CELLS
    A subset of white blood cells that identify, attack and destroy infection and cancerous cells.

    CHRONIC SYNOVITIS
    The concurrent non-use of muscles around a joint that is subject to repeated bleeding leads to a periarticular muscular atrophy with loss of dynamic support, which predisposes the joint to further bleeding.

    THROMBOPHILIA
    Abnormal haemostasis parameters, as assessed in the laboratory, that are associated with an increased risk of blood clotting in veins or arteries.

    CERULOPLASMIN
    A plasma metalloprotein that binds most copper ions in the plasma. It is involved in the peroxidation of Fe2+ transferrin to form Fe3+ transferrin. Ceruloplasmin, F5 and F8 have a common evolutionary origin. Loss of ceruloplasmin activity leads to diabetes mellitus, retinal degeneration and dementia.

    ONE.STAGE CLOTTING ASSAY
    Plasma from a patient is mixed with plasma that is known to be deficient in F8, and the time of formation of a fibrin clot is measured. The assay therefore compares the activity of the blood coagulation cascade in the patient’s plasma with the normal activity.

    CHROMOGENIC ASSAY
    Diluted patient plasma is mixed with thrombin, F10 and activated F9 reagents. Activated F9 hydrolyses the chromogenic substrate S–2,765 and releases a chromophore. The colour intensity released by the chromophore is proportional to F8 activity in the sample.

    ALLOANTIBODY
    Usually refers to an antibody that is raised naturally against foreign tissues from a member of the same species; in the case of haemophilia it describes the formation of antibodies against the therapeutic F8 protein. As the recombinant protein is of human origin it should be recognized as ‘self ’, but it is not.

    TRANSAMINASE
    A class of enzymes that causes transamination; that is, the transfer of an amino group. Elevated levels of transminase indicate various hepatic disorders.

    OMENTUM
    A sheet of fat that is covered by peritoneum. The greater omentum is attached to the bottom edge of the stomach and hangs down in front of the intestine. Its other edge is attached to the transverse colon. The lesser omentum is attached to the top edge of the stomach and extends to the lower surface of the liver.

    RANDOMIZED THREE.WAY CROSS.OVER STUDY
    Three groups of patients are formed by the random distribution of probands. Participants in one group receive one intervention for a period of time, then switch over to a second intervention and then to a third intervention (participants in the second group start with the second intervention and switch to the third, then the first, and so on). The result is that all groups will be treated with all three protocols (so, the term ‘cross-over’ is used).

    HAEMOSTASIS
    A balanced interaction of blood cells, vasculature, plasma proteins and low molecular weight substances. Perfect homeostasis means absence of bleeding and of thrombosis.



    Рис.1.      | Principal features of the coagulation factor VIII gene and protein.


    Рис.2.      | Properties and interaction sites of the coagulation factor VIII protein.


    Рис.3.      | Pathological inversions of the coagulation factor VIII gene.


    Box 2 |      |  Crystal structure of mature coagulation factor VIII

    Табл.1 Recurrent mutations in the coagulation factor VIII (F8) gene*

    Табл.2 Mutation profile in 845 families with members who are haemophilia A patients*

    Box 1 | Alloantibodies against the coagulation factor VIII protein
    One of the most severe complications to arise from the treatment of haemophiliacs with isolated coagulation factor VIII (F8) is the development of antibodies against F8 (alloantibodies, also called inhibitors), which neutralize the substituted F8. Three inhibitory mechanisms have been described so far:
  • Binding of anti-F8 antibodies to sites in F8 that interact with other coagulation factors90;
  • The effect of non-neutralizing antibodies on the half-life of transfused F8 protein91;
  • Cleavage of F8 by catalytic antibodies92. This life-threatening situation can be overcome by so-called immune-tolerance therapy, which involves giving patients a large excess of F8 for 1–2 years93.
    • Surprisingly, F8 antibodies have also been detected in healthy individuals and in haemophiliacs that do not have inhibitors. In these cases, inhibitors might be neutralized by ANTI.IDIOTYPIC ANTIBODIES. It is therefore possible that autoimmunity only arises when the equilibrium between F8-neutralizing antibodies and anti-idiotypic antibodies is disrupted94,95. It is also possible that the specific epitope repertoire recognized by CD4+ CELLS is crucial for the synthesis of IgG antibodies directed against F8. CD4+ T-cells have a central role in the humoral immune response to protein antigens and have also been described in normal subjects.

    Box 3 | Gene therapy for haemophilia A

    In vivo therapy
    Using adenoviral systems, five trials have been reported to decrease the severity of haemophilia A in animal models. Among them, the best result was observed in knockout mice, where 150% of normal coagulation factor VIII (F8) expression was observed for more than 9 months96. The highest level of overexpression of F8 was reported in haemophilic dogs (800% of normal expression), although this increase was observed only for 1–2 weeks97. In both cases, an albumin promoter was used to drive hF8.B, a shorter version of the wild-type gene (see main text for details). A recent study that used a cytomegalovirus promoter and the entire F8 cDNA reported 190% of normal F8 expression for approximately 6 months in the canine model98. Similar results have been achieved with adeno-associated viral vectors in mice99.
    For the high-capacity adenoviral vector system, a phase I clinical study with one patient100 led to a transient increase in F8 activity from almost zero to 1% for several months under the control of an albumin promoter. In a similar study, 13 patients suffering from severe haemophilia A were treated systemically in vivo with oncoretroviral vectors encoding hF8.B, the expression of which was driven by the promoter present in the Moloney murine sarcoma virus 5. long-terminal repeat. Around 1% of normal F8 activity was transiently detected in 6 of the 13 patients101; 9 patients had F8 levels higher than 1% on at least 2 occasions, 5 or more days after infusion of exogeneous F8 .REF. 100.. Due to the occurrence of transient unexpected side effects resulting from the high-capacity adenoviral protocol (fever, elevated TRANSAMINASE and a drop in platelet count), both clinical protocols involving patients with severe haemophilia A have been discontinued. Likewise, all clinical in vivo protocols with haemophilia B patients have been stopped.

    Ex vivo therapy
    Two gene-transfer systems can be used — non-viral vectors (using physical or chemical methods to introduce the DNA into target cells) or retroviral systems. In a mouse model, ~500% of normal F8 expression was observed for 4 weeks with a non-viral vector system83. A retrovirus system has also been tested in knockout mice to restore F8 deficiency. Under a Rous sarcoma virus promoter, the hF8.B remained active for more than 22 weeks and resulted in 74% of normal F8 activity102.
    In a clinical phase I trial, a plasmid-borne hF8.B in which the gene was controlled by a human fibronectin promoter was transferred to the skin-derived autologous fibroblasts of 9 patients with severe haemophilia A. Clonal cells were re-implanted into the OMENTUM of 12 patients. A transient rise in F8 activity (0.5–4% of normal) was detectable in some of the patients for a year, without any serious side effects103,104. However, as for in vivo studies, the use of these clinical protocols has been stopped owing to their inefficiency, as has also been the case for haemophilia B patients.
    Haemophilia A является наиболее тяжелой наследственной болезнью кровоточивости у людей среди широко распространенных нарушений этого типа. Её проявления распознавались даже в стародавние времен: впервые оно было упомянуто во втором столетии в Талмуде, где утверждалось, дети по мужской линии не д. подвергаться обрезанию, если два брата уже погибли от этой процедуры. В двенадцатом столетии арабские врачи описали семью, в которой мальчики погибали от кровотечений после минимальных повреждений. Первая семейная история гемофилии, которая тянется в течении трех поколений, описана в 1803 (REF. 1), a слово 'haemophilia' было впервые использовано Hopff в 1828 (REF. 2). В 1952, Aggeler et al.3 and Biggs et al.4 распознали и описали два типа гемофилии: тип A и тип B (последняя обозначается также как Christmas disease; see REF. 5). Оба заболевания являются рецессивными и сцеплены с Х хромосомой. Haemophilia A и haemophilia B вызываются пониженными уровнями факторов каогуляции VIII и IX (F8 и F9), соотв., оба являются членами каскада каогуляции крови. the blood-coagulation cascade.
    Haemophilia A называется также Королевской болезнью, т.к. королева Англии Victoria (1837-1901) была носительницей, от которой она распространилась в королевские семейства Испании, Германии и России. Haemophilia A рассматривается как одна из моделей нарушений в области молекулярной генетики человека, т.к. несколько факторов сделало её ведущей моделью в этой области - сюда входят хорошо описанный фенотип и генетическая основа, включая влияние др. белков на пенетрантность и характеристики болезни (напр., factor V (F5), prothrombin и von Willebrand factor (VWF)), её высокая частота (1 на 5,000 мужчин) и успешность её лечения, используя изолированный F8, который впервые был очищен до гомогенности в 1983 (REF. 6) (хотя, см. BOX 1 об осложнениях, связанных с этой терапией).
    К сожалению, происходящие из крови концентраты F8, которые использовались для внутривенной терапии в 1980s были часто загрязнены human immunodeficiency virus (HIV), что приводило к СПИД у ~40% леченых гемофиликов7 и вызывало гибель большинства из них. Тогда как результаты разработки рекомбинантных F8 концентратов стали обнадеживающими. was strongly encouraged. Последовательности гена, кодирующего F8, (F8) стали известны в 1984, это был самый крупный из описанных к тому времени генов (186 kb)8. Началась терапия с использованием рекомбинантного F8 с 1993. Сегодня проводятся первые клинические испытания терапии соматическими генами гемофилии A. Обзор принципиальных свойств гена F8 и кодируемого им белка дан на FIG. 1.
    Благодаря быстрому увеличению числа семей с диагностированной гемофилией A, информация о патогенетических аллелях F8 и взаимодействующих генах продолжает расти. Сегодня изсестно более 940 уникальных мутаций разных типов, собранных по базой данных по гемофилии со всего мира (HAMSTeRS). Недавно Oldenburg et al.9 описали дальнейшие 845 мутации в гене F8. Доступность такого большого количества аллелей открывает новые пути для понимания функции разных доменов большого F8 белка во многих деталях. Кроме того, пример гемофилии подтверждает общепринятое мнение, что коллекция множества аллельных вариантов облегчит понимание генетического разнообразия, которое лежит в основе наследственного нарушения. Изучение гемофилии также убеждает нас, что моногенные нарушения могут испытывать влияние со стороны мутаций и полиморфизмов др. факторов - в случае гемофилии они влияют на процессинг и функционирование F8 . Учитывая огромное количество информации по гемофилии А, не удивительно, что это нарушение стимулировало разработку подходов в области генной терапии.

    Clinical features


    Haemophilia A обнаруживается у 1 из 5,000 мужчин, показатель который не меняется ощутимо между популяциями. Однако, показатели по всему миру, по-видимому, выше чем этот, т.к. не все затронутые пациенты диагностируются в развитых странах. Это делает гемофилию A одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний. Семейная история известна примерно в 2/3 случаях и в 1/3 она спорадическая.
    У здоровых индивидов F8 циркулирует в плазме в следовых количествах (~100 - 200 ng ml-l; REF. 10). Снижение активности F8 вызывается мутациями, ведущими к потере активности по образованию сгустка, а, следовательно, к беспрепятственным кровотечениям в составы, мышцы или внутренние органы. Повторяющиеся кровотечения в суставы ведут к CHRONIC SYNOVITIS11. В развитых странах геморрагии в ЦНС являются ведущей причиной смерти гемофиликов, составляя почти 20% от неинфекционных смертей.
    В зависимости от остаточной активности мутантного F8, тяжесть болезни у затронутых мужчин варьирует в пределах от средней (5-30% активности; индивиды со значениями на высоком конце этого спектра страдают от subhaemophilia) до выраженно (2-5% активности) до тяжелой (менее 1% активности). Соотв. частоты встречаемости составляют 50%, 10%, и 40%12. Остаточная активность белка F8 у носительниц женщин обычно ~50%. однако, в некоторых случаях активность падает ниже этой отметки во время увеличенных периодов менструации. Гомозиготность у женщин хотя и редка, но также приводит к гемофилии А сходным образом, как и у гемизиготных мужчин.

    Factor VIII interacting proteins


    Interactions in the cell. Биохимические данные предоставляют строгие доказательства, что F8 является компонентом функциональной сети из др. факторов (состоящей в основном из структурных белков и энзимов) и что он часто взаимодействует с ними. Эти взаимодействия влияют на экспрессию F8, транспорт по клетке, активность, стабильность и функцию. Примером белков, участвующих в транспорте F8, являются LMAN1 (lectin, mannosebinding 1; известный также как ERGIC53, endoplasmic reticulum (ER)-Golgi intermediate compartment 53 kDa белок) и MCFD2 (multiple coagulation factor deficiency 2 protein). Оба белка образуют стабильные комплексы с F8 в печеночных клетках. LMAN1 и MCFD2, оба внутриклеточные, формируют комплекс с секреторынм путём клетки и возможно транспортируют вновь синтезированные F5 и F8 из ER в аппарат Гольджи. Дефекты в LMAN1 (REFS 13,14) и MCFD2 (REF. 15) вызывают комбинированный дефицит F5 и F8 (rev. REF. 16).
    Interactions outside the cell - VWF. Как только F8 секретируется из клетки, то некоторые др. белки взаимодействуют с этим белком в крови (FIG. 2; BOX 2). Наиболее важным из них является VWF. Благодаря строгому взаимодействию между F8 и VWF и защитной функции VWF по отношению к F8 против протеолитического действия activated protein C (APC), не удивительно, что мутации, которые затрагивают сайты связывания VWF и F8 др. для др. могут вызывать клинически сходные фенотипы17. Мутации в VWF, которые затрагивают сайт связывания F8 (кодируемый VWF экзонами 18-20), были идентифицированы у пациентов с болезнью von Willebrand (VWD), типа Normandy 2 (обычно обозначаемой как 2N VWD), фенотип которой может быть описан как 'pseudohaemophilia'18. В отличие от haemophilia A, наследование 2N VWD является аутосомно рецессивным. В зависимости от задействованной мутации активность F8 у пациентов с 2N VWD может быть столь же низкой, как и при тяжелой haemophilia A (т.е., ~1% от нормальной активности F8; напр., при редкой VWD мутации Glu787Lys), в пределах от средней до выраженной гемофилии A (как в случае широко распространенных мутаций Thr791Met, Tyr795Cys и Arg816Trp), или в пределах subhaemophilia (которая характерна для Arg854Gln, для наиболее распространенной мутации в 2N VWD19,20).
    Пациенты с 2N VWD неотличимы от пациентов с haemophilia A с помощью обычных клинических тестов. Как результат некоторые индивиды (в особенности женщины) первоначально получают диагноз гемофилии А, но затем определяется, что они не имеют мутаций в F8 и тогда ставится диагноз 2N VWD с помощью F8-связывающего assay и последующего молекулярного тестирования20,21. Т.к. VWF Arg854Gln вариант, который затрагивает VWF:F8 связывание, является столь распространенным аллелем (частота аллеля составляет 1% в датской популяции22), то эта мутация д. рассматриваться как болезнь-модифицирующий фактор для гемофилии А. Мутации которые вызывают 2N VWD представлены в VWF базе данных International Society on Thrombosis and Haemostasis на web сайте.
    Дифференциальная диагностика 2N VWD и haemophilia A в основном базируется на генетическом исследовании для выбора адекватного лечения. Профилактика и терапия пациентов с 2N VWD с использованием современных рекомбинантных F8 концентратов неэффективна из-за отсутствия VWF. Следовательно, лечение пациентов с2N VWD нуждается в использовании производных из плазмы F8 концентратов, которые сожержат также достаточное количество функционального VWF.
    Interactions outside the cell - prothrombotic risk factors. Др. факторы, которые могут влиять на гемофилический фенотип, это prothrombotic факторы риска. Один из них это мутация в гене F5 (F5 Leiden аллель), которая делает активированный F5 белок резистентным к APC благодаря потере APC-cleavage сайта. Эта мутация предрасполагает пациентов к тромбозам. Превалирование F5 Leiden варьирует; однако, гетерозиготность по F5 Leiden мутации признается как имеющая наиболее распространенный наследуемый THROMBOPHILIC дефект в Caucasian популяциях23. Др. мутации затрагивают ген thrombin (Gly20,210Ala мутация, напр., наиболее широко распространена среди Caucasians24) и ген MTHFR (который кодирует 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase25), а также те, которые понижают в плазме концентрации antithrombin, protein C или protein S. Как эти мутации связаны с гемофилией пока неопределенно. В недавнем обзоре26 сделан вывод, что F5 Leiden мутация является фактором, который наиболее согласуется со снижением тяжести тяжелой гемофилии, тогда как вовлечение др. thrombotic факторов не является убедительным. В будущем необходимо установление критериев, которые позволяли бы отличать severe patients at the milder end of the spectrum from those with a more severe phenotype.

    Mutant profiling in haemophilia A


    The F8 gene. F8 человека картирован в наиболее дистальном диске (Xq28) длинного плеча Х хромосомы27,28. Ген в длину 186 kb и состоит из 26экзонов; он кодирует белок предшественник в 2,351 аминокислоты, из которых 19 N-терминальных остатков сигнального пептида удаляются, чтобы дать зрелый, функциональный продукт.
    Интрон 22 из локуса F8 содержит два соседствующих гена F8A (REF 29) и F8B (REF. 30), которые контролируются с помощью двунаправленного промотора. F8A транскрибируется без интронов, в противоположном направлении по отношению гена F8. Недавно, как было показано, ген F8A кодирует в 40-kDa huntingtin-associated protein (названный HAP40 (REF. 31.) и вовлекается, как полагают, в аберрантное расположение в ядре белка huntingtin при болезни Huntington. Функция гена F8B не известна. Т.к. нет эквивалента F8B в геноме мышей, то трансгенные мыши, которые экспрессируют дикого типа человеческий F8B под контролем промотора cytomegalovirus, были использованы для выяснения его функции. Неожиданно такие мыши обнаруживали задержку роста, микроцефалию и тяжелые дефекты глаз, это понуждает исследовать этот белок далее32.
    F8 mutations. 6 интронов гена F8 человека чрезвычайно крупные(более 14 kb); интрон 1 и интрон 22 особенно примечательны, т.к. часто вовлекаются в патологические инверсии, которые возникают в результате рекомбинации с гомологичными регионами вне гена F8. Область, которая гомологична интрону 1 (int1h2) располагается ~140 kb в направлении к теломере; этот 1,041-п.н. повтор отличается только одиночным нуклеотидом от последовательности intron-1 (int1h1) и находится в противоположной ориентации. Внутрихроматидная или внутрихромосомная гомологичная рекомбинация этих двух регионов двет инверсию, которая смещает экзон 1 гена F8 на ~140 kb по направлению к теломере33,34 (FIG. 3a). Эта инверсия вызывает 1-4% из всех тяжелых случаев haemophilia A9,35. Однако, наиболее часто инверсия, затрагивающая F8, касается интрона 22 (32 kb; см FIG. 3b). Эта инверсия, которая ответственна за почти половину случаев тяжелой гемофилии А, возникает из-за того, что имеются две области, гомологичные последовательностям в интроне 22, которые расположены приблизительно на 500 kb ближе к теломере от гена F8 (они названы int22h2 и int22h3; int22h1 - это последовательность в интроне 22, которая включает также и ген F8A)29,36. Идентичность последовательностей этих трех областей составляет 99.9%. Внутрихромосомная гомологичная рекомбинация между int22h1 и одной из двух теломерных копий дает инверсию соответ. частей гена F8. Мужские зародышевые клетки обнаруживают более чем в 10 раз высокую скорость мутаций этого типа, чем женские, в которых это событие рекомбинации ингибируется во время мейоза за счёт гомологичного спаривания Х хромосом37.
    Недавно обновленная база данных HAMSTeRS (in November 2004) содержит более 120 крупных делеций (более 50 п.н.) в качестве причины гемофилии А (они представлют более 90% тяжелых случаев и треть от тех, что ассоциированы с образование anti-F8 антител). Большинство из этих делеций занимает несколько т.п.н., но точные точки разрывов были выявлены лишь в немногих случаях. Недавно38-40 было показано, что рекомбинация, которая обеспечивается за счёт Alu элементов может объяснить такие крупные делеции и что это является общераспространенным механизмом мутаций в гене F8. Было идентифицировано, по крайней мере, 49 регионов, связанных с основной последовательностью Alu в F8 (REF. 39). Напротив, точковые мутации являлись наиболее распространенным типом мутаций в гене F941; в этом случае спонтанные мутации зародышевой линии, которые приводили к гемофилии В, появлялись в основном в CpG динуклеотидах.
    CpG динуклеотиды также часто появляются в гене F8. Высокая частота повторяющихся точковых мутаций (stop и missense мутации) может наблюдаться в этих популяциях, это указывает на то, что имеются др. горячие точки для мутаций в гене F8. 4 из 6 кодонов Arg содержат CpG динуклеотиды, это позволяет объяснить, почему Arg является наиболее часто мутирующей аминокислотой в белке F8. Наиболее часто точковые мутации появляются в кодоне 2,150 экзона 23, где CGT→CAT мутации (каждая превращает Arg в His) описаны 50 раз (HAMSTeRS база данных; TABLE 1).
    Др. типы повторяющихся мутаций представлены делециями и инсерциями одного A нуклеотида в A отрезки в разных позициях гена F8. Самый длинный отрезок состоит из 9A нуклеотидов (в кодонах 1,191-1,194): делеции A описаны 34 раза в этом положении (HAMSTeRS база данных), тогда как инсерции А описаны 12 раз (HAMSTeRS база данных). В обоих случаях мутации приводят к сдвигу рамки считывания во время трансляции т к тяжелой форме гемофилии А. Повторяющиеся инсерции и делеции одиночного А нуклеотида выявлены также в более коротких участках A нуклеотидов. Такие инсерции или делеции, по-видимому, вызывают ошибки пробуксовки (slippage), которые вносятся ДНК полимеразой во время репликации ДНК42. Показано, что такие ошибки появляются наиболее часто в A-T гомо-олигомерах, чем в C-G гомо-олигомерах43. Oldenburg et al.9 опубликовали общие частоты типов мутаций в 845 семьях с гемофилией А; соотв. обзор представлен в TABLE 2.
    Профили мутаций при haemophilia A рутинно определяли по геномной ДНК из клеток крови, которые всё ещё содержали ядро (таких как лейкоциты, лимфоциты и моноциты). Однако. этот подход обычно не может выявить мутации, которые затрагивают сплайсинг. Даже если F8 последовательности обнаруживают, что затронуты высоко законсервированные сайты splice-donor или splice-acceptor, продукт сплайсинга не может быть оценен; т.к. ген F8 экспрессируется в основном в печени, которая является недосягаемой тканью. Поэтому и были предприняты попытки получить мРНК F8 после 'leaky transcription', которая имеет место в лейкоцитах. В некоторых случаях предсказываемые ошибки сплайсинга подтвердились44.
    Как же регулируется экспрессия гена F8? Немногие классические исследования промотора10,45,46 установили, что короткая область от -279 по -64 содержит все необходимые элементы для максимальной активности промотора. В частности, некоторые транскрипционные факторы, такие как hepatocyte nuclear factors 1 and 4 (HNF1 (или TCF1) и HNF4), CCAAT/enhancer-binding proteins (C/EBP) α и β (CEBPA и CEBPB), nuclear factor &кappa;B (NF-&кappa;B) и члены семейства nuclear transcription factor Y (NFY), взаимодействуют с проксимальной частью промотора. Неожиданно, не было идентифицировано мутаций в промоторе, которые бы вызывали понижение или повышение активности F8 и, следовательно, были бы ответственны за гемофилию или противоположные нарушения, thrombophilia (хотя повышение активности F8 очевидный фактор риска для thrombophilia).
    The principal functional domains of the F8 protein. Аминокислотная последовательность F8 человека установлена на основании его кДНК последовательности и согласуется с сиквенс-анализом триптических пептидов47. Домены зрелого белка принадлежат к трем классам, A, B и C: три A домена (A1 - A3; см. FIG. 1D и FIG. 2) гомологичны таковым из др. фактора coagulation, F5, и CERULOPLASMIN. Хотя B домен не обнаруживает существенной гомологии с др. последовательностями, домен С обладает 20% гомологией аминокислот с discoidin lectins из Dictyostelium discoideum. Три более мелких домена (a1, a2 and a3) располагаются между главными доменами A1-A2, A2-B и B-A3, в соотв. последовательности. Большая часть информации о сайтах связывания партнеров по реакции белка F8 получены благодаря немногим missense мутациям, которые ведут к снижению активности F8, но не затрагивают концентрации F8 антигена (эти случаи обозначаются, как 'cross-reactive material positive' или CRM+). Это единственные мутации, для которых можно предположить, что нарушена единственно функция белка F8, но не его структура.
    Mutations that affect the A domains. Исходя из базы данных HAMSTeRS, приблизительно половина точковых мутаций в гене F8 может быть приписана доменам A1 и A2, это демонстрирует важность этих доменов для активности белка F8 и/или что эти области являются высоко чувствительными к мутациям. Более того, мутации в этих регионах меняют, по крайней мере частично, динамику взаимодействия F8 с его реакционными партнерами и, следовательно, ведут к различиям в стабильности активированных форм F8. Эти признаки могут быть выявлены по расхождениям в разных подходах измерения активности F8 (ONE.STAGE CLOTTING ASSAY против CHROMOGENIC ASSAY), каждый из которых измеряет активность разных аспектов функции F8 в каскаде каогуляции. Широко распространенные missense мутации в домене A включают Glu321Lys, Tyr346Cys и Glu720Lys; все остатки, которые затрагиваются этими мутациями расположены или рядом или внутри a1 или a2 acidic области48-50. Др. мутации, которые вносят вклад в наше понимание структурно-функциональных взаимоотношений F8, возникают в сайте расщепления тромбина по Arg372 (Arg372Cys51 и Arg372His52) и Arg1,689 (Arg1,689Cys53-55). Все эти мутации нарушают активацию F8 с помощью thrombin и обнаруживают достоверно более высокие значения F8 в chromogenic подходе, чем при one-stage assay. Это происходит из-за небольших (нормальных) количеств thrombin, присутствующих при one-stage assay, тогда как имеет место избыток thrombin при chromogenic assay. Т.к. chromogenic подход часто используется для для диагностики haemophilia A, то этот тест может не выявлять гемофилию о упациентов, у которых мутации затрагивают активацию F8 тромбином.
    Пациенты с более высокой F8 активностью при one-stage assay по сравнению с chromogenic assay встречаются довольно часто и имеют мутации, расположенные внутри A доменов (примерами м. служить Ala284Glu, Arg527Trp, Arg531His, Ser289Leu, Asn694Ile, Arg698Trp, Arg698Leu, Leu1,932Phe и His1,954Leu56-59). Некоторые мутации затрагивают остатки, которые расположены на обращенных др. к др. сторонах (interface) A доменов (Ala284Glu и Arg531His в A1-A2 interface, Ser289Leu в A1-A3 interface, Asn694Ile, Arg698Trp и Arg698Leu в A2-A3 interface). Эти мутации облегчают диссоциацию субъединицы A2, которая происходит естественным образом и инактивирует белок F856. Между доменами A1 и A2 остатки 351-365, как полагают, включают сайты связывания для coagulation factor X, F10 (REF. 60). Неожиданно, не выявлено мутаций для этой области. Др. петля на A2, включающая остатки 484-508, взаимодействует с активированным F9 protease доменом - большинство мутаций, затрагивающих эту область имеют слабой выраженности последствия. Для двух дальнейших миссенс мутаций в A2 домене (Ile566Thr и Ser558Phe), возможно выяснить механизм, с помощью которого они вызывают haemophilia A. Обе F8 мутантные молекулы обнаруживают понижение специфической активности, возникающее в результате стерических препятствий для взаимодействия с активированным F9; это исследование также подтвердило, что Ile566Thr создает новый N-сцепленный сайт glycosylation61. Только одна мутация, ведущая к тяжелой форме haemophilia A характерна для этой области (Ser488Stop). Можно предположить, что мутации, ведущие к stop кодонам, обусловливают nonsense-mediated распад и, следовательно, только немногие мРНК молекулы могут быть использованы для трансляции62.
    Немногие точковые мутации в A3 домене приводят к тяжелым фенотипам, указщывая тем самым на важность этой области (Ala1,779Pro, Arg1,781Cys, Arg1,781His, Tyr1,783Ser, Ser1,784Tyr и Phe1,785Ser; согласно HAMSTeRS базе данных). Остатки 1,778-1,823 области A3, по-видимому, локализованы на поверхности белка и создают вторичный сайт связывания для F9 (REFS 60,63).
    Mutations that affect the B domain. Расщепление F8 с помощью тромбина по трем сайтам создает активную форму белка F8. Это активирующее расщепление ведет к удалению домена В, который более не нужен для активности F8. Следовательно, missense мутации в домене B могут иметь клиническое значение только, если они затрагивают эти сайты расщепления или соседние тромбин-связывающие сайты. Nonsense мутации в домене B, которые приводят к преждевременному окончанию белка, всегда затрагивают белок F8 в целом и приводят к гемофилии A9. Arg в положении 372 часто затрагивается точковыми мутациями, которые приводят к замещениям или на Pro, His или Cys (17 мутаций этого типа перечислены в списке HAMSTeRS); позиция 1,689, которая важна как сайт расщепления тромбином также обнаруживают высокую частоту мутаций (TABLE 1; помимо Arg→Cys мутаций, упомянутых выше, Arg→His также были описаны несколько раз). Замена на His вызывает лишь легкие формы haemophilia A, тогда как замены на Cys ведут к средней выраженности, а иногда к даже к тяжелым случаям гемофилии возможно из-за неправильного образования дисульфидных мостиков (FIG. 2). Неожиданно не выявлено точковых мутаций, которые бы затрагивали N-терминальный сайт расщепления тромбином аминокислоты 740. Учитывая, что многие мутации не были проанализированы, может сделать вывод, что лишь немногие сайты в В домене имеют функциональное значение. Главная часть этого домена используется как спейсер ('spacer'); это может объяснить также уникальность его последовательности64.
    Mutations that affect the interaction with VWF. Как уже упоминалось выше о взаимодействующих с F8 белках, F8 строго взаимодействует с VWF. Многие mild-moderate формы гемофилии вызываются missense мутациями, которые изменяют связывание F8 с VWF. Эти мутации образуют кластер в C2 домене и что неожиданно также в C1 домене65-67. Более того, один важный сайт связывания VWF находится между аминокислотами Glu1,649 и Arg1,689, с Tyr1,680 также являющимся важным сайтом. Как показано в TABLE 1, эта последняя аминокислота часто подвержена мутациям. is frequently targeted by mutations.
    Mutations that affect the interaction with phospholipids. C2 домен в F8 (аминокислоты 2,173-2,332) важен для взаимодействия с фосфолипидами, но также связывается с VWF. В частности, вовлекаются две пары соседних, solvent-exposed гидрофобных остатка (Met2,199 и Trp2,200, а также Leu2,251 и Leu2,252)63. Более того, исследования с использованием электронной кристаллографии68 (BOX 2) показали, что F8 взаимодействует с фосфолипидами клеточных мембран посредством гидрофобной 'feet', которая образуется боковыми цепочками из Met2,199/Phe2,200, Val2,223, Leu2,251/Leu2,252 and Trp2,313-His2,315, которые проникают в мембранный бислой. Эта идея подтверждается частично анализом мутаций. Однако, missense мутации были описаны только для немногих из этих сайтов (в Val2,223Met и Trp2,313Arg; HAMSTeRS database). Обнаружены также некоторые повторяющиеся мутации в позициях аминокислот 2,209, 2,229 и 2,307 (TABLE 1). По крайней мере, одна в положении 2,307, является частью домена, который участвует в связывании мембраны (аминокислоты 2,303-2,332 (REF. 69)). Недавно сообщалось, что область, которая включает аминоксилоты 2,291-2,330 содержит некоторые универсальные эпитопы для CD4+ клеток. Образование комплекса этой части C2 домена в F8 с o-phospho-L-serine (головной группой phosphatidylserine в богатых phosphatidylserine пузырьках) выявляет не только пониженную общую концентрацию ингибирующих антител, но и также повышенную физическую стабильность F8 (REF. 70). Описано мало мутаций здесь, вызывающих тяжелую haemophilia A (Pro2,300Ser, Gln2,311Pro, Gly2,325Ser и Cys2326Ser; HAMSTeRS database), которые согласуются с гипотезой, что некоторые из этих аминокислот имеют важные функции.
    Mutations that affect domains involved in alloanti-body formation. Образование ALLOANTI-BODIES против эндогенного F8 в основном ограничено пациентами с тяжелыми формами гемофилии; затронуто около 30% пациентов с тяжелой гемофилией А71. Это количество ещё выше, если учитывать только nonsense мутации (35%) или крупные делеции (40%). Nonsense и missense мутации легкой цепи (FIG. 1) ассоциированы с высоким риском формирования ингибитора, чем это происходит в тяжелой цепи. Ошибки сплайсинга являются, по крайней мере, наиболее вероятным типом мутаций для выявления образования ингибитора72. Неожиданно мутации сдвига рамки считывания внутри отрезка из A остатков также дают небольшой риск образования ингибирующих антител, хотя большинство мутаций приводит к образованию преждевременного stop кодона. Это возможно из-за того, что рамка считывания некоторых F8 молекул восстанавливается из-за slippage ошибок РНК полимеразы71.
    В противоположность пациентам с тяжелым проявлением болезни, образование ингибитора у пациентов с легкой или средней степенью гемофилии А редко. Такие пациенты обычно имеют missense мутации, которые вызывают локальные конформационные изменения в иммуногенных доменах белка F873. Важные эпитопы этих ингибирующих антител были идентифицированы в A2 и C2 домене белка F8. В частности, общий ингибирующий эпитоп внутри белка F8 был картирован в остатках 484-509. Антитела к этой области, по-видимому, блокируют функциональное взаимодействие домена A2 с F9. Второй важный эпитоп находится внутри C2 домена (остатки 2,173-2,332). Эта область рассматривалась выше, как участвующая во взаимодействии с VWF и phospholipids. In vitro исследования показали, что остатки в положении 2,199, 2,251 и 2,252 осоебнно важны для образования alloanti-bodies (overview Fay and Jenkins74 ).

    Treatment options for haemophilia A


    Protein substitution therapy. С середины 19-го столетия haemophilia A and B лечили переливаниями крови. Однако, понадобилось столетие, чтобы понять лежащие в основе механизмы и разработать первые cryoprecipitate лчи щенных факторов образования сгустка для терапевтических целей. Плазму необходимо фракционировать для получения lyophilized концентраций clotting factors, для профилактической заместительной терапии. Используются два способа внутривенной заместительной терапии - применение, как только начинается кровотечение (по потребности) или применение для предупреждения кровотечений (профилактика). После инфузии концентрата F8 период полу-жизни белка обычно составляет между 10 и 14 ч63, т.е. те же самые пределы. что и для эндогенного F8. В конце 1980s, стали доступны высоко очищенный F8 из плазмы, а также рекомбинантные F8 продукты. Рекомбинантный F8 стал существенной альтернативой продуктам, производным плазмы, т.к. его разработка существенно повысила доступность F8 для заместительной терапии и снизила риск передачи порождаемых кровью патогенов; это принципиально, т.к. 'второе поколение' рекомбинантных F8 продуктов имеет заметно сниженное содержание альбумина (человеческого или телячьего происхождения75). После 4-х декад использования производных плазмы или рекомбинантных концентратов ситуация лечения пациентов в развитых странах существенно улучшилась. В то время как прошлом мужчины с гемофилией А погибали в молодости, сегодня благодаря успехам в диагностике и разработке надежного и эффективного лечения, пациенты могут вести нормальную жизнь76, по цене приблизительно в 100,000 в год для тяжелых пациентов.
    Помимо высокого вирусного груза, ассоциирующего с факторами, производными плазмы, в последнее время (особенно присутствие HIV и вируса гепатита С) одним из наиболее тяжелых осложнений заместительной терапии является возникновение ингибирующих allo-антител к терапевтическому белку F8, которые появляются у 30% пациентов с тяжелой формой (BOX 1) - картина, которая сходна для всех концентратов факторов , используемых сегодня для лечения haemophilia A. Сегодня эффекты этих антител могут быть преодолены с помощью т.наз. immune-tolerance терапии (BOX 1).
    Gene therapy. Большая часть F8 продуцируется печенью. Однако, для подходов генной терапии, F8 д.б. использованы некоторые др. ткани - включая мышцы, эндотелий или фибробласты, - тогда внешний интактный ген F8 транспортируется в ядра таких клеток. Несмотря на успехи белковой заместительной терапии пациентов с haemophilia A, эта болезнь является идеальной моделью для разработки протокола генной терапии. Во-первых, генная терапия д. экономить пациенту расходы на регулярные профилактические внутривенные вливания (которые необходимы каждые 2-3 дня из-за короткого периода полу-жизни F8). Во-вторых, это д. помочь идентифицировать побочные эффекты протокола генной терапии по сравнению с альтернативным лечением концентратами. Гемофильные животные (нокаутные мыши и гемофильные собаки) также пригодны для тестирования эффективности различных стратегий генной терапии. В-третьих, причиной для разработки генной терапии является то, что этот тип лечения имеет высокие шенсы достижения цели даже при небольшом увеличении активности F8 в крови (~1-2%), что может существенно снизить кровоточивость. Наконец, успешность терапии может быть успешно отслеживаться, используя тест на свертывание крови для измерения активности F8.
    Однако, тот факт, что мРНК F8 является длинной (~9 kb) сдерживает быстрый прогресс в этой области. Это главное препятствие частично преодолено в исследованиях на животных, у которых переносимый ген существенно укорочен удалением большого B домена (укороченная конструкция обозначается как hF8.B). В целом генная терапия может осуществляться двумя способами - in vivo или ex vivo. В случае in vivo терапии модифицированный вирусный вектор переносится непосредственно животным или пациентам. Модифицированная аденовирусная и adeno-ассоциированная вирусная система является вирусной или аденовирусной системой, т.к. они инфицируют клетки, которые или молчат или делятся с низкой скоростью. ПРи ex vivo терапии клетки удаляли из животных или пациентов и стимулировали к делению в культуре. Клетки, в которые ДНК интегрировалась в геном хозяина, изолировали, множили и переносили обратно в организм донора.
    Несмотря на некоторый прогресс в развитии протокола эффективной генотерапии для гемофилии А (BOX 3), по крайней мере, три вопроса остаются нерешенными. Во-первых, необходимо увеличить печально низкие уровни экспрессии F8, которые сегодня удается получить у пациентов. Во-вторых, абсолютно необходимо устранить индуцируемый вирусным вектором онкогенез, который базируется на онко-ретровирусах77 . Наконец, необходима стабильная интеграция терапевтического трансгена в геном, т.к. временная экспрессия в течение нескольких мес. делает необходимыми повторные клинические вмешательства.

    New trends in bioengineering recombinant F8


    Новые линии поисков направлены на преодоление различных ограничений, связанных с экспрессией рекомбинантного F8 для терапевтических целей; осуществляются попытки улучшить неэффективную экспрессию F8, неэффективную укладку первичного продукта трансляции в ER и облегчить транспорт F8 из ER в аппарт Golgi75. Более того, необходимо улучшить функциональную активность и период полу-жизни F8 и снизить его антигенные свойства и иммуногенность.
    Increasing yield. Первым улучшением в этом контексте было увеличение урожая рекомбинантного F8, когда используется hF8.B форма гена F8. Эта область соответствует ~38% кодирующей последовательности и, как обсуждалось выше, используется для улучшения высвобождения терапевтического гена. Терапевтическая эффективность F8 полной длины по сравнению с hF8.B всё ещё спорна. Хотя мета-анализ 13 наблюдений показал, что hF8.B является менее эффективным в предупреждении кровоточивости и что его продукт имеет более короткий период полу-жизни, чем полной длины F8 (REFS 78,79), др. исследование RANDOMIZED THREE. WAY CROSS.OVER STUDY показало, что hF8.B биологически эквивалентен форме полной длины80. Более короткий продукт также, по-видимому, обладает сходными антигенными свойствами по сравнению с геном полной длины в отношении образования ингибитора81.
    Improving transport. Второй подход по улучшению процесса продукции связан с улучшением транспорта F8 из ER в аппарат Golgi. Этот транспорт (secretion efficiency) существенно усиливается (2.3-раза), если консервативная мутация присутствует в домене A1 domain (напр., Phe309Ser): Phe309 в основном затрагивает связывание с высоким сродством F8 с immunoglobulin-binding protein (BIP). Это связывание ингибирует секрецию; , следовательно, секреция нуждается в высоких уровнях АТФ. Мутация Phe в этом положении на Ser или Ala снижает ATФ-зависимость секреции F8и усиливает этот процесс82. Др. путь увеличения секреции - это введение в белок небольшой порции В домена (оптимально 226 аминокислоты с 6 N-сцепленными олигосахаридами), а также модифицированного A1 домена. В этом случае, эффективность секреции увеличивается в 25 раз по сравнению с hF8.B формой83.
    Extending the half-life of F8 Третья линия исследований для увеличения короткого периода полу-жизни F8, котороя обусловливается в основном тем, что активированный тромбином гетеротример является нестабильным и объектом для спонтанного распада его активности. Эта потеря активности может быть приписана диссоциации A2 субъединицы, которая происходит при физиологическом pH. Поэтому один подход для пролонгирования действия F8 связан с ингибированием диссоциации A2. Резистентная к инактивации форма F8 была создана, в ней домен A2 ковалентно сцеплен с легкой цепью, чтобы предупредить его спонтанную диссоциацию84. Более того, missense мутации в сайте инактивации расщепления для APC также вызывают резистентность к дальнейшему протеолизу F8. Недавние преклинические исследования haemophilia A у модельных мышей продемонстрировали, что эта резистентная к инактивации форма F8 обеспечивает более эффективный HAEMOSTASIS, чем рекомбинантный F8 при достоверно более низкой дозе белка85. Нет также указаний на то, что модельные мыши имеют повышенный риск thrombophilia. Др. система вносит Cys остатки в положение 664 и 1,824 в A2 и A3 домене, которые приводят в результате к образованию дисульфидных связей между A2 и A3 доменами, чтобы стабилизировать активированный F8 (REF. 86). Эта определенная форма сохраняет свою активность в 5 раз дольше, чем форма дикого типа. Эти преклинические исследования являются обнадеживающими подходами для существенного увеличения активности F8 и пролонгирования периода полу-жизни у пациентов; она сможет также помочь снизить социальные затраты и частоту внутривенных вливаний пациентам.
    Reducing antigenicity. Существенные усилия предприняты для получения бенее антигенного рекомбинантного F8. Наиболее сложными конструкциями являются человек-свинья гибридные F8 молекулы, в которых последовательности внутри A2, A3, C2, и ap (41-остаток легкой цепи активационного пептида) областей последовательности человека замещены свиными последовательностями87. Т.к. при альтернативном воздействии пептиды, которые присутствуют или воспроизводят эпитопы, будут полностью связывать F8 антитела и тем самым повышать уровень F8, доступный для коагуляционного каскада; предварительные результаты экспериментов на F8-нокаутных мышах указывают на то, что это открывает новый путь 88,89.

    Conclusions


    Worldwide mutation analysis of haemophilia-A patients has revealed the underlying mutation in a large variety of cases; more than 940 are summarized in a public database. Approximately half the severe cases are caused by inversions between genes located within intron 22 of the F8 gene and sequences outside the gene. For smaller deletions, insertions or point mutations, the degree of severity depends on the function of the affected domains. Surprisingly, in about 4% of the haemophiliacs no mutation could be found in the coding exons and their flanking sequences. Therapy is based on blood-derived or recombinant F8 concentrates, which have a short half-life. Therefore, it might be helpful to look for the reason for elevated or prolonged F8 activity in thrombophilic patients to identify not only the underlying mutations, but also to learn from nature about how F8 activity can be enhanced. This will be helpful not only to improve significantly the use of recombinant F8 concentrates, but also to allow the rather optimistic hopes for gene therapy in haemophilia A to be realized. Because of the tremendous knowledge of the physiology and biochemistry of the disorder and its molecular basis, and owing to the long-lasting experience in its successful treatment by recombinant replacement therapy and the first steps in gene therapy that are described above, haemophilia A is a leading model for many other monogenic disorders. Moreover, because it is a part of the complex network of homeostasis, it is also an excellent example how alterations in a single gene can be modulated by changes in its interaction partners.
    Сайт создан в системе uCoz