В настоящее время генетически сконструированные линии мышей все шире используются для изучения генетических основ глухоты у человека. Сейчас доступно множество нокаутов с нарушениями слухового и вестибулярного аппаратов, что позволяет изучать онтогенез, морфогенез и функции внутреннего уха млекопитающих. Фенотипические характеристики этих животных являются ярким свидетельством того, что отоцист похож на мозаику, в которой разные структурные компоненты находятся под независимым генетическим контролем в отношении их спецификации и/или морфогенеза. Создание нокаутов с эффектами мутаций, ограниченными специфическими стадиями развития и/или клеточными типами, а также развитие knock-in-models, с помощью которых нормальные гены замещаются мутантными аллелями в точности имитирующими аллели глухоты человека, без сомнения будет способствовать пониманию молекулярных механизмов, участвующих в каскаде развития внутреннего уха. Такие генетические подходы помогут расшифровать причины врожденных форм глухоты у человека и разработать новые методы лечения потери слуха.

В работе представлен каталог мышиных нокаутов с морфогенетическими нарушениями внутреннего уха и аномалиями слуха, являющимися результатом удаления генов, экспрессирующихся во внутреннем ухе и/или в прилегающих к нему тканях, таких как задний мозг, нервный гребень и мезенхима.

IHCs | OHCs | RA |

У млекопитающих внутреннее ухо происходит из слуховой плакоды (otic placode), которая, в свою очередь, происходит из утолщенной области поверхностной эктодермы, прилегающей к заднему мозгу (hindbrain). Во время эмбрионального развития слуховая плакода инвагинирует, чтобы сформировалась чашеподобная структура, которая позже образует сферический эпителиальный пузырек – отоцист или слуховой пузырек. В результате ряда морфогенетических изменений из отоциста образуется несколько сенсорных структур: улитка (cochlea), воспринимающая аудиторные стимулы; отолитные (otolith) органы – сферический мешочек (saccule) и перепончатый мешочек ушного лабиринта или маточка (utricle), и связанные с ними сенсорные области (maculae), которые воспринимают земную гравитацию и линейное ускорение; три полукруглых канала, ориентированных перпендикулярно друг к другу и связанные с ними сенсорные области (cristae – гребешки), воспринимающие угловое ускорение. Сферический мешочек, маточка и полусферические (полукруглые) каналы вместе составляют преддверие внутреннего уха. А преддверие и улитка совместно формируют мембранный лабиринт (BOX 1).

BOX 1. Development of the vertebrate ear
The vertebrate ear develops from a complex convergence of tissues from all three germ layers as well as the neural crest. A major contribution to the outer ear is made from the first and second branchial arches, which include arch ectoderm and mesoderm. Figure la shows a lateral view of a developing vertebrate embryo and Fig. Ib shows sections through the ear and how it develops over time (left to right). The epithelium that overlies the arches is derived from head ectoderm (violet). The mesenchymal tissue of each branchial prch consists of a small core of cells (not shown) derived from paraxial mesoderm (red) surrounded by a larger population of cells derived from the neural crest (orange). The middle ear is formed from cells arising from either the neural crest or paraxial mesoderm that initially migrated to the branchial arches and then coalesced to form the middle-ear elements. It also contains a significant contribution from the endoderm (green), as it is lined by mucosal tissue that expands into the middle ear from the oral cavity (embryologically this is derived from the first pharyngeal pouch) and is innervated by cranial nerve IX in the same way as the oral mucosa. The epithelial tissues and neurons of the inner ear are formed almost exclusively of placodal ectoderm, which invaginates to form the otocyst. A relatively small contribution made to the inner ear by the neural crest gives rise to the melanocytes of the stria vascularis in the cochlea, the Schwann cells of the statoacoustic ganglion and other mesenchymal tissues (not shown). A cartilaginous capsule that eventually ossifies into bone surrounds the epithelial core of the inner ear. Most of the otic capsule is derived from paraxial mesoderm, and forms through epithelial-mesenchymal interactions with the membranous labyrinth that it surrounds and protects. There is also a minor contribution of neural crest to the otic capsule (not shown), at least in birds [a]. Abbreviations: 1-7, rhombomeres 1-7; I-IV, branchial arches I-IV; earn, external auditory meatus; ed, endolymphatic duct; es, endolymphatic sac; i, incus; m, malleus; ow, oval window; s, stapes; SAG, statoacoustic ganglion; sec, semicircular canals; sg, spiral ganglion; st, stapedius muscle; tm, tympanic membrane; tt, tensor tympani muscle; tr, tympanic ring; vg, vestibular ganglion. Reproduced from Ref. [b].

References
a Couly, G.F. et al. (1993) The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Development 117,409-429
b Fekete, D.M. (1999) Development of the vertebrate ear: insights from knockouts and mutants. Trends Neurosci. 22, 263-269

Сенсорный нейроэпителий этих органов состоит их механорецепторных волосковых клеток, опорных клеток и нервных окончаний. Онтогенез сенсорных органов внутреннего уха представлен в обзорах Fritzsch B. et al. (1998), Morsli H. et al. (1998) и Torres M. et al. (1998). Анатомические изменения, происходящие во время онтогенеза внутреннего уха с 10,75 дня после коитуса до 1 дня постнатального развития (Р1) показаны на РИС. 1.

Fig. 1. Lateral views of paint-filled membranous labyrinths. Membranous labyrinths of mouse inner ears from 10.75 days post-coitus (dpc) to postnatal day 1 (P1) were filled with latex paint solution as described in [2]. At 10.75 dpc, the protrusions of the endolymphatic duct in the dorsal and the cochlear aniage in the ventral portion of the otocyst are evident. By 17 dpc, the gross anatomy of the inner ear is mature. Arrowheads identify the proximal region of the cochlea, aa, anterior ampulla; asc, anterior semicircular canal; co, cochlea; csd, cochleosaccular duct; ed, endolymphatic duct; es, endolymphatic sac; la, lateral ampulla; Isc, lateral semicircular canal; pa, posterior ampulla; psc, posterior semicircular canal; s, saccule; u, utricle; usd, utriculosaccular duct. Orientation: D, dorsal; A, anterior. Scale bar: 100 |am. Adapted with permission from Ref. [2] ©1998, the Society for Neuroscience.

Благодаря большому сходству слуховых систем у человека и мыши, анализ мышиных мутантов с вестибулярными и слуховыми нарушениями дает возможность получить ценные сведения об онтогенезе, морфогенезе и функциях внутреннего уха млекопитающих, а также идентифицировать гены-кандидаты, вызывающие глухоту у человека. Спонтанные мутации мышей с дефектами слуха представлены в обзорах Steel R. and Kros C. (2001), Holme R. and Steel R. (2001), Steel et al. (2002) и др. Кроме того, с помощью N-этил-N-нитрозомочевина (ENU) –индуцированного мутагенеза были выявлены гены, участвующие в развитии дефектов органов слуха и равновесия (Justice M., 1999; Munroe M et al. 2000). В настоящее время получено множество модифицированных с помощью генного таргетирования мышиных нокаутных линий, успешно использующиеся для выявления механизмов наследственной глухоты человека (Petit C. et al. 2001, Ahituv N. 2000 и др.).

Главная цель данного обзора – представить исчерпывающий каталог мышиных нокаутов с нарушениями развития внутреннего уха и с дефицитом слуха, полученных в результате селективного удаления генов, паттернирующих внутреннее ухо. Так как нормальное развитие внутреннего уха зависит от нескольких окружающих его тканей (заднего мозга, нервного гребня и мезенхимы), то оказалось, что некоторые недавно идентифицированные генные продукты, участвующие в сегментации заднего мозга, тканевых взаимодействиях, внеклеточном матриксе, регуляции клеточного цикла, апоптозе во время развития и метаболических процессах, прямо или косвенно нарушают слуховые и вестибулярные функции.

В обзоре автор подробно описывает фенотипы, появившиеся после таргетированного разрушения мышиных генов, экспрессирующихся во внутреннем ухе и/ или в окружающих его тканях. Спонтанные мутации и химически индуцированные null-аллели, поражающие слуховые и вестибулярные функции, не включены в данную статью, за исключением небольшого числа спонтанных мутаций, на которые автор ссылается в особых случаях.

Генные нарушения, поражающие развитие и функции внутреннего уха

Учитывая перекрывание в паттерне экспрессии и действии генов, паттернирующих внутреннее ухо, неудивительно, что одиночные null-мутации обычно приводят к незначительным изменениям фенотипа со сниженной пенетрантностью и/или вариабельной экспрессивностью признака, а не к выраженным морфологическим изменениям. Автор сфокусировал свое внимание на дефектах внутреннего уха, являющихся результатом разрушения одного или нескольких генов. Описание фенотипов таких животных изначально основывалось на пораженных структурных или клеточных компонентах и/или на физиологических процессах, хотя явно просматривалась и определенная степень пересечения с другими пораженными органами.

Табл.1. | Гены, связанные с нарушениями внутреннего уха у мышей

В ТАБЛ.1 представлен алфавитный перечень этих мышиных генов, сопровождаемый TBASE номерами, библиографические ссылки и родственные заболевания человека. Некоторые данные также можно найти на сайтах:

http://tbase.jax.org

http://www.tbase.jax.org/research/hhim

http://www.ihr.mrc.ac.uk./MutantsTable.shtml

http://dnalab-www.uia.ac.be/dnalab/hhh

Развитие внутреннего уха: морфогенетическое паттернирование

Сегментация заднего мозга и идентичность ромбомеров

Недавнее loss-of-function исследование выявило новые роли генов, контролирующих сегментацию заднего мозга и идентичность ромбомеров (особенно ромбомеров r5 и r6), а также генов, экспрессирующихся в клетках нервного гребня и жаберных дугах во время развития внутреннего уха. Ни одна из этих тканей не поставляет клетки непосредственно во внутреннее ухо, за исключением меланоцитов, происходящих из нервного гребня, и шванновских клеток. Тем не менее, считали, что индуктивные сигналы, исходящие из ромбовидного мозга важны для ранней индукции слуховой плакоды и последующей дифференцировки отоцист. Для иллюстрации приводится ген Hoxa 1 (homeobox A1). Он никогда не экспрессируется в отоцисте, но экспрессируется в ромбовидном мозге, соседствующим с отоцистом. Однако у Hoxa 1-null мышей полностью отсутствует нормальный морфогенез эндолимфатического лабиринта, что приводит к полному разрушению вестибулярного и кохлеарного компонентов. Эти пороки развития вариабельны и могут быть компенсированы единственной инъекцией в организм матери субтератогенной дозы витамина А, метаболита ретиноевой кислоты (retinoic acid – RA). Реорганизация заднего мозга характеризуется завершенным или квази-завершенным отсутствием r5 и тяжелым редуцированием в r4. Это подтверждает роль в поддержании и/или образовании сегментов заднего мозга, а не в детерминации их судьбы. И, напротив, Hoxb 1 (гомеобокс В1) оказался критичным в специфической идентичности для r4 клеток. При комбинировании с loss-of-function мутацией в Hoxb 1, Hoxa 1-null/Hoxb 1(3RARE) мутантный фенотип полностью пенетрантен и демонстрирует более выраженные молекулярные изменения в области r4-r6 и во второй фарингеальной дуге клеток нервного гребня, отсутствие улитки, аплазию вестибулярного аппарата, и полное отсутствие фенестрации в мутантном ухе ( РИС.2). Это указывает на то, что продукты Hoxa 1 и функции Hoxb 1 синергически влияют на развитие внутреннего уха. И, наконец, инактивация Hoxa2 (гомеобокс А2) ведет к нарушениям дорсального паттернирования r2-r3 с сопутствующей утратой кохлеарного ядра и расширением латеральной части мозжечка (РИС.2).

Fig.2 Mutations that alter morphology of the inner ear, its sensory organs or the statoacoustic ganglion neurons. All genes listed represent homozygous null mutants unless otherwise indicated. Structures reported to be altered (including hypomorphisms and missing elements) are indicated in black. Full penetrance of the phenotypes can vary between individual knockout mice, between the strains of mice and for different mutant alleles. The most severe phenotypes reported are indicated here. Note the structures that are not shown in black are not necessarily entirely normal, as they might not have been studied in sufficient detail to rule out subtle defects. Abbreviations: asc, anterior semicircular canal; c, crista; cc, common crus; ed, endolymphatic duct; es, endolymphatic sac; hsc, horizontal semicircular canal; oC, organ of Corti; psc, posterior semicircular canal; s, stapes; sg, spiral ganglion; sm, saccular macula; u, utricle; um, utricular macula; vg, vestibular ganglion. Reproduced from Ref. [16].

Хотя RA рецепторы активно синтезируются во внутреннем ухе и в мозге, врожденные пороки внутреннего уха не проявляются до тех пор, пока не удалено более двух рецепторов, что подтверждается компаундом null мутантов. При изучении Rara/Rarb двойных нокаутов с отсутствием RA рецепторов α и β на ранних стадиях эмбрионального развития (Е8.5-Е10.5) были выявлены дефекты постотических фарингеальных дуг (post-otic pharyngeal arches) и полностью пенетрантная дезорганизация постотических краниальных нервов (post-otic cranial nerves), которые не выявлялись у одиночных нокаутов. Никаких изменений в числе клеток и миграторных путях клеток нервного гребня в фарингеальных дугах не наблюдали. Следует заметить, что первичное формирование третьих и четвертых жаберных мешков (pouches) и третьих, четвертых, шестых артериальных дуг (формирование которых не зависит от нервного гребня) также было нарушено. Более того, r5 оказался увеличенным, вероятно, из-за индукции избыточного числа отоцист, тогда как граница r5-r6 утрачена.

Таким образом, RA сигнализирование играет важную роль в паттернировании пост-отического заднего мозга и каудальных жаберных дуг. Избыточность отоцист также определяется у эмбрионов с отсутствием как Rxra, так и Rxrb (ретиноидные X рецепторы α и β), что свидетельствует о важной роли RA-активированных RXR/RAR гетеродимеров в детерминации слуховой плакоды из эктодермы. К удивлению, предполагаемые отогенные сигналы, исходящие из нервной трубки после формирования отоцист, скорее всего являются неэффективными, т.к. Е14.5 и Е18.5 Rara/Rarb-null мыши имеют нормальное внутреннее ухо. В то же время Rara/Rarg двойные нокауты с отсутствием RA рецепторов α и γ характеризуются гипопластичным отоцистом на Е10.5 и полным отсутствием кортиева органа (organ of Corti) и кортиева ганглия (spiral ganglion) на Е18.5 (Рис.2). И, наконец, Aldh1a2 (семейство 1 альдегид дегидрогеназы, подсемейство А2; его также называют Raldh2), чей продукт участвует в ферментативном образовании RA, имеет ограниченный паттерн экспрессии во время онтогенеза внутреннего уха. Его отсутствие ведет к летальности плода на средних стадиях развития, аномальной r3 и r4 идентичности клеток каудального заднего мозга и аномально далеко расположенным от нейроэпителия заднего мозга отоцистам, которые остаются гипопластичными, даже после введения в организм матери RA.

Морфогенез улитки и вестибулярного аппарата

Генезис улитки и вестибулярного аппарата требует пространственно-временной экспрессии нескольких паттернирующих генов в слуховом эпителии. Классическим паттернирующим геном является Pax2 (paired box gene 2), экспрессия которого ограничивается вентральной половиной развивающегося отоциста, из которой происходят кохлеарная и мешотчатая (saccular) области. Инактивация Pax2 ведет к агенезу улитки и кортиева ганглия, тогда как вестибулярные и саккулярные структуры развиваются нормально. В результате ни один из клеточных типов кортиева органа нельзя идентифицировать, а кохлеарная иннервация снижена (Рис.2).

Тяжелые аномалии развития улитки и вестибулярного аппарата наблюдали у Foxi1 (его также называют Fkhl0) нокаутов с отсутствием forkhead boxI1 – члена forkhead семейства winged helix транскрипционных регуляторов, экспрессирующихся в отоцисте исключительно на Е9.5. Эти структуры замещаются единой непрерывной полостью, в которой нельзя распознать ни полукруглых каналов, ни улитки. Такие мутанты характеризуются глухотой и circling поведением (вращательными движениями), они плохо плавают и имеют аномальные реакции, связанные с дисфункциями вестибулярного аппарата. Предполагают, что Foxi1 может быть ранним регулятором, необходимым для нормального развития улитки и вестибулярного аппарата, а его гомолог человека FOXI1, возможно, можно рассматривать как ген-кандидат, вызывающий глухоту у человека (локализован на хромосоме 5q34). Недавние исследования показали, что Foxi1 может играть роль в жидкостном гомеостазе внутреннего уха, регулируя Slc26a4-кодированный продукт пендрин (pendrin).

Eya1-дефицитные гомозиготы имеют тяжелые аномалии внутреннего, среднего и наружного уха, а также двусторонний почечный агенез, вызванный дефектными индуктивными тканевыми взаимодействиями и апоптозным регрессом примордиального (зачаточного) органа. Развитие внутреннего уха прекращается на стадии отоциста, а все компоненты внутреннего уха и специфических черепных сенсорных ганглиев не формируются. Фацио-акустический ганглий (VII-VIII) у них отсутствует, а эндолимфатический проток не функционирует или утрачен. Eya1- гетерозиготы имеют почечные аномалии и потерю слуха, сходные с branchio-oto-renal (BOR) синдромом человека [http://www.ncbi.hlm.nih.gov/Omim/]OMIM: 113650), типичными признаками которого являются черепно-лицевые аномалии и утрата слуха.

Как и при Eya1 нокауте, утрата Tcfap2a (транскрипционный фактор АР-2 α) ведет к анэнцефалии, отсутствию вентральных черепно-лицевых структур, включая ухо, и вариабельные морфологические нарушения ганглиозного комплекса VII-VIII.

Таргетированные делеции генов «ростовой фактор/рецептор» также влияют на паттернирование внутреннего уха. Например, трансформирующий ростовой фактор β2 (TGFB2) mRNA был локализован в эпителии развивающейся улитки и в подлежащей мезенхиме. На стадии Е18.5 у всех Tgfb2-null мышей отсутствовало мезенхимальное уплотнение в spiral limbus и дифференцировка вышележащих интердентальных клеток. В сочетании с неполным канализированием scala vestibule, эти находки подтверждают, что Tgfb2 играет важную паракринную роль в эпителиальной и мезенхимальной дифференцировке и паттернировании во внутреннем ухе.

Кроме того, функциональные нарушения Fgf3 (фактор роста фибробластов 3), который в норме экспрессируется в заднем мозге вблизи будущего уха в r5 и r6, меняют завиток (coiling) уха (Рис.2) и редуцируют число клеток кортиева ганглия. Пороки развития внутреннего уха у Fgf3 нокаутов имеют сниженную пенетрантность и вариабельную экспрессивность и сходны с пороками, наблюдаемыми у kreisler мышей, включая отсутствие развития эндолимфатического отростка (Рис.2).

Очевидно, что необходимым условием для выявления FGF3 функции во внутреннем ухе является характеристика его рецепторов и предполагаемых FGF компенсаторных сигналов, которые частично могут определять пенетрантный фенотип.

Экспрессия Fgfr3 (рецептор фактора роста фибробластов 3) определялась в дифференцирующихся волосковых клетках и подлежащих опорных клетках. Fgfr3-null мыши характеризуются глухотой и дефектом развития Кортиева органа, включая нарушение дифференцировки pillar клеток и полное отсутствие трехстороннего, заполненного жидкостью, пространства, которое в норме обнаруживается между внутренними и внешними рядами опорных столбчатых клеток (supporting pillar cells), и известное как tunnel of Corti. Экзогенный FGF2 стимулирует миграцию нейронов и их дифференцировку в эксплантатах внутреннего уха у куриных эмбрионов. У мышей, полученный из мезенхимы FGF10, оказывается, является ключевым фактором, инициирующим и/или поддерживающим рост FGFR2-экспрессирующих эпителиальных выростов. Убедительные доказательства, подтверждающие данное предположение, исходят из исследования Fgf10-null мутаций и из экспериментов по удалению Fgfr2 гена. Null-мутация и гипоморфная мутация целого гена Fgfr2 приводит к летальности на ранних и средних сроках эмбрионального развития соответственно. Последняя мутация вызывает гибель на стадии раннего отоциста в то время, когда начинается его морфогенез. Мыши с отсутствием Fgfr2 IIIb изоформой – единственной изоформой, которая связывает FGF10 и FGF3– развивают отоцисты из эктодермальной плакоды. Это свидетельствует о том, что FGFR2 (IIIb) сигнализирование не играет существенной роли на самых ранних стадиях образования внутреннего уха. Однако Fgfr2 (IIIb)-специфически таргетированная делеция ведет к тяжелому дисгенезу кохлео-вестибулярного мембранного лабиринта, что, вероятно, связано с остановкой морфогенеза на стадии отоциста. Сенсорные patches (участки) у этих мутантов рудиментарны и это подтверждает, что несенсорные ткани могут влиять на последующее развитие сенсорных тканей.

Изучение локализации mRNA Fgfr2, Fgf10 и Fgf3 в развивающейся улитке мышей подтверждает, что FGF3 и FGF10 функционируют в качестве паракринных регуляторов морфологического паттернирования внутреннего уха посредством активации IIIb изоформы Fgfr2. Недавно были обнаружены две короткие волны Fgf8 транскриптов: – сначала на стадии отической плакоды и позже на стадии отоциста. А эктопические аппликации FGF2 и FGF8 вели к увеличению вестибуло-кохлеарного ганглия. По мере идентификации все большего числа таких сигнальных молекул, было бы желательно установить временную «оркестровку» молекулярных событий, начинающихся со стадии отической индукции и до стадии зрелого внутреннего уха.

Zink finger Gata3 ген, кодирующий GATA-связывающий белок 3, экспрессируется как во внутреннем ухе, так и в афферентных и эфферентных слуховых нейронах. Более точно, Gata3 ген экспрессируется в развивающихся и во взрослых оливо-улитковых и вестибулярных эфферентных нейронах, но не в соседствующих с ними фациальных и жаберных мотонейронах. Gata3 определяется также внутри отоциста и окружающей его периотической мезенхиме. Неудивительно, что у мышей Gata3-null уши остаются кистозными (cystic) с единственным расширением эндолимфатического протока, у них отсутствуют полукруглые каналы и утрачены саккулярные (мешковидные) и утрикулярные (utricular) отростки.

Слияние пластинчатого (плоского – plate) образования и последующее удаление слившихся клеток – важные события в морфогенезе полукруглых каналов (semicircular canal). Ntn1 (netrin 1) активно экспрессируется в отическом эпителии – в клетках, предназначенных для формирования слияния пластинки. Утрата функции аллеля Ntn1 ведет к существенному редуцированию переднего полукруглого канала и полному отсутствию заднего и боковых каналов.

Pou3f4 (POU домен, класс 3, транскрипционный фактор 4; также называется Brn4.0 или slf) изначально экспрессируется в слуховой капсуле (otic capsule) на 10.5 день после коитуса (10.5 dpc), когда капсула инициирует мезенхимальное уплотнение, дающее начало височной кости. Когда слуховая мезенхима уплотняется вокруг отоциста, Pou3f4 экспрессируется во всей слуховой капсуле. Таргетированная инактивация Pou3f4 ведет к множественной функциональной недостаточности в слуховой и в вестибулярной системах, включая аномалии походки, покачивания головы и потерю слуха. Кохлеарные пороки развития сопровождаются гипоплазией spiral limbus, scala tympani и strial fibrocytes, а также заметным уменьшением кохлеарного завитка (coiling), что свидетельствует о нарушениях клеточного сигнализирования между мезенхимой и эпителием. Кроме того, «урезанный» или диспластичный фенотип антериального полукруглого канала и иногда латерального полукруглого канала наблюдали у Pou3f4-null мышей, тогда как задний канал оставался в сохранности. Недавние данные по картированию показали, что сцепленная с полом мышиная мутация fidget (slf) имеет идентичный поведенческий фенотип (вертикальные покачивания головой) и что эта мутация является Х-хромосомной инверсией с одной точкой разрыва, близкой к Pou3f4, которая избирательно подавляет экспрессию Pou3f4 в развивающемся внутреннем ухе. Все эти находки указывают, что slf мутанты являются удобной генетической моделью для большинства форм Х-сцепленных несиндромальных врожденных пороков слуха у человека (DFN3; OMIM:304400). Эта мутация может рассматриваться в качестве гомолога (ортолога) мутации человека POU3F4.

Prrx2 (paired related homeobox 2; другое название –Prx2) нокауты имеют нормальную структуру внутреннего уха, несмотря на наблюдаемую экспрессию Prrx2 в латеральной стенке отоциста на Е9.5 и Е10.5. Prrx1 (paired related homeobox 1; другое название –Prx1) не экспрессируется в отоцисте с Е9.5 до Е12.5. Однако оба Prrx2 и Prrx1 активно экспрессируются в мезенхиме, окружающей отоцист с латеральных сторон и дивертикулу развивающихся протоков. Инактивация обоих генов ведет к уменьшению размеров всей слуховой капсулы (otic capsule) и утрате латерального полукруглого канала. У Prrx1/Prrx2 двойных нокаутов формирование дивертикулы будущих полукруглых каналов задерживается и не завершается окончательно, тогда как деламинация (расслоение) и слияние стенок дивертикулы происходит без осложнений. И, напротив, лишь небольшое уменьшение размеров было отмечено в слуховой капсуле Prrx1 одиночного нокаута. Данные подтверждают, что Prrx гены участвуют в эпителио-мезенхимальном взаимодействии, которое индуцирует морфогенез внутреннего уха.

Полную утрату латерального полукруглого каналов и отсутствие (или очень сильное редуцирование) заднего и переднего каналов наблюдали у Hmx3 (H6 гомеобокс 3) нокаутов, характеризующихся гиперактивностью и круговыми движениями, напоминающими shaker/waltzwe фенотип. Hmx3 сначала экспрессируется в передней части слуховой плакоды на стадии Е8.5 и в то время, когда происходит формирование отоциста, меняет локализацию из медиального домена в дорсолатеральную стенку – область, которая позже даст начало вестибулярному аппарату. Тяжесть дисгенеза задних и передних каналов варьирует между отдельными мутантами и между обоими ушами у одной особи (Рис.2). Мaculae of utriculus и sacculus не поражается и нормальный слух сохраняется в отсутствие видимых изменений в улитке и эндолимфатическом протоке. Wang с соавт. приписывает похожие вестибулярные дефекты, наблюдаемые у второй Hmx3 нокаутной линии, сильному истощению сенсорных клеток в saccule и utricle, а также полной утратой крист полукруглого латерального канала и латеральной ампуллярной камеры (ampullary chamber).

Другой член Hmx семейства – Hmx2 (H6 гомеобокс 2) коэкспрессировался с Hmx3 в развивающихся нервах ЦНС и в дорсо-латеральном слуховом эпителии. Наиболее активно Hmx2 экспрессировался на передней стороне отоциста на стадии Е9.5 и в антеро-дорсальной части отоциста на стадии Е10.5. К Е12.5 весь дорсальный участок (pars superior) активно экспрессировал Hmx2. В дорсальном эндолимфатическом протоке Hmx2 экспрессия была наиболее выражена на Е12.5, когда вся структура была уже сформирована. Примерно 65% Hmx2 нокаутов характеризовались гиперактивностью, круговыми движениями тела (circling) и покачиваниями головы в отсутствие видимых аномалий ЦНС. Разрушение Hmx2 вело к отсутствию формирования полукруглого канала, сохранению примордиальной вестибулярной дивертикулы, формированию common macula в соединившейся утрикуло-саккулярной камере и заметной утрате сенсорноых и несенсорных эпителиальных клеток в развивающемся преддверии внутреннего уха. На начальных стадиях формирование fusion plate (утончение слоя отического эпителия, утрата морфологии эпителия и открепление от подлежащей основной мембраны) задерживается, но окончательного соединения соответствующих стенок никогда не происходит. Сниженная скорость клеточной пролиферации, наблюдаемая на E11.5 в слуховом эпителии и в рядом расположенной периотической мезенхиме, в сочетании с измененной экспрессией специфических регуляторов развития, включая Bmp4, Dlx5 и Pax2, указывают, что Hmx2 контролирует детерминацию и перевод эпителиальных клеток в дорсальный участок отоциста, где происходит пролиферативный рост и слияние отростков, необходимых для образования функционального вестибулярного аппарата.

Otx1 и Otx2 (orthodenticle homologs 1 и 2 соотвественно) активируются на стадии отоциста. На Е10.25 Otx1 определялся в вентро-латеральной стенке отоциста, тогда как Otx2 определялся на вентральном конце отоциста в пределах участка Otx1-экспрессирующего домена. По мере развития наиболее дорсальная граница домена с Otx2 экспрессией соответствует середине утрикулярного зачатка. У Otx1 нокаутов отсутствуют латеральный полукруглый канал, латеральная ampulla, утрикуло-саккулярный проток и кохлео-саккулярный проток, и они характеризуются аномалиями развития cochlear hook (Рис.2). Надо заметить, что кохлеарный и саккулярный дисгенез вариабелен по своему проявлению у Otx1-null мышей. Otx2 нокауты гибнут на стадии Е10, т.е. перед основным паттернированием внутреннего уха. Анализ Otx1(-/-)/Otx2(-/+) компаундных мутантов показал более тяжелые аномалии у животных, особенно в вентральных структурах, включая saccule и улитку, экспрессия Otx2 у которых нормальна. Различия, наблюдаемые между Otx1-null мутантами и Otx1(-/-/Otx2 (-/+) компаундными null мутантами, так же как и неспособность OTX2cDNA человека «спасать» латеральный канал и ampulla у Otx1-null мутантов, подтверждает, что эти гены перекрываются и обладают специфическими функциями в паттернировании внутреннего уха.

Таким образом, Otx1 играет критическую роль в формировании латеральных канала и ampulla, а Otx2 необходим для паттернирования улитки и saccule.

Dlx5 (distal-less homeobox 5) транскрипты определялись во время генеза слуховой плакоды и инвагинации отического углубления. Начиная со стадии Е8.0 Dlx5 экспрессируется в дорсо-постериальной области отоциста и впоследствии в полукруглых каналах и в эндолимфатическом протоке и пузырьке вестибулярного органа. Агенез антериальных и постериальных полукруглых каналов и редуцирование латерального полукруглого канала были обнаружены независимо друг от друга у двух разных линий Dlx5 нокаутов, сконструированных Acampora с соавт (1999) и Depew с соавт (1999) соответственно. Однако между этими линиями были выявлены различия в развитии эндолимфатического протока и в морфологии улитки. У первой линии мышей обе эти структуры почти не поражены, у второй линии эти повреждения были достаточно тяжелыми – у них обнаружены аномалии завитка улитки (cochlear coiling) и отсутствие дорсально локализованного эндолимфатического протока. Следует отметить, что хотя Dlx2, -3, -5 и -6 экспрессировались во внутреннем ухе мышей, до сих пор только у Dlx5 нокаутов обнаружены дефекты развития внутреннего уха.

Начиная со стадии Е11.5 экспрессия Nr4a3 (ядерный рецептор подсемейства 4, группа А, член 3; ранее известен как Nor1; рецептор 1 neural orphan) обнаруживается в будущем месте слияния plate-формирующих клеток отоциста. После формирования мембранного лабиринта (membranous labyrinth) на Е13.5 и до постнатального дня 1 (Р1) Nr4a3 экспрессия ограничивается несенсорными эпителиальными клетками, локализованными на внутреннем крае полукруглых каналов, и несенсорными эпителиальными клетками, которые формируют крышу (свод) ampulla и utricle (перепончатый мешочек ушного лабиринта или маточка). В результате таргетированного удаления Nr4a3 вестибулярные сенсорные области развиваются нормально и происходит слияние вестибулярных стенок. Однако у Nr4a3-null мышей замечено уменьшение размера канала и выравнивание ampullae, а также пенетрантная гиперактивность и двунаправленные круговые движения тела животного. Уменьшенный размер канала ассоциируется с дефектом пролиферативного непрерывного роста уже сформированных полукруглых каналов и последующим редуцированием эндолимфатического жидкостного пространства внутри каналов и соответствующим им ампулам.

Ранняя эмбриональная экспрессия retinoid binding белков в структурах улитки подтверждает важную роль этих белков во время онтогенеза и морфогенеза внутреннего уха.

Анализ Crabp1-null и Crabp2-null мышей без клеточного RA binding белка I и II соответственно, а также Rbp1-null мышей с отсутствием клеточного retinol binding белка I, не обнаружил каких-либо модификаций в морфологии улитки и пороге слышимости. Вероятно, эти retinoid – связывающие белки не оказывают прямого влияния на развитие улитки и дифференцировку волосковых клеток.

Образование и выживаемость нейроэпителиальных составляющих

У мышей с гомологом дрозофилиного проневрального гена atonal (Atoh1 или Match1), который экспрессируется в сенсорном эпителии, не образуются улитка и вестибулярные волосковые клетки. Atoh1 необходим для развития определенных компонентов проприоцептивного пути, включающего гранулярные нейроны мозжечка и pontine nuclei. В сенсорном эпителии Atoh1 нокаутов полностью отсутствуют волосковые клетки, но морфология опорных клеток (supporting cells) в отсутствие апоптозной клеточной гибели нормальна. Atoh1 является первым геном, контролирующим детерминацию волосковых клеток. Более того, у Atoh1-null эмбрионов отсутствуют D1 интернейроны, дающие начало подгруппам проприоцепторных интернейронов, спиномозжечковым и клиномозжечковым (cuneocerebellar) путям.

Таргетированная инактивация гена Hes1 (мышиный гомолог “hair and enhancer of split 1” Drosophila), который является негативным регулятором нейрогенеза, ведет к образованию многочисленных волосковых клеток в улитке и маточке. Экспрессия Hes1 определяется во время дифференцировки волосковых клеток, усиливается во время перинатального периода и продолжается во взрослом организме. В пределах вестибулярного сенсорного эпителия Hes1 экспрессируется в опорных, но не в волосковых клетках. В улитке Hes1Hes1, Hes5 не экспрессируется в волосковых клетках, но его экспрессия обнаружена в малом эпителиальном гребне, в опорных клетках и в узкой полоске клеток в пределах большого эпителиального гребня. Независимые эксперименты Zine с соавт. (2001) показали, что в улитке Hes1-null мышей значительно увеличено число внутренних волосковых клеток(inner hair cells – IHCs), которые происходят из клеток-предшественников, локализованных в наиболее дистальном домене большого эпителиального гребня, тогда как в улитке Hes5-null мутантов значительно увеличено число наружных волосковых клеток (outer hair cells – OHCs), происходящих из предшественников, локализованных в проксимальном домене малого эпителиального гребня. В вестибулярных органах инактивация Hes1 и в меньшей степени Hes5, ведет к образованию избыточного количества волосковых клеток в saccule и в utricle. Кроме того, избыточность волосковых клеток у Hes1 и у Hes5 нокаутов сопровождается повышением регуляции (активности) Atoh1, свидетельствуя о том, что активность Hes1 и Hes5 играет ведущую роль в судьбе IHCs и OHCs соответственно, возможно, посредством антагонизма Atoh1.

Прослеживание судьбы клеток с использованием ретровирусной трансфекции подтверждает, что волосковые и опорные клетки появляются от общего предшественника и не сегрегируют до поздних стадий развития внутреннего уха. Хотя молекулярный механизм, лежащий в основе выбора пути развития между волосковыми и опорными клетками неясен, недавние исследования показали, что в детерминации клеточной судьбы не последнюю роль играет Notch-Delta сигнальный путь. Notch белки являются лиганд-активированными трансмембранными рецепторами, участвующими в выборе клеточной судьбы во время развития у дрозофилы и у позвоночных. Активация Notch ведет к последующей активации генов Hes1 и Hes5. Кроме того, Notch сигнальные компоненты имеют как отличные, так и перекрывающиеся паттерны экспрессии Notch рецептора и его лигандов Jagged (Jag1) и Jagged2 (Jag2) во время развития слухового эпителия крыс.

У мышей таргетированные мутации разных частей этого пути дифференцированно поражают IHCs и OHCs популяции. Notch1 экспрессия определяется в сенсорном эпителии улитки до дифференцировки волосковых клеток и его экспрессия снижается в дифференцирующихся волосковых клетках. Jag1 экспрессия ограничивается несенсорными опорными клетками, окружающими IHCs и OHCs к Е18. Notch1 и Jag1 гомозиготные null эмбрионы гибнут еще до формирования улитки. Notch1 гетерозиготные животные в неонатальном периоде имеют многочисленные волосковые клетки, однако они специфически ограниченны OHC рядами, которые сохраняют равномерно паттернированное расположение. И хотя развитие внутреннего уха не было изучено у гетерозигот Jag1, эти мыши не гиперактивны и не характеризуются аномалиями движения (круговыми движениями) и покачиванием головы. У Jag2-null неонатальных мышей многочисленные волосковые клетки дифференцированы во внутреннем ухе и в рядах внешних волосковых клеток улитки. Предположительно это связано со снижением Notch активации. В то же время у Jag2-null мутантов в улитке сильно увеличено число IHCs и в меньшей степени число OHCs, а паттернирование рядов OHC происходит беспорядочно по сравнению с таковым у животных дикого типа.

Lfng (lunatic fringe) ген, кодирующий внеклеточный модулятор Notch сигнального пути, экспрессируется в несенсорных опорных клетках в улитке на Е18. Lfng гомозиготные null мыши не имеют сильных различий в числе волосковых клеток или в паттернировании по сравнению с контролем. Но у двойных нокаутов с отсутствием генов Lfng и Jag2 образование излишних волосковых клеток в IHC ряду (которое наблюдали у одиночного нокаута по Jag2) подавлено, тогда как избыточное число волосковых клеток в OHC рядах не изменено. Это указывает на то, что Lfng мутация частично подавляет последствия Jag2 инактивации на развитие IHC.

Pou4f3 домен (POU домен, класс 4, транскрипционный фактор 3; другое название Brn3.1 или Brn3c) экспрессируется в постмитотических волосковых клетках. Экспрессия Pou4f3 сначала определяется в на стадии Е14, вскоре после дифференцирования волосковых клеток от эпителиальных в кортиевом органе и продолжается во взрослом организме. Молодые Pou4f3 гомозиготные null мыши характеризуются гиперактивностью, круговыми движениями и глухотой. Начальные стадии морфогенеза улитки у них не осложнены, а волосковые клетки начинают экспрессировать специфические маркеры – myosin VI, myosin VIIa, calretinin и parvalbumin. Однако вскоре после этого Pou4f3 -null волосковые клетки гибнут, перед тем как начнется морфологическая дифференцировка и, в конечном итоге, многие из нейронов спиральных ганглиев (spiral ganglion) дегенерируют. Pou4f3 гаплонедостаточность не оказывает никакого эффекта на морфологию улитки и у 18 -24 месячных гетерозиготных животных не обнаружено потери слуха или выраженной дегенерации улитки по сравнению с соответствующим по возрасту контролем. У человека имеется соответствующий ген глухоты POU4F3 в DFNA15 локусе (OMIM: 602459). В отличие от мышиных гомозиготных нокаутов, у человека мутантный фенотип доминантен, а у гетерозигот относительно позднее начало потери слуха (18-30 лет). Маловероятно, что мутантный аллель человека может препятствовать дифференцировке волосковых клеток, но он может поражать долгосрочную выживаемость волосковых клеток.

Atf2 (активирующий транскрипционный фактор 2 = Creb2) нокауты имеют пониженный слух, гиперактивность и вертикальные покачивания головы. Их saccular и utricular maculae атрофированы, число сенсорных клеток значительно снижено, редуцированы stereocilia и otoconia (отолиты), а близлежащие вестибулярные ганглии имеют меньшее число клеточных тел нейронов. Нарушение равновесия также сообщали при дефиците Itga8 (integrin a8). Утрикулярные волосковые клетки выживших Itga8 нокаутов не имели stereocilia, что приводило к дефекту механической чувствительности.

На Е12-Е13 Apaf1 (apoptotic protease activating factor 1) активно экспрессируется в эпителии внутреннего уха, где апоптоз происходит при регуляции Apaf1 и антиапоптозной молекулы Bcl-XL. Apaf1 и апоптосома (apoptosoma) участвуют, таким образом, в Bcl-XL-зависимом пути запрограммированной клеточной гибели, которая вносит определенный вклад в морфогенетическое ремоделирование развивающегося внутреннего уха. Разрушение Apaf1 ведет к эмбриональной гибели с фенотипом, поражающим апоптоз во время развития – в мозге, внутреннем ухе и тканях сетчатки. Предварительные данные по мышиным Apaf1 нокаутам показали, что на Е9.5 нейроэпителиальная выстилка отоцистов истончена и дезорганизована. У нескольких выживших мутантов отмечена гиперактивность, сравнимая с наблюдаемой при выраженных дефектах внутреннего уха.

Дефицит caspasa 3 (cysteine protease, участвующая в апоптозе) ведет к тяжелым, зависимым от возраста, нарушениям слуха, гиперплазии опорных клеток и дегенерации сенсорных волосковых клеток и stereocilia. Более того, Casp3-null мыши имеют прогрессирующую дегенерацию нейронов спирального ганглия в отсутствие апоптозных проявлений. Большой эпителиальный гребень, остаток примордиального кортиева органа, который в норме исчезает в течение 10 дней после рождения, персистирует во всех завитках (turns) улитки у двухнедельных нокаутов, указывая на незрелость морфологии улитки. Картирование гена CASP3 человека и локуса, контролирующего аутосомно-доминантную несиндромальную форму потери слуха (DFNA24 OMIM:606282) на хромосоме 4q35, подтверждает, что Casp3 нокауты могут быть моделью этого заболевания человека. Нарушений слуха у гетерозигот по Casp3 не отмечено, но возможно, что лица с DFNA24 могут иметь скрытую мутацию в CASP3.

Cdkn1b дефицитные мыши с отсутствием cyclin-зависимым киназным ингибитором 1В (другое название – p27 или Kip1) характеризуются постнатальной гиперплазией опорных и волосковых клеток. У взрослых Cdkn1b нокаутов наблюдали аберрантные stereocilia, отсутствие волосковых клеток и тяжелые нарушения слуха. Cdkn1b экспрессия была нормальной в примордиальном кортиевом органе, коррелируя с остановкой клеточного деления предшественников волосковых клеток и опорных клеток на Е12-Е14. Cdkn1b экспрессия быстро снижается в дифференцирующихся волосковых клетках, но продолжается в постмитотических опорных клетках зрелого кортиева органа. У Cdkn1b-таргетированных мышей клетки развивающегося нейроэпителия имеют период пролонгированного клеточного деления, ведущего к формированию избыточного числа волосковых и опорных клеток. Присутствие пролиферирующих клеток в постнатальном кортиевом органе, а также продолжающаяся экспрессия Cdkn1b в зрелых опорных клетках вносят важный вклад в поддержание состояния стабильности (quiescence) этой ткани и, вероятно, в ее способность к регенерации.

Развитие нормальных слуховых функций требует наличия тироидных гормонов и их рецепторов. (TRs). Известно, что врожденные расстройства, связанные с нарушениями тироидных гормонов, сопровождаются нарушениями слуха, а тяжелые формы глухоты часто ассоциируются с дефицитом йода. Во время эмбрионального и постнатального развития улитки Thra (кодирует TRα) и Thrb (кодирует TRβ) экспрессируются (перекрывая друг друга) в кортиевом органе. Делеции либо TRα1, либо TRα2 изоформ не ведут к нарушениям морфологии улитки, ее физиологии и потере слуха. Нокауты с отсутствием обеих изоформ Thrb (TRβ1 и TRβ2) характеризуются тироидной гиперактивностью и выраженной потерей слуха в отсутствии видимых пороков развития улитки. Однако нокауты с отсутствием только TRβ2 изоформы имеют нормальный слух. Недавно было показано, что делеция TRα2 ведет к сверхэкспрессии TRα1. Более того, когда TRα2 мутантный аллель интродуцировали на Thrb-null бэкграунд, слуховой и тироидные фенотипы, вызванные утратой TRβ подавлялись, подтверждая тем самым, что сверхэкспрессия TRα1 может компенсировать отсутствие TRβ. Оказалось, что физиологическая дифференциация IHCs зависит от Thrb-опосредующего пути, т.к. Thrb нокауты, имеющие нормальные проводимость hair cell transducer, OHC электроподвижность и внутриулиточные потенциалы характеризовались задержкой экспрессии потока калия (I Kf) в кохлеарных IHCs. Интересно то, что делеции всех известных TRs дают новые и отягощенные фенотипы, которые индуцируют замедление дифференцировки сенсорного эпителия, аберрантное формирование покровной перепонки, дефект электромеханической трансдукции в OHCs и низкий внутриулитковый потенциал. Возможно, что разные пути, опосредованные только TRβ, только TRα1 или совместно TRβ и TRα1, участвуют в созревании улитки.

Супероксид дисмутазы (SODs) относятся к классу антиоксидантных ферментов, превращающих супероксидный радикал (O2-) в пероксид водорода. Образование супероксидных радикалов во время ишемии и при действии сильного звука связывали с повреждениями улитки. Инактивация Sod1 (супероксид дисмутаза 1), избыточно экспрессирующейся в улитке, ведет к увеличению чувствительности индуцированной шумом утраты слуха и к нарушениям центральной нервной системы, что связано с повреждениями аксонов, ишемией и воздействием аналогов глутамата. В отсутствии шума и действия ототоксических агентов у мышей дикого типа и у нокаутов по Sod1 наблюдали сходные паттерны утраты сенсорных волосковых клеток с возрастом, то есть базально-апикальное прогрессирование утраты волосковых клеток, причем с большей утратой OHCs, чем IHCs. Однако размеры дегенерации значительно больше у Sod1-null мышей, указывая на то, что Sod1 оказывает модулирующий эффект на скорость и/или степень утраты волосковых клеток улитки, предположительно через метаболические пути, затрагивающие супероксидные радикалы.

Увеличение индуцированной шумом потери слуха также наблюдали у Gpx1-null мышей с отсутствием глутатион пероксидазы 1 (другого антиоксидантного фермента). Таким образом, прослеживается связь между генетически нарушенной антиоксидантной защитой, чувствительностью улитки к повреждениям и дегенерации и некоторыми признаками возрастной потери слуха у человека.

Calbindin-D28k относится к цитозольным кальций-связывающим белкам, и локализован в IHCs и OHCs, в вестибулярных волосковых клетках на верхушке гребешка (cristae) и в striolae of maculae. Он также присутствует в больших количествах в нейронах кохлеарных и вестибулярных ганглиев и в отдельных нейронах слуховых ядер ствола мозга. Несмотря на его значительное присутствие в волосковых клетках, Calbindin-D28k не играет большой роли в основных слуховых функциях внутреннего уха, что было показано при исследовании Calb1-null мышей. Оказалось также, что буферная способность кальция не обеспечивает физиологической защиты против умеренной акустической травмы внутреннего уха.

Функциональная утрата Scnn1α (натриевый канал, nonvoltage-gated, type 1, α polypeptide) оказывает небольшое влияние на IHC трансдукцию у Scnn1α-null новорожденных мышей, у которых имеются механочувствительные волосковые клетки и образуются нормальные потоки трансдуктора в сравнении с контролем. И, напротив, инактивация Cacna1d (кальциевый канал, вольтаж-зависимый, L-тип, α1D субъединица) ведет к врожденной глухоте, обусловленной полным отсутствием потоков L-типа в кохлеарных IHCs и дегенерацией OHCs и IHCs.

Функции внутреннего уха: механотрансдукция

Архитектурная организация покровной (текториальной) мембраны (tectorial membrane)

Покровная мембрана (перепонка) является внеклеточным матриксом внутреннего уха, которая контактирует с stereocilia bundles специализированных сенсорных волосковых клеток. Звук вызывает движение волосковых клеток покровной мембраны, меняет направление стереоцилий и ведет к колебаниям мембранного потенциала волосковых клеток, преобразуя звук в электрические сигналы. α-tectorin, кодируемый Tecta, является одним из главных не-коллагеновых компонентов покровной мембраны. Взрослые Tecta-null мыши не характеризуются круговыми движениями или покачиваниями головы, но имеют покровную мембрану, аномально отделенную от spiral limbus и не имеющую не-коллагенового матрикса. В норме реакция базилярной мембраны имеет вторичный резонанс, указывая на то, что покровная мембрана обеспечена структурой, против которой могут реагировать волосковые пучки OHC. У Tecta-null мышей реакция базилярной мембраны «налажена», но менее чувствительна, а кохлеарные микрофонные потенциалы демонстрируют явные различия фазы и симметрии по сравнению с контролем, указывая на то, что покровная мембрана важна для нормального развития и синхронизации обратной кохлеарной реакции. Известно, что у человека имеется две разные аутосомно-доминантные формы – DFNA8 и DFNA12, и одна аутосомно-рецессивная форма – DFNB21 prelingual несиндромальной глухоты, являющиеся результатом мутаций в гене TECTA.

Otogelin относится к специфическим для внутреннего уха гликопротеинам, экспрессирующимся во всех внеклеточных структурах, участвующих в процессе механотрансдукции. Otog-null мыши страдают глухотой и заметным нарушением равновесия. В вестибуле отолитные (otoconial) мембраны и capulae откреплены от нейроэпителия, указывая на то, что otogelin существенен для прикрепления этих мембран к подлежащему нейроэпителию. С другой стороны, otogelin не столь важен для прикрепления покровной мембраны к spiral limbus и для соединения основных компонентов покровной мембраны. Ультраструктурный анализ волокон типа А и типа В в улитке Otog-null мышей свидетельствует об участии otogelin в организации фибриллярной сети.

Мутация COL11A2 (procollagen, тип 11, α2) у человека ведет к врожденной, непрогрессирующей, несиндромальной сенсонейральной потери слуха. Как и у человека Coll11a2 мыши характеризуются от средней до тяжелой степени глухотой, связанной с нарушениями архитектоники покровной мембраны. Коллагеновые волокна в мутантной покровной мембране атипичны. Других изменений в IHCs, OHCs, несенсорных эпителиальных клетках, Кортиевом органе, невральных структурах или stria vascularis не выявлено. Однако преобладающая отопатология, наблюдаемая у Coll4a3-null мышей с отсутствием проколлагена типа 4 α3 – это прогрессирующие тканевые повреждения в базальной мембране, окружающей сосуды stria vascularis, сопровождаемые (в крайних случаях) утратой базолатеральных завертываний (infolding) в маргинальных клетках. У человека синдром Альпорта (Alport) характеризуется прогрессирующими гломерулонефритами, приводящими к почечной недостаточности и гибели, а также к прогрессирующей, высокочастотной потерей слуха и передним лентиконусом (OMIM:301050). У Coll4a3 нокаутов изменения, отмеченные в strial vasculature согласуются с высокочастотно-независимой потерей слуха, что контрастирует с высокочастотной потерей слуха при синдроме Альпорта. Корреляция между ультраструктурными аномалиями в улитке и потерей слуха у отдельных нокаутных мышей дает основание для дальнейших исследований изучения причин этих физиологических эффектов и выяснения вопроса о том, являются ли нокауты Coll4a3 подходящей моделью для синдрома Альпорта.

Эндолимфный гомеостаз и ионный баланс

В разделе рассматривается рециклинг ионов К+ из волосковых клеток в эндолимфу и поддержание т.о. высокой концентрации калия в эндолимфе, что играет критическую роль в трансдукции волосковых клеток. Ионы К+ секретируются затем преимущественно в эндолимфу через отдельные области лабиринтного эпителия – stria vascularis улитки и dark cells вестибулярной системы. Stria vascularis в норме генерирует эндокохлеарный потенциал около +80mV, что в сочетании с высоким содержанием К+ в эндолимфе (около150 mM), «управляет» сенсорной трансдукцией потенцирующей слух. Stria vascularis состоит из двух эпителиальных барьеров – маргинальных клеток, секретирующих К+ в эндолимфу, и базальных клеток. которые соединяются посредством щелевидного соединения (gap junction) с интермедиальными клетками. Kcnj10 (potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 10) транскрипты локализованы в мембране стриальных интермедиальных клеток, а не в базо-латеральной мембране маргинальных клеток, как сообщалось ранее. Сравнение чувствительности к препаратам между эндокохлеарным потенциалом и мембранным напряжением (voltage) изолированных интермедиальных клеток указывает на участие KCNJ10 в образовании эндокохлеарного потенциала. Kcnj10-null мыши имеют нормальный вестибулярный эндолимфатический К+ и объем. Однако у них потерян слух, не образуется эндокохлеарный потенциал, снижен эндолимфатический К+ и объем. Эти находки свидетельствуют о том, что KCNJ10 K+ канал поддерживает электродвижущую силу для образования эндокохлеарного потенциала во взаимодействии с другими транспортными путями, и это важный механизм, осуществляющий доставку К+ к стриальным маргинальным клеткам.

Сходный коллапс эндолимфатического пространства отмечен у мышей с отсутствием любой из субъединиц апикального KCNQ1-KCNE1 K+ канала. KCNQ1 (potassium voltage-gated channel, subfamily Q, member 1) ассоциируется с регуляторной единицей, KCNE1 (potassium voltage-gated channel, Isk-related subfamily, member 1), генерирует кардиальный реполяризированный поток I Ks. I Ks является кандидатом для эндолимфной секреции, т.к. Kcnq1 и Kcne1 экспрессируются в маргинальных клетках stria vascularis и в вестибулярных dark клетках, которые, как было показано, образуют I Ks-подобные потоки на их апикальных мембранах. Необходимым условием для I Ks является дальнейшее подтверждение дефектов внутреннего уха, ассоциированных с Jervell и Lange-Nielsen синдромом (JLNS), характеризующимся выраженной двусторонней глухотой и кардиальным фенотипом, который обусловлен мутацией в KCNQ1. Кроме кардиальных дисфункций Kcnq1 нокауты характеризуются shaker/waltzer фенотипом и глухотой. К 3 постнатальному дню развития рейснерова (Reissner ) мембрана, в норме отделяющая scala media от scala vestibule, разрушена в spiral limbus и покровной мембране (tectorial membrane) Кортиева органа. Снижение объема эндолимфы продолжается в постнатальном периоде, когда происходит обширная дегенерация IHCs и OHCs на всех завитках улитки.

Глухота и коллапс эндолимфотических пространств, отмеченные у Kcnq1-null мышей напоминают таковые у Kcne1-null мышей и Slc12a2 (solute carrier family 12, member 2)-null мышей. Slc12a2 активно экспрессируется на базолатеральной мембране маргинальных клеток stria vascularis и кодирует Na+-K+-Cl- ко-транспортер, который, вероятно, необходим для предпоследнего этапа рециклинга К+ (обратно в эндолимфу из волосковых клеток). Ультраструктурный анализ Slc12a2 нокаутов обнаружил дефекты, включающие коллапс рейснеровой мембраны, отсутствие волосковых и опорных клеток в кортиевом туннеле и дислокацию текториальной мембраны. Признаки дисфункций вестибулярного аппарата (круговые движения, покачивания и дрожания головы) и раннее начало глухоты отмечены у Slc26a4-null мышей с отсутствием так называемого пендрина (pendrin). В соответствии с функцией pendrin как переносчика анионов, Slc26a4 (также называемого Pds) экспрессируется в дискретных областях внутреннего уха, играющих критическую роль в регуляции состава эндолимфы. Аномальный жидкостный гомеостаз уже очевиден к Е15.5, о чем свидетельствует расширение эндолимфатического протока и мешочка, улитки и саккулюса, а в некоторых случаях и полукруглых каналов. В кортиевом органе OHCs и IHCs имеют тяжелые, хотя и в разной степени варьирующие дегенеративные изменения, часто ассоциированные с увеличенными стереоцилиями (stereocilia). Дегенерация сенсорных волосковых клеток усиливается с возрастом. Нормальные отоконии в большинстве случаев отсутствуют, но иногда регистрируют гигантские отоконии. У Slc26a4-null мышей отсутствуют тиреоидные аномалии и они, таким образом, имеют сходство с больными с несиндромальной глухотой, ассоциированной с SLC26A4 (PDS) мутациями, идентифицированными при синдроме deafness/goiter (глухота/зоб) Pendred.

Отсутствие отолитов наблюдали в вестибулярной системе Atp2b2 (также Pmca2)-таргетированных мышей с отсутствием АТФ-азы, Ca2+ транспорта плазменной мембраны 2, которые высоко экспрессируемых в кохлеарных OHCs и клетках спирального ганглия. Утрата отолитов означает, что кристаллы карбоната кальция могут быть сформированы и/или поддержаны отчасти Ca2+, вытесненным в эндолимфу посредством Apt2b2. Гомозиготные null-мутанты глухи и характеризуются спектром аномалий кортиева органа, а также тяжелой атаксией, нарушениями равновесия и изменениями мозжечка. У этих гетерозигот найдены гистопатологические изменения кохлеарных каналов, сопровождающиеся значительной потерей слуха. В соответствии с этими находками спонтанные, вызывающие глухоту мутации, поражающие ген Apt2b2, найдены у мутантных мышей deafwaddler (dfw), имеющих аномалии походки (раскачивающуюся походку) и покачивания головы. Гетерозиготы deafwaddler имеют повышенный уровень distortion product otoacoustic emission (DPOAE) и сниженные амплитуды при высоких частотах по сравнению с контролем, который был обработан фуросемидом, вызывающим временное снижение DPOAE. В данном случае необходимо выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе такой гистопатологии, и определить, играет ли Apt2b2 прямую роль в механоэлектрической трансдукции, осуществляемой волосковыми клетками.

Таргетированная делеция Aqp4 (аквапорин 4) ведет к повышенным уровням слуховой реакции ствола мозга (auditory brainstem response –ABR) и частотно-независимому дефициту слуха в отсутствие аномальной ABR волнового паттерна или морфологических аномалий улитки, свидетельствуя о том, что аквапориновые водные каналы участвуют в слышимости. Данные об избирательной экспрессии Aqp4 в эпителиальных клетках (клетках Hensen, клетках Claudius и клетках inner suculus) кортиева органа, указывают на участие AQP4 в поддержании осмотического равновесия во время рециклинга К+. Нарушения слуха у Aqp4 нокаутов вероятно являются результатом модификаций в основном ионном составе эндолимфы и/или объема OHC во время передачи механо- электрического сигнала. Утрата других белков водных каналов, экспрессируемых во внутреннем ухе (AQP1, AQP3 и AQP5) не влияет на уровень ABR.

Ephrins (Ephs) и их рецепторы участвуют в управлении направлением роста и фасцикуляции (образовании пучков) аксонов, образовании границ (boundary) в мозге и миграции клеток нервного гребня. Критичным для направления движения аксонов и образования эндолимфы является цитоплазматический домен Ephb2 (Eph рецептор B2 тирозин киназы). Ephb2-null мыши имеют аномалии в early midline navigation (в раннем пересечении срединной линии) контралатеральных (относящихся к внутреннему уху) эфферентных ростовых конусов, а также зависимые от линии мышей аномалии поведения (гиперактивность, круговые движения) и дисфункции вестибулярного аппарата, связанные с ультраструктурными аномалиями в продуцирующих эндолимфу вестибулярных dark клетках, которые в норме экспрессируют Ephb2. У взрослых Ephb2-null мутантов обнаружен коллапс протоков полукруглых каналов, очевидно в результате уменьшения образования эндолимфатической жидкости. В соответствие с клеточно-автономной ролью в регуляции (объема) жидкости PDZ домен-содеожащие белки, связывающие С-терминали Ephb2, распознают С-терминали определенных обменных анионов и аквапоринов (например, AQP1). Эти наблюдения позволили выявить механизм, посредством которого Ephs и их рецепторы связаны с ионным гомеостазом и образованием эндолимфы во внутреннем ухе.

Меланоциты улитки являются производными интермедиальных клеток stria vascularis нервного гребня. Они необходимы для нормального развития улитки, о чем свидетельствуют исследования мутантных мышей с врожденными аномалиями меланоцитов. Более того, Na+ K+-ATPase и калиевые каналы интермедиальных клеток необходимы для образования эндокохлеарного потенциала и для подготовки ионного окружения в stria. В соответствии с этим дефицит меланоцитов, обусловленный разрушением некоторых генов, ведет к нарушениям слуха как у мышей, так и у человека. Null-мутации в гене мышей, кодирующем эндотелиновый (endothelin) рецептор типа В (Ednrb) или его лиганд эндотелин-3 ( End3), играют ключевую роль в процессе развития двух клеточных линий, являющихся производными нервного гребня – нейронов миэнтерического ганглия и эпидермальных меланоцитов. Ednrb и End3 нокауты характеризуются аганглиозным мегаколоном, ассоциированным с бело-пятнистой окраской шерсти, что напоминает фенотипы естественных мышиных мутаций piebald-lethal и lethal-spotting соответственно. Фактически кроссбридинг подтвердил, что Ednrb является аллелем локуса piebald, а End3 аллелен локусу lethal-spotting. Ранее было показано, что piebald-lethal мутанты характеризуются аномалиями внутреннего уха, возможно, являющимися результатом дефектов в области акустического ганглия (производного нервного гребня) или следствием отсутствия меланоцитов (производных нервного гребня) во внутреннем ухе. У человека синдром Waardenburg-Shah (WS4; OMIM:277580) относится к аудио-пигментарному синдрому, включающему синдром Waardenburg и болезнь Hirschsprung. Он характеризуется нарушениями слуха и аномалиями пигментации кожи и радужной оболочки. К настоящему времени клонировано три гена, кодирующих WS4 – SOX10 (SRY-box содержащий ген10), EDN3 и EDNRB.

Считают, что ионы К+ подвергаются рециклингу из эндолимфы через сенсорный эпителий и обратно в stria vascularis посредством передвижения от клетки к клетке через нексус (щелевидное соединение – gap junction). Предполагают, что ионы К+ выходят из OHCs через KCNQ4 (potassium voltage-gate channel, подсемейство Q, член 4) – новый К+ канал, экспрессирующийся в OHCs и мутированный при форме несиндромальной доминантной глухоты (DFNA2; OMOM:600101) у человека. После выхода из OHCs K+ может быть удален, частично путем поглощения в опорные клетки Deiters. Согласно модели рециклинга К+, К+ затем диффундирует через систему щелевидного соединения (gap junction), связывающую клетки Deiters и фиброциты, обратно в stria vascularis. Получены доказательства, что Slc12a7 (solute carrier family 12, член 7, другое название Kcc4) способствует сифонированию К+ ионам после того как они вышли из OHCs в клетки Deiters, где К+ проникает в путь щелевидного соединения. К Р8, до того как у мышей обнаруживается слух, ген Slc12a7 экспрессируется в stria vascularis и почти во всех клетках кортиева органа. На P14, когда животное начинает слышать, экспрессия Slc12a7 ограничивается клетками Deiters, которые поддерживают OHCs на их базальной опоре (basal pole) и в фалангеальных клетках (phalangeal cells), обертывающих IHCs. Во время третьей постнатальной недели развития Slc12a7-null мыши характеризуются прогрессирующей потерей слуха и значительной дегенерацией в спиральном ганглии в присутствии неповрежденной рейснеровой мембраны. Ограниченная выживаемость OHCs в апикальном завороте улитки, возможно, обусловливает остаточный слух, выявленный у взрослых нокаутов. Следует заметить, что глухота, ассоциированная с почечноканальциевым ацидозом, указывает на роль Slc12a7 в экструзии (вытеснении) Cl- через базолатеральную мембрану кислото-секретирующих α-интеркалированных клеток в нефрон. Данные о том, что хлоридные анионы и бикарбонат работают как инородный (несвойственный) датчик напряжения OHC моторного белка prestin, свидетельствуют о том, что изменения в [Cl-] в кортиевом органе, могут в дальнейшем привести к нарушению функций OHC у Slc12a7-null мышей.

У человека мутации в GJB2 гене, кодирующем мембранный канальный белок щелевидного соединения β2 (его также называют connexin 26) отвечают примерно за 50% аутосомно-рецесствной несиндромальной глухоты (DFNA3, DFNB1). GJB2 участвует в рециклинге ионов К+ обратно в эндолимфу кохлеарного протока после стимулирования сенсорных волосковых клеток. Gjb2-null эмбрионы гибнут на Е11 из-за нарушений трансплацентарного поглощения глюкозы. Таким образом, такие таргетированные нокауты могут служить моделью для DFNB1 и/или GJB2 патологии человека. Мутация в гене GJB3 человека (gap junction membrane channel protein β3; также называется connexin 31) также вызывает глухоту. У мышей Gjb3 инактивация ведет к эмбриональной гибели и транзиторному плацентарному нарушению морфогенеза. Однако никаких морфологических или функциональных дефектов внутреннего уха у выживших нокаутов выявлено не было.

Нахождение пути аксонами и иннервация сенсорных нейронов внутреннего уха

Недавно получены доказательства того, что для выживаемости нейронов и дифференцировки сенсорных нейронов внутреннего уха необходим каскад транскрипционных факторов. Для иллюстрации этого можно привести пример с Neurod3 (neurogenetic differentiation 3, также называется neurogenin 1), который специфически экспрессируется в VIII краниальном ганглии/нейрогенной области на стадии отоциста. Делеция Neurod3 ведет к уменьшению сенсорного эпителия, лишению его иннервации и снижению числа волосковых клеток (которые к тому же имеют нарушения морфологии), что свидетельствует о необходимости нормальной иннервации для дифференцировки волосковых клеток, по крайней мере, до рождения. VIII ганглий у них не формируется, а макула, utricle и saccula уменьшены в размерах. Modiolus (костная канал, который образует центральную ось улитки) утрачен, а saccule образует лишь небольшое расширение на utricle, ведущее к ductus reunions, соединенному с улиткой. У Neurod3-null мутантов имеется только 1,25 завитков вместо 1,75 по сравнению с контролем (РИС.2). Важно то, что у этих нокаутов сохранены только дистальные, эпибранхиальные, происходящие из плакоды висцеральные афференты в лицевом и stato-acoustic нервах, проецирующихся на одиночный путь (solitary tract).

Neurod1 (neurogenetic differentiation 1), нижестоящая мишень Neurod3, также важен для выживаемости сенсорных нейронов внутреннего уха на ранних стадиях дифференцировки. Кроме двигательных дисфункций, являющихся результатом дефектов мозжечка, Neurod1 нокауты характеризуются тяжелой атаксией и глухотой. В отличие от Neurod3 нокаутов, у которых полностью отсутствуют проекции афферентных и эфферентных волокон, Neurod1-нокауты еще сохраняют некоторое количество сенсорных нейронов. Паттерн оставшихся сенсорных нейронов и афферентной иннервации свидетельствуют о раннем начале такой утраты во время развития, которая стабилизируется к Е14.5. Миграция оставшихся вестибулярных сенсорных нейронов имеет неправильное направление и проекции волокон во всем вестибулярном эпителии беспорядочны. Отсутствие Neurod1-null сенсорных нейронов, которые экспрессируют Ntrk2 (neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2, также называется TrkB) и Ntrk3 (neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3, также называется TrkС), указывает на участие Trk сигнализирования в выживаемости юных дифференцирующихся нейронов. Фенотип Neurod1 нокаутов сходен с фенотипом компаундных “Trk” мутаций. Утрата иннервации в базальном завитке улитки и отсутствие спирализации афферентных и эфферентных волокон вдоль IHCs в направлении к базальному концу улитки напоминает дефекты у Ntf3 (нейротрофин 3)-null и Ntrk3-null мутантов. Однако паттерн утраты нейронов у Neurod1 нокаутов больше похож на паттерн комбинированной Ntrk2-гетерозиготной и Ntrk3-null мутации. Такие компаундные мутации имеют высокий уровень межиндивидуальной вариабельности в плотности оставшихся афферентных и эфферентных волокон.

Функциональная делеция Bdnf (мозговой нейротрофический фактор) или его рецептора Ntrk2 ведет к катастрофическому снижению числа вестибулярных нейронов и полной утрате иннервации полукруглых каналов. Кроме того, у мышей с отсутствием и Bdnf, и Ntf3 или Ntrk2 и Ntrk3 утрачена вся иннервация внутреннего уха. Т.е. эти нейротрофины и их рецепторы необходимы для нормальной афферентной иннервации внутреннего уха.

Pou4f1 (POU домен, класс 4, транскрипционный фактор 1; также называется Brn3.0 и Brn3a) экспрессируется в facial-stato-acoustic ганглии до дифференцировки сенсорных нейронов и иннервации отоциста. Таргетирование Pou4f1 ведет к уменьшению размеров нейронов и к снижению генной экспрессии Ntrk3, Pva (парвальбумин) и Pou4f2 в спиральном ганглии, указывая на то, что эти гены являются нижестоящими мишенями для Pou4f1. Афферентная иннервация в конечном итоге устанавливается к Е13.5, несмотря на наблюдаемую задержку в образовании проекций аксонов на улитку и задний вертикальный канал. Избирательная утрата Ntrk3 нейронов в спиральном ганглии улитки Pou4f1-null мышей ведет к аномалиям иннервации, сходными с таковыми у Ntrk3-null мышей. Эфферентные аксоны, использующие афферентные волокна в качестве скаффолдов («подпорок», «строительных лесов») во время нахождения своего пути, направляются к внутреннему уху по неверному маршруту. В целом, эти находки говорят о неизвестной ранее роли Pou4f1 в контроле выживаемости, дифференцировки, миграции и нахождении аксонами сенсорных нейронов внутреннего уха пути посредством регуляции нижестоящих в сигнальном пути генов.

Постнатально Igf1 (инсулин-подобный ростовой фактор-1) активно экспрессируется в улитке и в субпопуляции нейронов кохлеарного ганглия, а также в stria vascularis, spiral limbus и опорных клетках кортиева органа. Анализ молодых Igf1-null мышей показал, что у них укорочена улитка и кохлеарный ганглий, незрелая покровная мембрана, и большая потеря слуховых нейронов. Утрата IGF-1 в значительной степени нарушает выживаемость клеток, их дифференцировку и созревание клеток кохлеарного ганглия, а также иннервацию сенсорных клеток кортиева органа.

Chrna9 (холинергический рецептор, никотиновый α пептид 9; также называется Acra9) является единственной никотиновой рецепторной субъединицей, экспрессируемой кохлеарными OHCs, которые контактируют через эфферентные волокна (первоначально холинергические), происходящие из ЦНС. Chrna9 дефицитные мыши внешне нормальны, но при выполнении рефлексов Preyer имеют отклонения равновесия и аномалии движения. Однако большинство мутантных OHCs иннервируется единственной крупной терминалью, а не множеством мелких, свидетельствуя о роли Chrna9 в нормальных синаптических связях между эфферентными волокнами и волосковыми клетками. Chrna9-null мыши функционально «де-эфферентированы», у них не подавлен кохлеарный ответ во время активации эфферентных волокон.

Присутствие tenascin-C во время прокладывания маршрутов нервными волокнами в spiral lamina и в кортиев орган подтверждает, что этот гликопротеин может участвовать в афферентном синаптогенезе и служить субстратом роста нейронов в улитке, особенно для волокон, растущих в направлении OHCs области. Однако tenascin-нокауты не имеют аномалий слуха и дефектов анатомии улитки, хотя у них были отмечены некоторые отклонения в поведении. Исследования in vitro и анализ еще одной мутантной линии нокаутов –Tnc выявили роль tenascin-C в развитии и регенерации улитки.

Глухоту и нейродвигательные нарушения наблюдали у нокаутов, являющихся моделью метахроматической лейкодистрофии, лизосомального сфинголипидного расстройства, вызванного дефицитом As2 (arylsulfatase) и характеризующегося прогрессирующей демиелинизацией и множественными неврологическими симптомами (OMIM:250100). Внутреннее ухо As2 мышей почти полностью демиелинизировано и имеет дегенеративные изменения слухового ганглия, что сопровождается утратой вызванных слуховых потенциалов ствола мозга в возрасте 12 мес. Молекулярные основы специфической чувствительности мышиного слухового ганглия к демиелинизации и нейродегенерации пока неясны, т.к. эти нокауты проявляют неожиданно умеренный фенотип в центральной и периферической нервных системах.

Wnt сигнализирование участвует в контроле пролиферации и в образовании синапсов во время неврального развития и предположительно это опосредуется Frizzled семейством поверхностно-клеточными рецепторами. Экспрессия Fzd4 (frizzled гомолог 4 дрозофилы) в слуховых и вестибулярных волосковых клетках и позднее начало потери слуха у Fzd4 нокаутов в отсутствие гибели слуховых или вестибулярных волосковых клеток, свидетельствует, что Fzd4 важен для поддержания функций волосковых клеток, но не играет решающей роли на ранних стадиях развития и функционирования внутреннего уха.

Наконец, обработка Slc1a3-null мышей с отсутствием solute carrier family 1, члена 3 акустически травмирующими стимулами ведет к увеличению накопления глутамата в перилимфе и ухудшению слуха из-за афферентного дендритного разрастания (возвышения) ниже IHCs. Эти исследования подтверждают, что Slc1a3, Na+-зависимый глутаматный рецептор, который специфически экспрессируется в области IHCs, и фиброциты в limbus и спиральной связке (spiral ligament), действуют как нейропротекторы против глутаматной excitotoxicity во время звукового сверхраздражения. Кроме того, это ясно свидетельствует о том, что глутамат является нейротрансмиттером синапсов между IHCs и слуховым нервом.

A compendium of mouse knockouts with inner ear defects Anna V. Anagnostopoulos TRENDS in Genetics. V.18. № 10. (2002)

A compendium of mouse knockouts with inner ear defects
Anna V. Anagnostopoulos
TRENDS in Genetics. V.18. № 10. (2002)