Данные дают возможность выявить природу амилоидных заболеваний и механизмы амилоидной токсичности на молекулярном уровне. Они также свидетельствуют, что следовые количества агрегатов различных белков могут встречаться спонтанно, особенно во время старения и что такие агрегаты отвечают за небольшие нарушения клеточных функций в отсутствие амилоидного фенотипа. Интересным представляются исследования незрелых белковых агрегатов при системных и неврологических заболеваниях, не связанных с образованием амилоида. Понимание механизмов, лежащих в основе образования таких агрегатов, и механизмов клеточного контроля, который в норме должен предотвращать повреждения, может быть крайне важным для разработки терапевтических подходов в лечении заболеваний, связанных с нарушениями упаковки белковых молекул. Природа патогенетических свойств агрегатов важна для идентификации правильных мишеней при разработке эффективных лекарственных препаратов.
Большинство известных токсических веществ имеют белковую природу. Например, белок рицин (ricin), обнаруженный в семенах растения, из которого получают касторовое масло, вызывает гибель животной клетки при введении в нее единственной молекулы этого токсического вещества. Это происходит вследствие ферментативной инактивации рибосом рицином. Ферментативная активность таких токсинов зависит от их зрелой трехмерной структуры, однако недавно было показано, что некоторые белки представляют опасность, независимо от зрелости их структуры или их активности (см. ниже).
(Рис.) | The problem of protein aggregation. a, Partly folded polypeptide chains, released from ribosomes (the protein-synthesizing machines), normally collapse into correctly folded, functional proteins. b, However, partly folded polypeptides may sometimes associate with similar chains to form aggregates. Partial unfolding of correctly folded proteins may also lead to aggregation. Aggregates vary in size from soluble dimers and trimers up to insoluble fibrillar structures. Unlike most correctly folded proteins, both soluble and insoluble aggregates can be toxic to cells through unknown mechanisms, as exemplified in the new papers1
|
Функции большинства белков зависят от точности их трехмерной структуры. Большинство нормальных белков - это компактные структуры, поверхностные свойства которых определяют их функции. Такие структуры образуются в результате процесса упаковки белка, во время которого полипептидные цепи переходят в глобулярное состояние в зависимости от их аминокислотной последовательности. Боковые гидрофобные группы у правильно упакованных белков находятся внутри молекулы и защищены от окружающей водной среды. Правильно упакованные белки или растворимы, или связаны с клеточными мембранами. Однако когда процесс упаковки белка происходит с ошибками, появляются разного размера белковые агрегаты, некоторые их которых становятся нерастворимыми. У таких агрегатов отсутствуют функции, присущие нормальным белкам и они ассоциируются с тяжелыми заболеваниями человека.
Возникновение агрегатов связано с тем, что в некоторых промежуточных структурах, образующиеся во время процесса упаковки белка, гидрофобные группы «выводятся» на поверхность и эти участки могут связываться с такими же участками соседних молекул (Рис.1). Ситуация усугубляется при высоких концентрациях макромолекул. В норме этот процесс находится под контролем белков, названных молекулярными чаперонами (molecular chaperones), и защищающих гидрофобные поверхности друг от друга. Несмотря на такой контроль, некоторые нейродегенеративные заболевания человека (болезнь Альцгеймера, болезнь Крейцфельдта-Якоба) ассоциируются с белковыми агрегатами, названными амилоидными фибриллами или амилоидными бляшками. Вопрос о том, каким образом формируются агрегаты и почему они вызывают заболевания, является в настоящее время предметом интенсивных исследований.
Амилоидные фибриллы, ассоциирующиеся с заболеваниями человека, могут формироваться, по крайней мере, из 20 неродственных белков, имеющих общую структуру - центральную сердцевину β-sheets (β-оболочки) и способность окрашиваться Конго красным или тиофлавином T (thioflavin T). Такая унифицированность амилоидных белков предполагает, что процесс агрегации амилоидных фибрилл неспецифичен в отношение определенной аминокислотной последовательности, и является общим признаком всех полипептидных цепей при определенных условиях, т.к. формирование β-sheets включает взаимодействие между атомами основной цепочки аминокислот, встречающееся во всех белках. В поддержку этой гипотезы свидетельствуют данные о белках, не связанных с заболеваниями человека. Например, миоглобин, может формировать амилоидные фибриллы in vitro при определенных условиях и иметь частично неправильно упакованную структуру.
Bucciantini с соавт. показали, что при инкубации структурной части или домена бактериального регуляторного белка HypF при рН 5.5 в присутствии трифлюороэтанола, агрегация происходит в течение минут. Такие ранние агрегаты имеют признаки β-структуры и связываются с тиофлавином, но их структура еще аморфна (по данным электронной микроскопии), признаки фибрилл отсутствуют. Через 48 часов образуются короткие «протофибриллы» с нарушенными концевыми структурами, а после 20 дней инкубации они заменяются на длинные, неветвящиеся структуры, характерные для зрелых амилоидных фибрилл. Препараты аморфных агрегатов или протофибриллы (т.е. незрелые амилоидные образования) вызывали гибель клеток крыс и мышей in vitro, препараты, содержащие только зрелые фибриллы не оказывали токсического эффекта.
Известно, что два типа агрегатов ассоциируются с повреждениями мозга - фибриллярные клубки tau-белка внутри нейронов и амилоидные фибриллы других белков во внеклеточном пространстве. Амилоидные фибриллы содержат множество копий 40-42 аминокислотного амилоидного β (Aβ) белка. Это фрагмент более крупного белка с неизвестными функциями, прикрепленного к плазменной мембране. Амилоидные фибриллы токсичны в культуре нейронов, но пока неясно, являются ли они основной причиной повреждения нервных клеток при болезни Альцгеймера. Плотность амилоидных бляшек у таких больных слабо коррелирует с тяжестью деменции. Работы некоторых лабораторий показали, что растворимые (незрелые) формы Aβ белка повреждают нейронные синапсы (Kim J.H. et al. J. Neurosci. 2001.V.21. P.1327-1333). Walsh с соавт. также обнаружили, что растворимые димеры, тримеры и олигомеры Aβ пептида, полученные из культуры клеток, нарушают синаптические функции при введении в мозг крыс, в то время как мономеры Aβ, протофибриллы и зрелые фибриллы не оказывают такого эффекта. Небольшие Aβ агрегаты специфическим образом нарушают способность синапсов активно отвечать на быстрые последовательные стимуляции электрошоком. Это свойство называется «долгосрочное потенцирование», и оно является ключевым элементом в обучении и памяти. Вещества, ингибирующие ферменты, продуцирующие Aβ пептиды, снижают образование димеров и тримеров в культуре клеток и могут быть потенциальными агентами для лечения болезни Альцгеймера.
Результаты этих исследований подтверждают, что повреждения клеток могут быть вызваны неправильно упакованными промежуточными белковыми структурами, возникающими во время формирования амилоидных фибрилл. Токсичность таких ранних агрегатов зависит от некоторых, еще не идентифицированных свойств, а не от их аминокислотной последовательности. Возможно, что некоторые заболевания, не ассоциированные с накоплением амилоидных фибрилл, могут быть вызваны спорадическим образованием агрегатов, возникающих вследствие ошибок, которые происходят во время упаковки белков. Эти данные важны для понимания клеточных механизмов, препятствующих таким потенциально летальным ошибкам, а также для идентификации точных клеточных мишеней действия агрегатов. Высокая вариабельность в возрасте начала появления болезни Альцгеймера подтверждает, что образование агрегатов является пусковым механизмом начала заболевания, и что чапероны не контролируют процесс упаковки полипептидной цепи. В случае прионовых болезней, некоторые неправильно упакованные цепи являются «инфекционными», т.е. они конвертируют нормальные цепи в такие же неправильно упакованные структуры.
Недавно было установлено, что некоторые линии E.coli продуцируют амилоидные фибриллы, используя их для прикрепления к поверхностям. Это открытие имеет некоторое преимущество для исследователей и предполагает другой подход для изучения механизма образования агрегатов, т.к. такие бактерии легко поддаются генетическим и биохимическим манипуляциям (Chapman, MR. et al.2002. Science V.295. P.851-855).
Naturally secreted oligomers of amyloid β protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo D.M. Walsh, I. Klyubin, Fadeeva J.V. et al.
Nature, (2002). V.416. P. 535-539
Перевод Ирины Г. Лильп
|
Многие серьезные заболевания человека связаны с нарушениями упаковки белка. Присутствие нераcтворимых кластеров неправильно упакованных белков (misfolded proteins, MPs) является общим патологическим признаком болезни Альцгеймера и энцефалопатий, но связь между отложением таких агрегатов и наносимый ими ущерб для здоровья пока не поняты окончательно. В настоящее время показано, что незрелые (ранние), неправильно упакованные промежуточные образования, находящиеся на пути формирования белковых агрегатов, также могут отвечать за повреждения, по крайней мере, за некоторую их часть.
(Рис.1) | SDS-stable oligomers of human A block hippocampal LTP in vivo. a, 7PA2 CM (blue) but not CHO- CM (black, P<0.001) blocked LTP. Insets show typical EPSPs 5 min pre- (1) and 3 h post-HFS (2); calibration bars 5 ms/0.5 mV. b, Immunoprecipitation of 7PA2 CM with an antibody to A (R1282, blue, see c) but not to APPS (B5, green) prevented the block of LTP. c, Blots of R1282 precipitates from CM used in b show that A monomer (arrow) and dimer (double arrow) had been efficiently precipitated; compare A retrieved in 1st precipitate versus in a second precipitation (2nd). d, Blotting of remaining CM of samples in c with 22C11 revealed that the R1282 precipitation did not alter APPS- levels. e, Incubation of 7PA2 CM with IDE caused complete loss of A monomers (single arrow), whereas A dimers (double arrow) and trimers were minimally diminished (lanes 1 versus 2). f, Treatment of 7PA2 CM with IDE (red) did not prevent the block of LTP. g, h, Magnitudes of LTP at 3 h post-HFS (% baseline s.e.m.); asterisks P < 0.05 compared to CHO- (g) or control solution (h). n, Number of animals used per treatment.
(Рис.2) | γ-secretase inhibitors block A oligomer formation at doses that allow substantial monomer production. Inhibition of 7PA2 cellular A secretion by MWIII-20 (a) and DAPM (b) was quantified by ELISA. Values (means s.d.) from three independent experiments were normalized to DMSO controls. Insets show inhibitor structures. c, d, 7PA2 cells were treated for 6 h with MWIII-20 or DAPM and A species visualized by immunoprecipitation and western blot. e, f, Densitometric quantification of experiments as in c and d; A monomer (black bars) and dimer (grey bars) densities normalized to vehicle control. MWIII-20, n=8 and DAPM, n=5. Asterisk indicates that at a given concentration, decrease in dimer is significantly greater (P < 0.005) than decrease in monomer. g, CM from cells treated with 0.1 µM DAPM (red, n=5) allowed a robust LTP, whereas media from untreated 7PA2 cells (blue, n=4) blocked LTP (insets as in Fig. 3). h, 7PA2 cells were conditioned in plain DMEM with or without DAPM for 6 h; CM was examined by immunoprecipitation and western blot and used for electrophysiology.
|
Известно, что фибриллярные (но не мономерные) формы амилоидного β белка (Aβ) похожие на белки, присутствующие в амилоидных бляшках при болезни Альцгеймера, нейротоксичны в культуре. Однако, в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, обнаружена относительно слабая корреляция между плотностью фибриллярных бляшек и тяжестью деменции. В то же время корреляции между уровнем растворимых (незрелых) Aβ и степенью синаптических и когнитивных нарушений выражены гораздо сильнее.
Изучая токсичность промежуточных образований, находящихся на пути формирования между простыми Aβ мономерами и нерастворимыми Aβ бляшками, Walsh D.M. с соавт. обнаружили, что Aβ растворимые олигомеры, образованные из двух или трех связанных Aβ молекул, способны влиять на синаптическую пластичность. Авторы показали, что естественные олигомеры амилоидного Aβ белка человека формируются вскоре после образования пептида в специфических внутриклеточных везикулах и впоследствии секретируются из клеток.
Микроинъекции в мозг крыс среды, содержащей олигомеры и избыток Aβ мономеров (но не амилоидных фибрилл), подавляли гиппокампальное долгосрочное потенцирование (hippocampal long-term potentiation, LTP). Удаление из среды всех Aβ образцов полностью устраняло этот эффект. Предварительная обработка среды инсулин-деградирующим ферментом, который разрушал Aβ мономеры (но не олигомеры) не предотвращало ингибирование LTP. Следовательно, Aβ олигомеры, в отсутствие мономеров и амилоидных фибрилл, нарушают синаптическую пластичность in vivo при концентрациях, сходных с обнаруженными в мозге и спинномозговой жидкости человека. Обработка клеток ингибиторами γ- секретазы предотвращала образование олигомеров при дозах, допускающих значительное образование мономеров, и такая среда не нарушала LTP, подтверждая, что ингибирование LTP in vivo происходит в результате действия SDS-стабильных олигомеров Aβ белка, а не мономеров или фибрилл, естественно секретируемых клетками человека (Рис.1). В работе впервые показано, что биохимически идентифицированные олигомерные ансамбли естественно секретируемых Aβ человека изменяют синаптические эффекты на физиологическом уровне. Находки авторов подтверждают гипотезу о том, что растворимые Aβ олигомеры являются ведущими эффекторами синаптической дисфункции и утраты, которые характерны для болезни Альцгеймера.
Показано, что после образования во внутриклеточных везикулах Aβ мономеры формируют димеры, тримеры и олигомеры более высокого порядка и что, по крайней мере, часть из этих олигомеров является высокостабильной и впоследствии секретируется из клеток. Секретируемые олигомеры могут взаимодействовать с нейронами in vivo, изменяя их нормальную физиологию. Такие же эффекты могут лежать в основе тонких синаптических изменений и нарушений обучения и памяти, наблюдаемых у молодых APP трансгенных мышей и у пациентов с ранним началом болезни Альцгеймера. Понимание механизмов, лежащих в основе образования таких агрегатов, может быть крайне важным для разработки терапевтических подходов в лечении заболеваний, связанных с нарушениями упаковки белковых молекул. При разработке терапевтических подходов в лечении болезни Альцгеймера это может быть связано с избирательным снижением уровня потенциально синаптотоксичных Aβ олигомеров. Авторы установили, что два химически различных ингибитора γ-секретазы блокируют образование Aβ димеров и тримеров при дозах, не препятствующих образованию Aβ мономеров (Рис.2). Однако, если вещества, препятствующие агрегации, не предотвращают начальную димеризацию, то они могут увеличивать уровень потенциально синаптотоксических Aβ. Таким образом, Aβ-снижающие препараты (например, β или &gamma:-ингибиторы секретаз), предотвращающие внутри- и внеклеточную олигомеризацию, но сохраняющие образование мономеров, были бы наиболее подходящими веществами для лечения пациентов с «конформационными» (т.е. связанными с нарушениями упаковки белка) болезнями, в т.ч. болезни Альцгеймера. Природа патогенетических свойств агрегатов важна для идентификации правильных мишеней при разработке эффективных лекарственных препаратов.
|
Сайт создан в системе uCoz |
){kind=link}
){kind=link}
){kind=link}
){kind=link}
){kind=link}