Interaction of reelin signaling and Lis1 in brain development
Nature Genetics. V. 35. № 3. P. 270-276 | |
Мутанты с утратой функций RELN гена (кодирующего reelin) или PAFAH1B1 гена (кодирующего LIS1) вызывают лиссэнцефалию – заболевание человека, связанное с нарушениями миграции нейронов. У мышей гомозиготные мутации по Reln дают reeler фенотип, характеризующийся атаксией и нарушениями ламинарной структуры коры мозга. У Pafah1b1+/- мышей найден дефект ламинарной структуры гиппокампа, а гомозиготы по этой мутации летальны в раннем эмбриональном периоде. Reln кодирует внеклеточный белок, регулирующий формирование слоев посредством взаимодействия с VLDLR и ApoER2 (Lpr8) рецепторов, фосфорилируя таким образом Dab1 сигнальную молекулу. Lis1 ассоциируется с микротрубочками и модулирует миграцию нейронов. Авторы исследовали взаимодействие между reelin сигнальным путем и Lis1 во время развития мозга. Компаундные мутантные мыши с нарушениями в Reln пути и гетерозиготные по Pafah1b1 мутациям характеризовались более высокой частотой гидроцефалии и более выраженными дефектами ламинарной структуры коры и гиппокампа. Связывание Dab1 и Lis1 зависело от reelin-индуцированного фосфорилирования. Данные свидетельствуют о генетическом и биохимическом взаимодействии между reelin сигнальным путем и Lis1.
 (Рис.1.) | Progressive hydrocephalus in combined mutants caused by periventricular and aqueductal defects.  (Рис.2.) | Enhanced hippocampal and cortical malformations in Pafah1b1 Dab1 compound heterozygotes.  (Рис.3.) | Biochemical interaction of Dab1 with Lis1.  (Рис.4.) | Reelin-induced tyrosine phosphorylation of Dab1 is required for Lis1-Dab1 binding.  (Рис.5.) | Cellular colocalization of Lis1 and Dab1.  (Рис.6.) | Schematic summary of reelin and Lis1 signaling. |
Для изучения генетических взаимодействий между Reln сигнальным путем и Pafah1b1 авторы сконструировали комбинированных мутантных мышей (РИС.1), характеризующихся высокой частотой прогрессирующей гидроцефалии по сравнению с Pafah1b1+/- мышами. Для этого нокаутных мышей Reln, Vldlr, Lrp8 или Dab1 скрещивали с Pafah1b1+/- мышами. Такие компаундные мыши и показали более высокую частоту гидроцефалии. Отмечается, что компаундные гетерозиготы (Vldlr+/-Pafah1b1+/-) и (Dab1+/- Pafah1b1+/-) также имели более высокую частоту гидроцефалии, однако у null-мышей или гетерозигот только по Vldlr или Dab1 прогрессирующей гидроцефалии обнаружено не было. Эти наблюдения хорошо согласуются с более ранними описаниями локализации Dab1, ApoER2, VLDLR и LIS1 в эпендимальных предшественниках. В настоящей работе авторы показали и подтвердили VLDLR экспрессию в эпендимальных клетках третьего желудочка и водопровода (aqueduct). Фенотип, характеризующийся прогрессирующей гидроцефалией у Pafah1b1+/- мышей или у компаундных мышей является результатом обструкции системы вентрикулярного дренажа (ventricular drainage system), вызванной дефектами эпиндемальной выстилки третьего желудочка и сильвиевого водопровода. Гидроцефалии не наблюдали у Reln мутантов. Результаты указывают, что мутации в Reln сигнальном пути усиливают Pafah1b1 фенотип прогрессирующей гидроцефалии. Гистохимический анализ мозга Dab1 Pafah1b1 двойных мутантов подтвердил генетическое взаимодействие Reln и Pafah1b1 сигнальных путей при формировании гиппокампальных и кортикальных слоев нейронов (РИС.2). Авторы исследовали срезы гиппокампа и коры этих мышей, выбирая парамедиальные саггитальные срезы латеральнее или каудальнее мозолистого тела (corpus collosum), так как эта структура присутствовала у всех мутантов. Dab1 гетерозиготы не имели видимых аномалий гиппокампа, коры или мозжечка. Pafah1b1+/- мутанты характеризовались небольшой дезорганизацией гиппокампа и едва различимыми аномалиями коры. Компаундные гетерозиготные Dab1+/- Pafah1b1+/- мутанты имели более выраженное нарушение ламинарной структуры гиппокампа. Отсутствие гиппокампального ламинарного дефекта у Dab1+/- мышей и более выраженные нарушения ламинарной структуры у двойных Dab1+/- Pafah1b1+/- гетерозигот по сравнению с Pafah1b1+/- гетерозиготами указывает на эпистатическую взаимосвязь этих генов. Гиппокамп Dab1-/- Pafah1b1+/- мышей напоминает гиппокамп Reln-/- Pafah1b1+/- двойных мутантов (данные не представлены) с гетеротопическими кластерами горизонтально ориентированных клеток.
Фенотипический анализ коры у этих мышей также подтвердил взаимодействие между Dab1 и Pafah1b1 (РИС.2). Авторы использовали С-Туг иммунореактивность для мечения крупных пирамидных нейронов слоя 5 и кальбиндин иммунореактивность для мечения интернейронов, которые в норме заселяют слои 2 и 3 во взрослой коре сибсов (за исключением Pafah1b1+/- мышей, не являющихся сибсами). С-Neo иммуногистохимические паттерны в коре Dab1+/- и Pafah1b1+/- мышей напоминают паттерны коры мышей дикого типа. Однако у Dab1+/- Pafah1b1+/- двойных гетерозигот наблюдали выраженное рассеивание нейронов слоя 5 и кальбиндин-позитивных нейронов. Относительное позиционное распределение кальбиндин-позитивных клеток в коре у мышей дикого типа (не показано), Dab1+/- и Pafah1b1+\- мышей было сходным. Распределение кальбиндин-позитивных клеток было смещено в коре у Dab1+/- Pafah1b1+/- мышей. Наблюдали значительное число этих клеток в более глубоких слоях коры, что интерпретировали как частичную инверсию коры. Распределение С-Neo-позитивных и кальбиндин-позитивных клеток в коре Dab1-/- мышей было сильно нарушено. Мыши Dab1-/- Pafah1b1+/- имели сходные нарушения.
Для того чтобы определить, насколько кортикальный фенотип компаундных Dab1 Pafah1b1 гетерозигот отличается от фенотипа отдельных гетерозигот, анализировали кумулятивное распределение кальбиндин-позитивных клеток, используя тест Колмогорова-Смирнова для двух образцов (РИС.2). Для обоснования выбора этого анализа сравнивали кору двух мышей дикого типа с корой двух Pafah1b1+/- мутантных мышей и не обнаружили значимых различий в распределении вероятностей (P?0.05, данные не показаны). Были идентифицированы значительные различия между Pafah1b1+/- и компаундными гетерозиготными мышами, а также между Dab1+/- и компаундными гетерозиготами (РИС.2.). Распределение кальбиндин-позитивных клеток почти не отличалось между Dab1-/- и Dab1-/- Pafah1b1+/- мышами (РИС.2), подтверждая, что Dab1-null фенотип доминирует в Dab1-/- Pafah1b1+/- комбинации. Эти результаты и сходные результаты, полученные для Reln-/- Pafah1b1+/- мышей (данные не показаны), дают возможность предположить, что нарушение Pafah1b1 не изменяет Reln- или Dab1-null кортикальный фенотип. Данные указывают на генетическое взаимодействие между Dab1 и Pafah1b1 во время развития коры.
Усиление фенотипов, ассоциированных с Pafah1b1+/- в результате нарушений Reln сигнализирования и, особенно, гетерозиготности в отношении Dab1, заставило авторов изучить биохимические взаимодействия между Dab1 и Lis1 (РИС.3). Около 15 % гемагглютинин-меченых Dab1 (Dab1-HA) оказались коиммунопреципитированы с меченым зеленым флуоресцентным белком Lis1 (green fluorescent protein–tagged –GFP-Lis1), когда эти белки были коэкспрессированы в COS-7 клетках. Reelin фосфорилирует Dab1 в тирозиновых остатках 198 и 220. Для того чтобы определить, важны ли эти остатки для взаимодействия Dab1 и Lis1, авторы помещали их по отдельности или в комбинации с фенилаланином. Мутантные Dab1(Y198F) и Dab1(Y220F) сохраняли взаимодействие с Lis1, но Dab1(Y198F/Y220F) двойные мутантные белки утрачивали взаимодействие с Lis1.
Авторы также попытались исследовать, могут ли Pafah1b1 мутации, которые вызывают лиссэнцефалию у человека, нарушать взаимодействие Lis1 с Dab1. Один мутант (человека) с выраженным тяжелым фенотипом – Lis1-H149R – не показал взаимодействия с Dab1. И, напротив, мутант, ассоциированный с менее тяжелым фенотипом – Lis1(S169P) – показал взаимодействие с Dab1. Мутант Lis1 предварительно используемый для нарушения β- subunit G-protein-like structure of Lis1 (Lis1(S152W/V400W)), не нарушал взаимодействия Dab1 и Lis1.
Таким образом, нарушение связывания Lis1 с Dab1 коррелировало с тяжестью заболевания у человека.
Для дальнейшего изучения роли фосфорилирования во взаимодействии Dab1 и Lis1 авторы продуцировали дикий тип Dab1-HA и мутантный Dab1(Y198F/Y220F)-HA в cell-free expression системе с FLAG-Lis1 или с/или без рекомбинантной Scr kinase (РИС.4). Иммунопреципитация с антителами к FLAG показала минимальное взаимодействие Dab1 и Lis1 в отсутствии Scr kinase, но их связывание было высоким в присутствии Scr. Связывание существенно снижалось у двойных мутантов Dab1(Y198F/Y220F)-HA, но не у одиночных мутантных белков. Авторы считают, что Dab1 и Lis1 могут не взаимодействовать в мозге Reln-/-. Наблюдали коиммунопреципитацию нативного Lis1 и Dab1 в лизатах мозга, полученных от мышей дикого типа и Reln+/- мышей, у которых 11% Dab1 присутствовало в этом комплексе. Но никакого взаимодействия в лизатах мозга у мышей Reln-/- обнаружено не было. Как сообщалось ранее, Dab1 сверхэкспрессировался у Reln-/- мышей, тогда как Lis1 экспрессировался у них на нормальном уровне. Это свидетельствует о том, что отсутствие взаимодействия между этими белками не является результатом утраты их экспрессии. Исследование фосфорилирования у Pafah1b1 гетерозигот по сравнению с мышами дикого типа не показало никаких изменений в Dab1 фосфорилировании (данные не показаны).
Для дальнейшего подтверждения связи между Dab1 и Lis1 был проведен лазерный конфокальный анализ нейронов гиппокампа, меченых двойной меткой с антителами к Dab1 и Lis1 (РИС.5). Изучение оптических срезов показало, что два белка колокализованы в перинуклеарной цитоплазме. Такая локализация Lis1 сходна с локализацией, сообщенной ранее для Lis1, dynein и NudC. В COS-7 клетках, трансфицированных единственной плазмидой, Dab1 сначала экспрессировался в плазматической мембране, тогда как Lis1 экспрессировался перинуклеарно. Однако, когда коэкспрессировались два гена, Dab1 также локализовался перинуклеарно, перекрывая Lis1 сигнал. Конфокальный анализ дважды трансфицированных клеток в single optical plane подтвердил эти находки. Эти данные свидетельствуют, что Dab1 частично «тянется» (pull) к Lis1-обогащенному компартменту, что свидетельствует о взаимодействии между этими белками.
Усиление Pafah1b1+/- гидроцефалического фенотипа посредством нарушения reelin сигнализирования и нарушение ламинарной структуры гиппокампа и коры у Dab1+/- Pafah1b1+/- мышей доказывает эпистатическое взаимодействие между Reln сигнализированием и Pafah1b1. Биохимическое взаимодействие Dab1 с Lis1 является наиболее вероятным механизмом, посредством которого происходят такие генетические взаимодействия. Reelin сигнализирование конвергируется на Dab1, и заканчивается фосфорилированием остатков тирозина 198 и 220. Это ведет к взаимодействию между фосфорилированным Dab1 и Lis1.
Поскольку гомозиготные дефишенси Pafah1b1 летальны на ранних стадиях эмбриогенеза, то существующими методами невозможно выяснить, является ли Lis1 облигатным компонентом reelin пути, который является нижестоящим (downstream) по отношению Dab1 или является компонентом одной из нескольких ветвей, которые обусловливают внутриклеточную реакцию на reelin. Но сходство фенотипа лиссэнцефалии в коре человека, обусловленного PAFAH1B1 и RELN мутациями, подтверждает, что LIS1 необходим для регуляции критических этапов reelin-зависимого позиционирования нейронов. Тирозин-фосфорилированный Dab1 вероятно действует через дополнительных сигнальных партнеров, таких как ассоциированный с микротрубочками белок Tau и P13K, которые координируют Reln сигнализирование и зависимый от микротрубочек транспорт (РИС.6). Таким же образом Lis1 осуществляет свои функции через взаимодействие c dynein. Авторы предполагают, что reelin и Lis1 являются составляющими более крупной координированной сигнальной системы, которая регулирует миграцию нейронов, нуклеарное распределение и формирование слоев коры, а также поддержание целостности эпендимальной выстилки желудочков мозга млекопитающих. Методы Мыши. Reeler мыши имели C57BL/6 C3H бэкграунд. Vldlr, Lrp8 и Dab1 нокаутные мыши имели бэкграунд гибридов C57BL/6 129S6/SvEv; Pafah1b1 мутанты (использовали Pafah1b1neo, a null allele) имели 129S6/SvEv бэкграунд в начале скрещивания. Иммуногистохимия и гистология мозга. Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде, отмывали в фосфатном буфере, блокировали и затем инкубировали ночь при 4С с кроличьими антителами к Dab1 CT-38. После отмывки клетки инкубировали с Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) и DAPI в течение 1.5 h при комнатной температуре. Для окрашивания Lis1 использовали козлиные поликлональные антитела (Santa Cruz; diluted 1:1,000) и вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцентным isothiocyanate. Для изучения гистологии мозга вскрывали мозговую ткань, перфузировали ее 4% параформальдегидом, заключали в парафин, готовили срезы толщиной 5мкм и окрашивали их либо гематоксилин-эозином, либо крезил виолетом, или метили их антителами к кальбиндину или С-Neu.
Quantitative analysis of the neocortex in mutant mice. We labeled four paramedian sagittal sections caudal to the corpus callosum from siblings of each genotype with calbindin. We used Metamorph software (Universal Imaging) to threshold, count and generate a positional (y) coordinate for each immunopositive cell. We normalized these coordinates to the total cortical distance and expressed the values as percentage distance from ventricle (y = 0) to the pia (y = 100.0) surface. We expressed the data as cumulative probability plots and used the Kolmogorov-Smirnov two-sample statistic (SSPS software) to determine whether two distributions were significantly different. The Kolmogorov-Smirnov statistic measures the maximum vertical distance (D) between two cumulative probability distributions of m and n number of observations, respectively. We used P < 0.05 to determine whether two distributions were significantly different andP 0.05 to conclude that two distributions were similar.
Cell culture and transfections. We cultured 293T cells or COS-7 cells (American Type Culture Collection) in the presence of Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin at 37 °C, 5% CO2. We transfected cells with FuGENE 6 (Roche) and cultured them for 24–48 h. We prepared primary cultures of hippocampal neurons from embryonic day (E)-18 mice and plated them on coverslips coated with poly-D-lysine. We then transferred the coverslips to a dish containing a neuronal/glial monolayer and cultured them for 5 d in B27/Neurobasal A medium.
Immunoprecipitation and western-blot analysis. We extracted proteins from transfected cells and from brain tissues of E16 mice in lysis buffer (1 phosphate-buffered saline, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100 and protease inhibitor cocktail tablet (Roche)). We immunoprecipitated fusion constructs from cells with antibodies to HA (Sigma) or GFP (Clontech) and Protein A/G agarose beads (Pierce). We used antibodies to Dab1 (Novus) or Lis1 (Santa Cruz) to immunoprecipitate native proteins from brain lysates. We separated immunoprecipitated proteins by SDS-PAGE, immunoblotted them and incubated them with the appropriate primary antibodies overnight at 4 °C and then with the corresponding horseradish peroxidase–conjugated secondary antibodies for 1–2 h at room temperature. Proteins were detected using ECL chemiluminescence (Amersham).
Generation of the mutant Pafah1b1 and Dab1 constructs. We carried out site-directed mutagenesis with the Stratagene Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit using mouse Pafah1b1 cDNA subcloned into pEGFP-C3 (Clontech) or pCMV-Tag-2 (FLAG; Stratagene). We modified the mouse Dab1 cDNA by PCR to express an HA tag and subcloned it into pcDNA3.1(+) (Invitrogen). Primer sequences are available on request.
Dab1 in vitro expression and binding. We carried out in vitro translation of cDNAs encoding wild-type Dab1-HA, Dab1(Y198F)-HA, Dab1(Y220F)-HA and Dab1(Y198F/Y220F)-HA using the TNT Quick Couple Transcription/Translation System (Promega). We added antibody to HA for immunoprecipitation as described above. Different Dab1-HA constructs were phosphorylated using the Src Assay Kit (Upstate). We then eluted the proteins from the beads with 0.1 M glycine, pH 2.5 (diluted 1:40), and mixed them with purified FLAG-Lis1 protein beads for 1–2 h. We separated the coimmunoprecipitated proteins by SDS-PAGE, immunoblotted them and detected them as described above.
Fluorescence microscopy and confocal imaging. We visualized protein expression patterns using a Nikon Eclipse TE 200 inverted microscope equipped with phase-contrast and fluorescence settings (Nikon). We acquired images with a Photometrics CoolSnap CCD digital camera (Roper Scientific) and analyzed them using Metaview Imaging software (Universal Imaging Corporation). We acquired confocal images of COS-7 cells transfected with constructs encoding DsRed-Dab1 and EGFP-Lis1 (GFP-Lis1) and of immunolabeled neurons using a Fluoview FV300 confocal laser scanning unit mounted on a BX50WI fixed-stage upright microscope and Fluoview software (all from Olympus America). We acquired GFP images by excitation with an argon laser (488 nm) and a 510–550-nm band-pass emission filter set. We acquired DsRed images by excitation with a krypton laser (568 nm line) and a 585-nm long-pass emission filter set. Image noise reduction was accomplished using a Kallman accumulation average setting of 4. We acquired eight Z-series images for each cell sequentially for each wavelength at 0.5- m increments. We processed maximum projection images of Z-series stacks using both Fluoview and Photoshop 7.0 (Adobe Systems) software.
|