Повреждение сердца после острого инфаркта миокарда (MI) характеризуется выраженной циркадной ритмичностью, при этом тяжесть состояния и клинические исходы зависят от времени начала заболевания^2-7. Циркадные ритмы, обусловленные сменой дня и ночи на Земле, синхронизируют внутренние биологические функции с изменениями окружающей среды, позволяя организмам адаптироваться к суточным колебаниям^18,19. В основе этих ритмов лежат факторы транскрипции, в частности BMAL1^7-11, который образует гетеродимер с CLOCK для регуляции генов, контролируемых циркадными ритмами^8,10,11,20. Хотя клинические и доклинические исследования показали важность циркадных ритмов для физиологии и заболеваний сердечно-сосудистой системы^6,7,21-24, механизмы, лежащие в основе циркадных колебаний при повреждении миокарда, остаются малоизученными. Этот пробел в знаниях снижает эффективность терапии и может приводить к не оптимальным результатам лечения21,25. В этой статье мы описываем молекулярный механизм, в котором взаимодействие между циркадными ритмами и сигналами гипоксии^13-15,26-30 лежит в основе кардиопротекции, зависящей от циркадных ритмов. Учитывая универсальную и важную роль этих путей практически во всех клетках и органах, наши результаты имеют большое значение для углубления понимания и лечения ишемических заболеваний, на которые влияют циркадные ритмы.

В соответствии с предыдущими исследованиями^27,31, в мышиной модели ишемии и нарушения реперфузии миокарда (IRI) наблюдались суточные колебания в степени повреждения сердца и долгосрочных последствиях. Наименьшее повреждение наблюдалось в 8-й час (ZT8; 15:00), а наиболее серьёзное — в 20-й час (03:00) (дополнительное изображение 1). Чтобы выявить молекулярные факторы, определяющие эти циркадные колебания, было проведено секвенирование РНК (RNA-seq) образцов из зоны риска (AAR), собранных через 2 часа после реперфузии в ZT8 и ZT20. Этот анализ выявил различия в транскрипции: в ZT8 было повышено экспрессирование 18 генов и понижено экспрессирование 42 генов по сравнению с ZT20 (рис. 1a, b в дополнительных материалах). Примечательно, что гены-мишени BMAL1, в том числе Per2, Per3, Nr1d2 и Dbp, были значительно активированы в ZT8 (рис. 1a, b и дополнительная таблица 1), это указывает на повышенную транскрипционную активность BMAL1. С другой стороны, уровень транскрипции Bmal1 был снижен в ZT8, что свидетельствует о противофазном характере экспрессии по отношению к его мишеням, что является отличительной чертой циркадных циклов обратной связи между транскрипцией и трансляцией^10,11,20. Анализ с использованием количественной PCR с обратной транскрипцией (RT–qPCR) подтвердил эти колебания (рис. 1c). Анализ онтологий генов (GO) (рис. 1d и дополнительная таблица 2) и путей KEGG (дополнительные данные, рис. 1c) выявил «циркадный ритм» как наиболее значимый путь, а сеть нарушений регуляции ещё больше подчеркнула центральную роль BMAL1 в организации суточной экспрессии генов в ишемизированных сердцах мышей (дополнительные данные, рис. 1d).



Fig. 1: BMAL1 is a key transcription factor in circadian variations of myocardial injury.

a–d, RNA-seq analysis of the AAR from C57BL/6J mice after 2 h reperfusion at ZT8 or ZT20, n = 3 mice per timepoint. a, Expression z scores. b, The fold change (FC) in expression. c, Analysis of circadian expression of DEGs using RT–qPCR. d, The top ten enriched biological process GO terms. FDR, false-discovery rate. e–i, RNA-seq analysis of post-clamping LV biopsies from patients who had aortic valve replacement (AVR) surgery in the morning (AM; n = 56) or afternoon (PM; n = 17). e, The study design. f, Clustered Pearson’s correlations. CRI, chronic renal insufficiency; sCr, serum creatinine. g, The fold change in expression after clamping (morning versus afternoon). h, Enriched GO terms. i, Normalized read counts for DEGs. The box plots show the median (centre line), interquartile range (box limits), and the minimum to maximum values (whiskers). j, The experimental setup for cardiac injury and function assessment in Bmal1loxP/loxP myosin-Cre+ and myosin-Cre+ mice subjected to IRI at ZT8 or ZT20. I, ischaemia; R, reperfusion. k, Heart slices were stained with Evan’s blue and 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) after 2 h reperfusion; the infarct area (green) and AAR (blue) are shown. Scale bar, 1 mm. l, The AAR as the percentage of the LV. m, The infarct size as the percentage of the AAR. n = 7 mice per group per timepoint. n, Serum troponin I levels. n = 7 (Bmal1loxP/loxP myosin-Cre+) and n = 8 (myosin-Cre+) mice per timepoint. o–q, Cardiac function on day 14 after MI by STE. o, The EF, FS and GLS. p, 3D and six-segment longitudinal strain imaging with annotations for reduced contractility (stars), dyskinesis (triangles) and dyssynchrony (circles). Dark blue, anterior base; yellow, anterior mid; magenta, anterior apex; cyan, posterior apex; light pink, posterior mid; green, posterior base. q, The intraventricular delay. For o and q, n = 7 (Bmal1loxP/loxP myosin-Cre+) and n = 9 (myosin-Cre+) mice per timepoint. All samples are biologically independent. For c,l–o and q, data are mean ± s.e.m. Statistical analysis was performed using Wald tests (b and g), two-sided Fisher’s exact tests (d and h) and two-way analysis of variance (ANOVA; l–o and q). The diagram in j was created using BioRender.

Чтобы изучить пути транскрипции в человеческом сердце при повреждении миокарда в разное время суток, мы исследовали образцы биопсии левого желудочка ( LV) у 73 пациентов, перенесших плановую операцию по замене аортального клапана (NCT00281164). Образцы, взятые утром (n = 56, медиана 10:32) или днем (n = 17, медиана 17:15), были взяты до и после примерно 80-минутной ишемии, вызванной пережатием аорты (рис. 1e). Демографические и клинические характеристики пациентов были сопоставимы между когортами (дополнительная таблица 3). Анализ РНК-последовательностей образцов, взятых перед фиксацией, выявил значительную циркадную модуляцию экспрессии генов, при этом BMAL1 был идентифицирован как наиболее подавляемый ген в утренней когорте (рис. 1). 1e и дополнительную таблицу 4), это указывает на его роль в регуляции физиологии сердца, зависящей от времени суток, такой как метаболизм и сократительность^{6,21-24,32,33}. Анализ РНК-секвенирования после пережатия аорты выявил различия в транскрипции в зависимости от времени проведения операции (дополнительные данные, рис. 1f). При этом время проведения операции оказалось более значимым фактором, чем такие ко-варианты, как курение или сопутствующие заболевания (рис. 1f и дополнительная таблица 5). Уровень BMAL1 оставался значительно сниженным в утренней группе (рис. 1g, дополнительные данные, рис. 1g и дополнительная таблица 6), что ещё раз подтверждает его роль в модуляции ишемической реакции сердца. Анализ GO и KEGG выявил значительное обогащение пути «циркадного ритма» (рис. 1h, расширенные данные на рис. 1h и дополнительная таблица 7), при этом противофазные паттерны экспрессии BMAL1 и его мишеней соответствуют наблюдениям на мышах (рис. 1i). Эти результаты позволяют предположить, что консервативная роль BMAL1 как фактора транскрипции заключается в регулировании циркадных колебаний при повреждении миокарда у разных видов.

Чтобы подробнее изучить функциональную роль BMAL1, мы создали индуцируемую линию мышей с нокаутом Bmal1 в кардиомиоцитах (Bmal1loxP/loxPMyh6-cre; далее Bmal1loxP/loxP myosin-Cre+) путём скрещивания мышей с floxed Bmal1 и мышей myosin-Cre+ и индуцирования абляции Bmal1 с помощью инъекции тамоксифена в возрасте 8 недель. Затем мы подвергли мышей Bmal1loxP/loxP myosin-Cre+ и контрольных мышей myosin-Cre+ ишемическому повреждению миокарда в ZT8 или ZT20 (рис. 1j). Через 2 часа реперфузии у мышей с дефицитом Bmal1 была нарушена циркадная изменчивость повреждения миокарда и снижена эндогенная кардиопротекция в ZT8 по сравнению с контрольной группой (рис. 1k–n). Этот фенотип сохранялся в течение длительной реперфузии (на 14-й день после инфаркта миокарда), поскольку спекл-трекинг-эхокардиография (STE)^34,35 показала, что у мышей с дефицитом Bmal1 в ZT8 значительно снижена систолическая функция (фракция выброса (EF), фракционное укорочение (FS), глобальная продольная деформация (GLS), наблюдается большее расширение LV (конечно-диастолический и конечно-систолический объемы) и увеличение массы LV (конечно-диастолическая и конечно-систолическая массы LV) (рис. 1o и дополнительный рис. 2a). Нарушение сократительной способности было заметно как в инфарцированных (передняя средняя и задняя верхушечная части), так и в неинфарцированных (задняя средняя и задняя базальная части) сегментах сердца, что указывает на более обширное повреждение миокарда (дополнительное изображение 2b, c). Выраженные внутрижелудочковые различия также указывают на прогрессирование сердечной недостаточности³⁵ (рис. 1p, q). Напротив, IRI на ZT20 не выявил существенных различий в работе сердца у мышей с нокаутом и контрольных мышей. Эти результаты подчёркивают ключевую роль BMAL1 в циркадной регуляции острого повреждения миокарда и долгосрочных последствий.

Являясь ключевым членом семейства базовых спирально-петлевых-спиральных белков PER–ARNT–SIM (bHLH-PAS), BMAL1 выполняет регуляторные функции посредством взаимодействия с определёнными партнёрами^8,10,11,20. Используя Human Reference Interactome (HuRI)³⁶, мы определили, что индуцируемый гипоксией фактор 2 альфа (HIF2A, также известный как EPAS1), ещё один член семейства bHLH-PAS, является наиболее часто экспрессируемым интерферирующим белком BMAL1 в левом желудочке сердца человека (крупнейший узел на рис. 2a). Анализ GO выявил общие функции BMAL1 и HIF2A в регуляции транскрипции и клеточных реакциях на гипоксию и окислительный стресс (дополнительные данные на рис. 2a и в дополнительной таблице 8). Учитывая острую гипоксию во время инфаркта миокарда^13,15,26,28 и установленную роль HIF2A в гомеостазе кислорода^16,37, мы изучили взаимодействие BMAL1 и HIF2A в условиях гипоксии. Анализ совместной иммунопреципитации (co-IP) в клетках HEK293 выявил прочное ядерное взаимодействие BMAL1–HIF2A в условиях гипоксии (1 % O₂, 4 часа), в отличие от нечувствительного к кислороду взаимодействия BMAL1–CLOCK (рис. 2b, c и дополнительные данные на рис. 2b). В соответствии с предыдущими сообщениями38, связывание BMAL1 с HIF1A значительно слабее (рис. 2b, c). Мы дополнительно проверили это на первичных кардиомиоцитах человека (КМЧ) с помощью эндогенного совместного иммунопреципитационного анализа и анализа лигирования по близости (PLA)39, подтвердив надёжное взаимодействие BMAL1–HIF2A на уровне отдельных молекул в условиях гипоксии. При этом также было обнаружено связывание BMAL1–HIF1A, хотя и на значительно более низком уровне (рис. 2d–f). N-концевые участки BMAL1 и HIF2A, содержащие консервативные домены bHLH и PAS-A/B, обеспечивают димеризацию партнёров8,⁴⁰ (рис. 2g), а их С-концевые трансактивационные домены обеспечивают активацию транскрипции⁴⁰. Анализ методом нокдауна с использованием рекомбинантных BMAL1 и HIF2A продемонстрировал прямое связывание между их N-концевыми участками (рис. 2h). Хроматография с эксклюзионной хроматографией подтвердила образование стабильного гетеродимера BMAL1–HIF2A (дополнительные данные, рис. 2c, d). Несмотря на 67-процентное сходство последовательностей N-концевых участков HIF1A и HIF2A, BMAL1 связывается с HIF1A значительно слабее (рис. 2h). Эти результаты демонстрируют специфическое и прямое взаимодействие между BMAL1 и HIF2A в условиях гипоксии.



Fig. 2: HIF2A interacts with BMAL1 and regulates circadian variations in myocardial injury.

a, Predicted interactions of BMAL1 with bHLH-PAS transcription factors in the human LV using the HuRI. b,c, Co-IP analysis (b) and quantification (c) of BMAL1–Flag in HEK293 cells. n = 3 independent experiments. Cyto., cytoplasmic fraction; nuc., nuclear fraction. d, Co-IP analysis of HIF2A in HCMs. n = 3 independent experiments. e,f, PLA (e) and quantification (f) showing BMAL1–HIF2A interactions in HCMs. White arrows indicate the close interaction between BMAL1–HIF2A or BMAL1–HIF1A in the nuclei. Scale bar, 25 µm. n = 20 (BMAL1–HIF2A and BMAL1–HIF1A) and n = 10 (negative control). g, Schematic of BMAL1 and HIF2A protein domains. h, Flag pull-down of BMAL1. n = 3 independent experiments. i,j, Western blot analysis (i) and quantification (j) of nuclear BMAL1 and HIF2A levels in the AAR of C57BL/6J mice after 2 h reperfusion at ZT8 or ZT20. n = 3 mice per group per timepoint. Owing to similar molecular masses of proteins, the samples were run on separate gels, with TBP as the sample processing control. k, Immunofluorescence analysis of BMAL1 and HIF2A colocalization in the border zone on day 1 after MI, shown in merged images (yellow, white arrows). Scale bars, 25 µm. n = 3 mice per group per timepoint. l–o, Hif2aloxP/loxP myosin-Cre+ mice and myosin-Cre+ mice were subjected to IRI at ZT8 or ZT20. Evan’s blue and TTC-stained heart slices (l; scale bar, 1 mm), AAR as the percentage of LV (m), infarct size as the percentage of the AAR (n) and serum troponin I levels (o) after 2 h reperfusion are shown. n = 8 mice per group per timepoint. p–s, Cardiac function by day 14 after MI. p, The EF and FS. q, The GLS. r, LV 3D and six-segment longitudinal strain images. s, Intraventricular dyssynchrony. For p–s, n = 8 (Hif2aloxP/loxP myosin-Cre+) and n = 9 (myosin-Cre+) mice per timepoint. Data are mean ± s.e.m. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA (c) and two-way ANOVA (f,j,m–q and s).

Хотя хорошо известно, что HIF2A защищает сердце от инфаркта миокарда^16,28,41, его роль в суточном повреждении сердца остается неясной. Через 2 часа реперфузии уровень белка HIF2A заметно стабилизировался в ядерной фракции AAR в ZT8, но не в ZT20, что соответствует экспрессии BMAL1 (рис. 2i, j), это указывает на зависимость реакции миокарда на гипоксию от времени суток. На следующий день после инфаркта миокарда иммунофлуоресценция выявила значительно более высокий уровень HIF2A в цитоплазме и ядрах кардиомиоцитов в пограничной зоне (ишемизированной области) на уровне ZT8 по сравнению с уровнем ZT20, в то время как в отдалённом миокарде экспрессия оставалась низкой (дополнительные данные, рис. 3a–c). BMAL1 демонстрировал аналогичную суточную картину ядерной локализации (дополнительные данные, рис. 3d, e), при этом его совместная локализация с HIF2A в пограничной зоне ZT8 была значительно выше (рис. 2k), что указывает на циркадную регуляцию их взаимодействия. Чтобы выяснить функциональную роль HIF2A в циркадном повреждении миокарда, мы использовали модель индуцибельного нокаута Hif2a в кардиомиоцитах (Hif2a^loxP/loxP myosin-Cre+)^16,41. Как и у мышей с дефицитом Bmal1, у этих мышей наблюдалось отсутствие циркадно-зависимого повреждения сердца и снижение эндогенной кардиопротекции в ZT8 (рис. 2l–o). На 14-й день после инфаркта миокарда у мышей ZT8 Hif2a^loxP/loxP myosin-Cre+ по сравнению с контрольной группой наблюдалось ухудшение систолической функции, увеличение дилатации и массы левого желудочка, а также более выраженные нарушения движения стенок и внутрижелудочковые диспропорции (рис. 2p–s и дополнительная рис. 2d–f). Эти изменения отсутствовали в ZT20. Напротив, делеция Hif1a в кардиомиоцитах не повлияла на суточные колебания в повреждении миокарда (дополнительное изображение. 3a–k). Эти результаты указывают на избирательную роль специфичного для кардиомиоцитов HIF2A в регулировании суточной восприимчивости к IRI.

Затем, чтобы выяснить, как комплекс BMAL1–HIF2A влияет на суточные колебания повреждений миокарда, мы повторно проанализировали ранее опубликованные данные микроматричного анализа мышей Hif2a^loxP/loxP myosin-Cre+ и myosin-Cre+16. Среди потенциальных генов-мишеней HIF2A, которые уникально активируются у мышей myosin-Cre+ после IRI (рис. 3a и дополнительная таблица 9), Areg — известная мишень HIF2A и член семейства эпидермальных факторов роста^16,17 — продемонстрировал наибольшее суточное изменение в AAR на ZT8 по сравнению с ZT20 (рис. 3b и дополнительная таблица 10). Уровень белка AREG в цитозольных экстрактах соответствовал этой суточной динамике, достигая пика в 8 часов утра (рис. 3c, d). Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило повышенную экспрессию AREG в цитоплазме кардиомиоцитов в пограничной зоне в 8 часов утра, в то время как в инфарцированном и удалённом миокарде уровень был низким (рис. 3e, f и дополнительные данные на рис. 4a, b). Минимальная экспрессия AREG была обнаружена в фибробластах и гладкомышечных клетках (дополнительные данные на рис. 4c, d). Эта пространственно-временная закономерность согласуется с совместной локализацией BMAL1 и HIF2A в ядерной зоне ZT8 (рис. 2k), что позволяет предположить, что комплекс BMAL1–HIF2A управляет суточной индукцией Areg в ишемизированном сердце.



Fig. 3: Areg is a circadian-dependent target of the BMAL1–HIF2A heterodimer.

a, Heat map of the top 20 potential HIF2A targets. n = 4 mice per group. b–d, HIF2A targets (b) and AREG protein (western blot (c) and quantification (d)) in the AAR of C57BL/6J mice after 2 h reperfusion. n = 3 mice per group per timepoint. Owing to similar molecular masses of proteins, the samples were run on separate gels, with a-tubulin as the sample processing control. e,f, AREG immunostaining in the border zone on day 1 after MI (e; scale bars, 25 µm) and quantification (f). Arrows indicate a-sarcomeric+/AREG+ cells. n = 4 mice per timepoint. g–i, Synchronized HCMs were exposed to hypoxia (1% O2, 4 h) across circadian times (CT0–CT40); AREG mRNA expression (g) and BMAL1–HIF2A/AREG protein (h) and quantification (i) are shown. n = 3. j, Analysis of AREG mRNA in HEK293 cells transfected with various siRNAs and exposed to hypoxia. n = 3. k–m, The fold change in Areg mRNA transcripts (k), and western blot (l) and quantification (m) of cardiomyocyte AREG after 2 h reperfusion in the AAR of myosin-Cre+, Bmal1loxP/loxP myosin-Cre+ and Hif2aloxP/loxP myosin-Cre+ mice. n = 5 (transcripts) mice per group; and n = 5, 5 and 4 (proteins) mice. Statistical analysis was performed using unpaired two-tailed t-tests, with Welch’s t-tests comparing between myosin-Cre+ and Hif2aloxP/loxP myosin-Cre+ mice (protein). n,o, Surface plasmon resonance analysis of BMAL1–HIF2A binding to HRE (n) or E-box (o). n = 3. p, Conserved BMAL1–HIF2A-binding site (CAGGTG) on the AREG promoter. q, ChIP–qPCR analysis of HIF2A binding in HEK293 cells at this shared site at CT20 or CT32. n = 5. r, Co-IP analysis of HIF2A–BMAL1 interactions in HCMs at CT20/CT32. n = 3. s, ChIP–qPCR analysis of HEK293 cells for HIF2A (n = 13) and BMAL1 (n = 12 (normoxia) and n = 11 (hypoxia)). t, Luciferase assays of hAREG promoter activation in HEK293 cells. n = 4. All of the samples are biologically independent. Data are mean ± s.e.m. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA (g,i,j and t), two-way ANOVA (b,d,q), unpaired two-tailed t-tests (f) and two-sided Mann–Whitney U-test (s).

Чтобы оценить роль внутренних молекулярных часов клетки в регуляции AREG, синхронизированные кардиомиоциты человека подвергались воздействию гипоксии (1 % O₂, 4 часа) в разное время суток (с 00:00 до 40:00). 00:00 соответствует началу циркадного цикла in vitro, то есть началу светлой фазы в системах, синхронизированных со светом. При нормоксии уровень транскрипции AREG не был ритмичным, но гипоксия значительно повышала уровень AREG в 32-й час (аналогично ZT8), при этом в 20-й час повышение было гораздо слабее (рис. 3g). Эта закономерность отражала ритмичную экспрессию комплекса BMAL1–HIF2A в кардиомиоцитах (рис. 3h, i), что указывает на циркадную зависимость и гипоксическую регуляцию AREG. Подавление HIF2A или BMAL1 с помощью малой интерферирующей РНК (миРНК) значительно снижало экспрессию AREG, вызванную гипоксией, в то время как нокдаун CLOCK, HIF1A или HIF1B не оказывал никакого эффекта (рис. 3j). Кроме того, экспрессия Areg в миокарде, вызванная IRI, была заметно снижена в кардиомиоцитах мышей с дефицитом Bmal1 или Hif2a (рис. 3k–m). В совокупности эти результаты указывают на то, что комплекс BMAL1–HIF2A является ключевым регулятором ритмической индукции AREG как при гипоксии, так и при ишемическом повреждении миокарда.

Чтобы выяснить, как гетеродимер BMAL1–HIF2A регулирует AREG, мы изучили его ДНК-связывающие свойства и потенциальную синергию транскрипции в условиях гипоксии. Комплексы HIF2A–HIF1B и BMAL1–CLOCK связываются с элементами реакции на гипоксию (HREs, [A/G]CGTG)40 и мотивами E-box (CACGTG)⁸, соответственно, которые имеют заметное сходство последовательностей. Анализ изменения электрофоретической подвижности (дополнительная фиг. 3l) и анализ поверхностного плазмонного резонанса (рис. 3n,o) продемонстрировали надежное и сопоставимое связывание гетеродимера BMAL1–HIF2A с обоими мотивами, подтверждая его способность распознавать элементы ДНК генов-мишеней. Анализ промотора AREG человека с использованием JASPAR (https://jaspar.elixir.no/; v.2022) выявил консервативный сайт связывания (CAGGTG) для BMAL1 и HIF2A у разных видов (рис. 3p). Иммунопреципитация хроматина с последующей количественной ПЦР (ChIP–qPCR) в клетках сердечной мышцы человека подтвердила значительное обогащение эндогенного HIF2A в этом участке при гипоксии в 32-м часе, но не в 20-м (рис. 3q), что указывает на циркадную регуляцию транскрипционной активности HIF2A. Это открытие согласуется с циркадным взаимодействием BMAL1–HIF2A, пик которого приходится на 32-й час (рис. 3r) и соответствует усиленной индукции AREG (рис. 3g). Дополнительная чип–ПЦР подтвердила прямое связывание BMAL1 с тем же консервативным участком во время гипоксии (рис. 3). Чтобы оценить функциональное взаимодействие между BMAL1 и HIF2A на уровне хроматина, консервативную последовательность клонировали в люциферазу-репортер и трансфицировали в клетки HEK293. Оба белка усиливали активность люциферазы, причем совместная трансфекция давала синергетический эффект и усиливала активацию (рис. 3т). Эти результаты показывают, что BMAL1 и HIF2A функционируют как единая регуляторная единица, синергетически стимулируя ритмичную транскрипцию AREG во время гипоксии.

Чтобы определить, влияет ли AREG непосредственно на циркадные колебания при повреждении миокарда, мы проанализировали его роль с помощью моделей генетического удаления. Как и у мышей с дефицитом Bmal1 и Hif2a, у мышей с дефицитом Areg наблюдалась потеря циркадных колебаний при повреждении миокарда и снижение эндогенной кардиопротекции в ZT8 после 2 часов реперфузии (рис. 4a–e). Суточные колебания долгосрочных показателей, включая сердечную функцию, размер и массу левого желудочка, сегментарные нарушения движения стенок и внутрижелудочковую синхронность, наблюдаемые у мышей дикого типа (WT), к 14-му дню после инфаркта миокарда полностью отсутствовали у мышей Areg-/- (рис. 4f, g и дополнительные рис. 4a–d). Окрашивание с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL), которое выявляет двухцепочечные разрывы ДНК как маркер апоптоза, показало значительное усиление апоптоза кардиомиоцитов в пограничной зоне у мышей Areg-/- в ZT8 по сравнению с мышами дикого типа, при этом в ZT20 наблюдались минимальные различия (рис. 4h, i). Эти результаты указывают на функциональную роль AREG в регуляции повреждений сердца, зависящих от времени суток.



Fig. 4: AREG drives circadian-dependent cardioprotection.

a, Schematic of myocardial injury and cardiac function assessment in Areg-/- mice and WT mice subjected to IRI at ZT8 or ZT20. b, Heart slices were stained with Evan’s blue and TTC after 2 h reperfusion. Scale bar, 1 mm. c, The AAR as a percentage of the LV. d, The infarct size as a percentage of the AAR. n = 7 mice per group per timepoint. e, Serum troponin I levels. n = 8 mice per group per timepoint. f,g, Cardiac function on day 14 after MI was determined using STE. f, The EF and GLS. g, B-mode images with 2D longitudinal strain. 1, anterior base; 2, anterior middle; 3, anterior apex; 4, posterior apex; 5, posterior middle; 6, posterior base. n = 8 mice per group per timepoint. h,i, TUNEL staining in the border zone on day 1 after MI (h; scale bar, 25 µm) and quantification (i). White arrows point out TUNEL-positive (green) cardiomyocyte (red) nuclei (blue). n = 4 mice per group per timepoint. j, Schematic of the cardiac injury and function assessment in AREG-treated or vehicle (veh.)-treated mice subjected to IRI at ZT8 or ZT20. Treatment was initiated at reperfusion and continued daily for 3 days. k,l, AREG protein in the AAR (k) with quantification (l). n = 3 mice per group per timepoint. m–p, Evan’s blue- and TTC-stained heart slices (m, scale bar, 1 mm), the AAR as a percentage of the LV (n), the infarct size as a percentage of the AAR (o) and serum troponin I levels (p) after 2 h reperfusion. n = 7 mice per group per timepoint. q,r, Cardiac function on day 14 after MI. q, The EF, FS and GLS. r, LV 3D images with six-segment longitudinal strain. n = 7 mice per group per timepoint. s,t, TUNEL staining in the border zone. The percentage of TUNEL-positive cells (s) and representative images (t) are shown. White arrows indicate TUNEL-positive (green) cardiomyocyte (red) nuclei (blue). Scale bar, 25 µm. n = 5 (veh., ZT8), n = 4 (veh., ZT20), n = 5 (AREG, ZT8) and n = 5 (AREG, ZT20). All data are mean ± s.e.m. For c–f,i,l,n–q and s, statistical analysis was performed using two-way ANOVA. The diagrams in a and j were created using BioRender.

Учитывая важнейшую роль AREG в модуляции циркадных повреждений, мы оценили его терапевтический потенциал с помощью экзогенного введения и генотерапии. Чтобы смоделировать клинический сценарий лечения с помощью реперфузии, мышам C57BL/6J вводили рекомбинантный AREG (10 мкг) или плацебо в начале реперфузии. Своевременное введение AREG повышало уровень белка AREG в зоне инфаркта (рис. 4j–l) и значительно уменьшало размер инфаркта и уровень тропонина I в сыворотке крови через 2 часа после реперфузии. Примечательно, что защита была более выраженной при ZT20, что потенциально компенсировало более низкий уровень эндогенного AREG в то время (рис. 4m–p). Кроме того, AREG (10 мкг), вводимый ежедневно в течение 3 дней после повреждения при ZT20, улучшал систолическую функцию левого желудочка, уменьшал ремоделирование сердца, восстанавливал сегментарную сократимость и нормализовал кинезис к 14-му дню после инфаркта миокарда по сравнению с контрольной группой, получавшей плацебо (рис. 4q, r и дополнительные рис. 4e–h). Окрашивание по методу TUNEL на 1-й день после инфаркта миокарда выявило значительное снижение апоптоза кардиомиоцитов в пограничной зоне у мышей ZT20 (рис. 4s, t). Чтобы дополнительно оценить терапевтический потенциал препарата, мы использовали аденоассоциированный вирус серотипа 9 (AAV9) для доставки гена Areg под промотором креатинкиназы мышц (MCK) для специфического воздействия на кардиомиоциты. Инъекция Areg-AAV в хвостовую вену (2 х 10¹¹ геномных копий на мышь) значительно повысила уровень AREG в сердце к 28-му дню при минимальной экспрессии вне целевого органа (дополнительный рис. 5a–e). Это вмешательство уменьшило размер инфаркта и улучшило работу сердца, особенно в ZT20 (дополнительный рис. 5f–n). Эти результаты позволяют считать AREG перспективной терапевтической мишенью для вмешательств, оптимизированных по времени, и предлагают стратегии использования циркадных ритмов для улучшения защиты сердца.

Чтобы изучить возможности применения модуляции циркадных ритмов для кардиопротекции, мы использовали nobiletin (NOB) — флавоноид, который усиливает циркадные ритмы за счёт прямой активации RORs⁴², ключевых активаторов транскрипции Bmal1^10,20. Лечение NOB у мышей C57BL/6J (200 мг на кг, внутрибрюшинно) значительно повышало RORα, что приводило к 60-80-кратному увеличению мРНК Bmal1 и 2-3-кратному увеличению уровней белка как в ZT8, так и в ZT20, в конечном итоге вызывая усиление регуляции AREG в сердце (расширенные данные Рис. 5a–d). Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил повышенное содержание ядерного BMAL1 и цитоплазматического AREG в кардиомиоцитах в пограничной зоне на 1-й день после MI (расширенные данные, рис. 5е,f). Лечение NOB значительно ослабляло острое повреждение миокарда, улучшало долгосрочную сердечную функцию и снижало апоптоз кардиомиоцитов, при этом более выраженная защита наблюдалась при ZT20 (расширенные данные на фиг. 5g–n), вероятно, из-за его способности компенсировать естественный спад ядерной экспрессии BMAL1 и транскрипционной активности в это время ^10,11,20. Чтобы определить, зависят ли кардиопротекторные эффекты NOB от пути BMAL1–HIF2A–AREG, мы оценили его эффективность на моделях генетического нокаута. Кардиопротекция была полностью отменена у мышей с дефицитом Hif2a, получавших NOB, о чем свидетельствуют большие размеры инфаркта и значительное нарушение сердечной функции (дополнительный рисунок. 6a–h). Аналогичным образом, лечение NOB не дало результатов у мышей Bmal1^loxP/loxP, содержащих миозин-Cre+ (дополнительная фиг. 6i–o) и мышей Areg-/- (дополнительное изображение 6p–u), что подтверждает важную роль этого пути. Чтобы дополнительно оценить преимущества сверхэкспрессии BMAL1, мы использовали AAV9 для доставки Bmal1 непосредственно в кардиомиоциты (дополнительное изображение 7a–e). Сверхэкспрессия BMAL1 значительно уменьшила размер инфаркта и улучшила работу сердца, при этом наибольшая защита наблюдалась на ZT20 (дополнительное изображение 7f–o). Эти эффекты аналогичны тем, что наблюдаются при лечении нитрозомочевиной, что подчёркивает терапевтический потенциал активации BMAL1 в ослаблении повреждений миокарда и способствует разработке фармакологических стратегий, нацеленных на циркадные ритмы.

Чтобы изучить терапевтический потенциал активации HIF2A при повреждении миокарда, мышам C57BL/6J вводили vadadustat, ингибитор домена пролилгидроксилазы (PHD)¹⁵ (50 мг/кг, внутрибрюшинно, ежедневно в течение 3 дней) в ZT8 или ZT20. Вададустат избирательно стабилизировал HIF2A, особенно на уровне ZT8, не влияя на уровни HIF1A (расширенные данные на рис. 6a–d), что, возможно, связано с циркадной регуляцией активности фермента phd31. Эта стабилизация значительно уменьшила размеры инфаркта и улучшила сердечную функцию у мышей, получавших ZT8, что указывает на кардиозащиту, зависящую от времени (расширенные данные на рисунке. 6e–n). Анализ с использованием co-IP выявил повышенное связывание BMAL1–HIF2A в ядерной фракции AAR в ZT8, сопровождающееся повышенной экспрессией AREG в кардиомиоцитах в пограничной зоне после 3 ч реперфузии (Расширенные данные на рисунке. 6o–r). Эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействие BMAL1–HIF2A и синергическая индукция AREG лежат в основе циркадно-зависимой кардиопротекции, обеспечиваемой вададустатом в ZT8. Чтобы подтвердить этот механизм, лечение вададустатом было оценено на мышах с дефицитом Bmal1, которые показали отмену кардиопротекции при ZT8, что указывает на BMAL1-зависимый механизм (дополнительная рис. 8а–г). Аналогичная потеря защиты наблюдалась у мышей с дефицитом Hif2a и Areg, что еще раз подтверждает важную роль пути BMAL1-HIF2A-AREG (дополнительная фиг. 8h–s). Кроме того, у мышей с нокаутом человеческого HIF2A в кардиомиоцитах (LSL-HIF2dPA myosin-Cre+) наблюдалась аналогичная циркадная зависимость стабилизации HIF2A и повышенная индукция Areg в ZT8 в сердцах мышей (дополнительное изображение 9a–c). Как и при лечении вададустатом, сверхэкспрессия HIF2A значительно уменьшала размер инфаркта и улучшала сердечную функцию, причём наиболее заметный эффект наблюдался в ZT8 (дополнительное изображение 9d–m). Эти результаты подчёркивают терапевтический потенциал стабилизации HIF2A в зависимости от времени суток для усиления кардиопротекции, что открывает путь для новых методов хронотерапии.

Циркадно-зависимая стабилизация HIF2A наблюдалась после инфаркта миокарда, гипоксии, введения вададустата и у кардиомиоцит-специфичных мышей с нокаутом по HIF2A (рис. 2i,j, 3h,i, расширенные данные Рис. 6a-d и дополнительные рис. 9a,b). Это позволяет предположить, что гены часов могут регулировать экспрессию HIF2A.. Однако анализы RNA-seq и qPCR не выявили циркадных изменений в транскриптах Hif2a после IRI у людей и мышей (расширенные данные на фиг. 7a–c). У мышей с дефицитом Bmal1 уровень ядерного белка HIF2A был снижен без изменений в транскриптах Hif2a, в то время как обработка NOB дополнительно стабилизировала белок HIF2A как в ZT8, так и в ZT20, опять же без влияния на уровень транскриптов (дополнительные данные, рис. 7d–k). Эксперименты по усилению и ослаблению функции в клетках сердечной мышцы подтвердили эти результаты, указывая на механизм пост-трансляционной регуляции (дополнительные данные, рис. 7l–q). Анализ методом ChIP–qPCR предполагаемых элементов E-бокса в промоторе HIF2A не выявил связывания BMAL1, что позволяет предположить, что BMAL1 не регулирует транскрипцию HIF2A напрямую (рис. 7r в дополнительных материалах). Вместо этого анализ с использованием циклогексимида (CHX) показал, что BMAL1 увеличивает период полураспада белка HIF2A, снижая его убиквитин-опосредованную деградацию (рис. 7s–x в дополнительных материалах). Примечательно, что BMAL1 не влияет на стабильность белка HIF1A. Эти результаты указывают на роль BMAL1 в стабилизации HIF2A посредством пост-трансляционных механизмов, что позволяет понять, как циркадные ритмы модулируют гипоксическую реакцию при повреждении миокарда.

Учитывая взаимодействие BMAL1 с HIF2A, мы оценили его влияние на комплекс HIF2A–HIF1B, который опосредует каноническую передачу сигналов при гипоксии. Анализ РНК-секвенирования образцов биопсии ишемизированного левого желудочка у пациентов и мышей с аутосомно-рецессивным артериосклерозом не выявил суточных колебаний уровня транскрипции Hif1b (рис. 8a, b в дополнительных материалах). Эксперименты по усилению и потере функции у мышей и кардиомиоцитов человека подтвердили, что BMAL1 не регулирует уровень транскрипции или белка HIF1B во время ишемического повреждения или гипоксии (рис. 8c–n в дополнительных материалах). Совместный IP-анализ показал, что сверхэкспрессия BMAL1 не влияет на связывание HIF2A–HIF1B, в то время как ChIP–qPCR не выявил изменений в связывании HIF1B с промотором эритропоэтина (EPO)⁴³ (Расширенные данные на фиг. 8o–q). Кроме того, не было обнаружено, что HIF1B связывается с промотором AREG, а люциферазные репортёрные анализы подтвердили, что BMAL1 не влияет на транскрипционную активность комплекса HIF2A–HIF1B в PGK1 (рис. 8r, s в дополнительных данных). Эти результаты показывают, что BMAL1 взаимодействует с HIF2A, не нарушая работу канонического комплекса HIF2A–HIF1B, что подчёркивает его особую роль в циркадной регуляции гипоксических реакций.

Хотя сообщалось о взаимодействии между BMAL1 и HIF2A^38,44,45, структурная информация об их гетеродимеризации остается неясной. Чтобы определить структуру с помощью одночастичного крио-ЭМ, мы экспрессировали и очищали N-концевые участки BMAL1 и HIF2A, включая домены bHLH и PAS, связанные с ДНК длиной 22 п.о., содержащей канонический элемент HRE (рис. 2g, расширенные данные на рис. 2). 9а и дополнительную таблицу 11). После двумерной (2D) и трёхмерной (3D) классификации около 43 000 отполированных частиц были обработаны для 3D-уточнения, в результате чего была получена карта плотности со средним разрешением 3,6 Е (рис. 5a и дополнительные данные, рис. 9b–h). Вкратце, HIF2A показал лучшее общее разрешение по сравнению с BMAL1, вероятно, благодаря своей компактной структуре и стабилизации с помощью BMAL1. Атомная модель связанного с ДНК гетеродимера была построена на карте плотности с использованием структур BMAL1 и HIF2A из комплексов BMAL1–CLOCK8 и HIF2A–HIF1B40 в качестве шаблонов соответственно (рис. 9i, j в дополнительных данных и дополнительная таблица 11).



Fig. 5: Structural analysis of the BMAL1–HIF2A heterodimer in a complex with DNA.

a, Cryo-EM map of the BMAL1–HIF2A–DNA complex. The map was sharpened using DeepEMhancer. HIF2A and BMAL1 are coloured in purple and red, respectively, with two HRE DNA strands in green and yellow. b, The overall structure of the BMAL1–HIF2A–DNA complex. c, Individual structures of HIF2A and BMAL1 within the complex. d, The four major interfaces (I to IV) between HIF2A and BMAL1. Interaction residues in BMAL1 (red) and HIF2A (purple) are shown; the BMAL1 residues mutated for pull-down analysis in e are shown in magenta. e, Pull-down analysis showing impaired interaction between GST–HIF2A and Flag-tagged BMAL1 mutants. Mutations in the bHLH, PAS-A and PAS-B domains of the BMAL1 are indicated. n = 3 independent experiments. f, The relative binding of BMAL1 mutants compared with WT BMAL1, with WT BMAL1 binding to HIF2A set to 1. n = 3 independent experiments. g, HEK293 cells overexpressing WT or mutated Flag-tagged BMAL1 were exposed to ambient hypoxia (1% O2) for 4 h, followed by IP with Flag and blotted with the indicated antibodies. n = 3 independent experiments. h, Quantification of the relative binding in g. n = 3 independent experiments. i, HEK293 cells were transfected with either WT or mutant BMAL1 along with a HIF2A vector. A luciferase reporter assay was performed to evaluate transcriptional activation by the BMAL1–HIF2A complex of the AREG promoter, which contains a shared binding site. n = 4 independent experiments. For f,h and i, data are mean ± s.e.m. j, Schematic illustrating the substantial structural rearrangement of BMAL1 (red) when accommodating various partners to be involved in different pathways. The PAS domains of BMAL1 (red) bend towards nearly opposite direction and position separately when intertwining with HIF2A (purple). Statistical analysis was performed using one-way ANOVA (f, h and i). The diagram in j was created using BioRender.

В структуре BMAL1 и HIF2A имеют различную архитектуру (рис. 5b). HIF2A имеет компактную конформацию, в которой домен PAS-A соединяет домены bHLH и PAS-B, в то время как соответствующие домены в BMAL1 расположены более свободно и не имеют междоменных контактов (рис. 5c). BMAL1 использует свои домены bHLH и PAS для взаимодействия с соответствующими доменами HIF2A, образуя четыре основных интерфейса (с I по IV) (рис. 5d и дополнительные данные, рис. 10a, b). Подобно классическим факторам транскрипции bHLH, гетеродимер BMAL1–HIF2A связывается с ДНК через две альфа-спирали H1 и h1, отходящие от их доменов bHLH и вставляющиеся в большую бороздку⁴⁶ (дополнительные данные, рис. 10c). Из-за небольшой подвижности плотность оснований ДНК на карте не очень хорошо различима.

Примечательно, что структура BMAL1, связанного с HIF2A, значительно отличается от структуры его комплекса с CLOCK8, в котором PAS-домены BMAL1 плотно прилегают друг к другу (рис. 10d в дополнительных материалах). Напротив, в структуре BMAL1–HIF2A PAS-домены BMAL1 расположены отдельно и образуют конформацию, аналогичную той, что наблюдается у HIF1B в его комплексе с HIF2A. Конформационное сходство между BMAL1 и HIF1B, вероятно, обусловлено значительной идентичностью их последовательностей (44 %) в N-концевой области, где сохраняются несколько остатков, участвующих в связывании с HIF2A (рис. 10d в дополнительных материалах и рис. 10 в дополнительных материалах). Поскольку комплексы BMAL1–CLOCK и BMAL1–HIF2A связываются с ДНК через свои bHLH-домены, мы наложили bHLH-домен BMAL1 на другие и обнаружили, что его PAS-домены изгибаются почти в противоположных направлениях. Аналогичным образом наложение PAS-A-доменов BMAL1 выявляет конформационную вариативность в bHLH- и PAS-B-доменах (рис. 10e, f в дополнительных данных). Эти структурные сравнения позволяют предположить, что BMAL1 претерпевает значительные конформационные изменения, чтобы взаимодействовать с разными партнёрами (дополнительное видео 1). Примечательно, что белки с доменами PAS в семействе bHLH обычно образуют альфа-бета-димеры⁴⁷. В структуре BMAL1–HIF2A два домена PAS-B образуют открытый альфа-бета-димер, при этом консервативный Trp427 в BMAL1 взаимодействует с Met250 в HIF2A, стабилизируя димер PAS-B (рис. 10d в дополнительных данных). Однако неясно, позволяет ли это взаимодействие HIF2A связываться с другими факторами, подобно взаимодействию PAS-B между CLOCK и CRY^18,48.

Чтобы подтвердить наши структурные наблюдения, мы мутировали консервативные остатки в каждом домене BMAL1. Эти мутации нарушили формирование комплекса BMAL1–HIF2A как in vitro, так и в клетках HEK293 в условиях гипоксии, что подчёркивает важную роль каждого домена в стабильности гетеродимера (рис. 5e–h). С помощью люциферазного репортёрного анализа с использованием человеческого репортёра AREG-gluc, содержащего общую последовательность связывания (CAGGTG), мы обнаружили, что мутанты BMAL1 значительно снижают трансактивацию BMAL1–HIF2A на промоторе AREG, что подчёркивает важность правильной гетеродимеризации для индукции AREG (рис. 5i). В совокупности наше исследование раскрывает структурную основу связанного с ДНК гетеродимера BMAL1–HIF2A, подчёркивая его роль в регуляции генов-мишеней, таких как AREG, а также способность BMAL1 объединять различные пути посредством структурных перестроек для связывания с партнёром (рис. 5j).

Наше исследование подчёркивает ключевую роль гетеродимера BMAL1–HIF2A в обеспечении циркадной кардиопротекции. Этот вывод подтверждается убедительными доказательствами, в том числе криоэлектронно-микроскопической структурой, суточным взаимодействием между BMAL1 и HIF2A в условиях гипоксии и во время инфаркта миокарда, их функциональной ролью в синергетической трансактивации AREG и их взаимозависимостью в обеспечении циркадной кардиопротекции. Однако мы не можем с уверенностью утверждать, что гетеродимеризация BMAL1–HIF2A является истинным механизмом, регулирующим зависимость повреждения миокарда от времени суток. Хотя наши результаты показывают, что HIF1A в кардиомиоцитах не оказывает существенного влияния на циркадные колебания при повреждении миокарда, установленное взаимодействие между BMAL1 и HIF1A31,49 требует дальнейшего изучения того, влияют ли взаимодействия BMAL1–HIF1A в других клетках на циркадные колебания при повреждении миокарда. Кроме того, хотя мы и продемонстрировали, что BMAL1 усиливает транскрипционную активность HIF2A и стабилизирует его за счёт снижения убиквитинирования, точные механизмы остаются неясными. Например, неизвестно, регулирует ли BMAL1 напрямую гидроксилирование HIF или влияет на уровень HIF2A посредством альтернативных пост-трансляционных модификаций. Наконец, в этом явлении могут играть роль и другие молекулы циркадных ритмов, такие как PER2, а также их взаимодействие с HIF²⁷. Дальнейшее изучение этих механизмов может способствовать разработке хронотерапевтических стратегий для оптимизации вмешательств, нацеленных на HIF^13-15. Широкое распространение периферических молекулярных часов в различных типах клеток сердца²¹ подчеркивает необходимость определения тканеспецифических функций BMAL1 для скоординированной защиты сердца. Наша структура BMAL1–HIF2A–ДНК показывает, что BMAL1 способен претерпевать структурные изменения для связывания с неканоническим партнером, что обеспечивает взаимодействие между сигнальными путями. Это также создает молекулярную основу для разработки терапевтических средств, стабилизирующих это взаимодействие, что открывает возможности для лечения ишемической болезни сердца. Учитывая возможность интеграции циркадных ритмов в клиническую практику, необходимы проспективные исследования, чтобы оценить, может ли синхронизация лечения с циркадными фазами или прямое воздействие на циркадные ритмы улучшить состояние пациентов с инфарктом миокарда. Помимо инфаркта миокарда, циркадная модуляция гипоксических реакций может иметь более широкое значение для лечения других заболеваний, связанных с гипоксией и воспалением и имеющих циркадные характеристики, что потенциально открывает путь к терапевтическим инновациям, основанным на циркадных ритмах.