Наше знание взаимодействий между множественными генами и средовыми влияниями, которые предопределяют чувствительность индивидов к сложным полигенным нарушениям, всё ещё ограничены.

Inflammatory bowel diseases (IBDs) характеризуется хроническим воспалением кишечника. Пациенты страдают от болей в животе, диареи, лихорадки и потери веса. Двумя превалирующими формами этой болезни являются Crohn's disease (CD) и ulcerative colitis (UC). CD характеризуется воспалением, которое распространяется на всю толщину стенки кишечника. Воспаление при UC ограничивается слизистой толстого кишечника. В США показатель CD составляет приблизительно 4 пациента на 100,000, а показатель UC примерно 100 на 100,000. Хирургическое вмешательство и долговременное медикаментозное лечение обычно используются для терапии этих заболеваний.

Генетика, лежащая в основе IBD сложна; по крайней мере вовлечено 10 локусов чувствительности и высокий вклад средовых условий в риск заболеть. Ряд генных полиморфизмов ассоциирует с IBDs. Большинство этих генов участвует во врожденном иммунитете, системе, которая позволяет клеткам выявлять и отвечать на наличие микроорганизмов. Хотя причина IBD пока ещё не определена, но идентификация полиморфизмов по генами врожденного иммунного ответа подтверждает гипотезу, что IBD является результатом несоответствующей воспалительной реакции на кишечную микрофлору. Кишечник подвергается воздействию огромного числа микроорганизмов. Врожденная иммунная система управляет деликатной балансировкой между толерантностью доброкачественных симбионтных микроорганизмов и воспалительной реакцией на нежелательные патогены. При IBD баланс, по-видимому, сдвигается в направлении несоответствующего воспаления.

Т.к. идентификация инициального генного полиморфизма, ассоциированного с IBD, осуществляясь в большом количестве исследований. Здесь будут обсуждены три недавних исследования генных полиморфизмов. Они отражают сегодняшнее состояние клинических генетических исследований IBD и проливают свет на то, как генетика IBD скорее всего будет в дальнейшем использоваться в клинической практике.

The role of Toll-like receptor 4 Asp299Gly and Thr399ILe polymorphisms and CARD15/NOD2 mutations in the susceptibility and phenotype of Crohn's disease Brand et al. (2005) Inflamm Bowel Ds 11: 645-652

Brandt et al. сфокусировали свои исследования на нескольких рецепторах, которые выявляют присутствие ассоциированных с микроорганизмами молекул: TLR4 и CARD15/NOD2 (Fig. 1). Мутации CARD15/NOD2 ранее уже были ассоциированы с Crohn's disease (CD), но др. исследования, проверяющие TLR4 полиморфизм, выявили противоречащие результаты. Toll-like receptor TLR4 распознают присутствие lipopolysaccharide (LPS), компонента стенки грамм-отрицательных клеток. Эпителий кишечника экспрессирует низкие уровни TLR4 и является относительно нечувствительным к LPS; однако, при CD и UC, TLR4 усиливают свою активность. CARD15/NOD2 распознает внутриклеточное присутствие muramyl дипептида, который обнаруживается как в грамм-положительных, так и грамм-отрицательных бактериях. Полиморфизмы обоих генов были выявлены ещё раньше.

В своем исследовании Brand et al. использовали 204 пациентов с болезнью Crohn's и 199 здоровых людей. CD диагностировалась на базе клинической картины. Данные были собраны относительно возраста при установлении диагноза, поведения и локализации

Fig. 1. The role of inflammatory bowel disease (IBD) associated genes in the innate immune response. Molecules derived from microorganisms such as Escherichia coli are recognized by receptors on the cell surface (including TLR4 and CARD15/NOD2). They induce signalling pathways which ultimately lead to induction of innate immune response genes such as the cytokines. The cytokines act as secondary messengers which propagate a pro-inflammatory signal (pathogen response) or anti-inflammatory signal (to resolve inflammation or maintain tolerance).

болезни, связанных с болезнью осложнений и медикаментозного лечения. Участники контрольной группы были белые по происхождению и с тем же соотношением полов, что и в группе с CD пациентов. Участники были генотипированы по двум TLR4 аминокислотным полиморфизмам; Asp299Gly и Thr399Ile, используя аллель-специфическую polymerase chain reaction. Полиморфизмы CARD15/NOD2 (Arg702Trp, Gly908Arg, 1007fs) идентифицировали путем секвенирования экзонов 4, 8 и 11.

Сравнение TLR4 генотипов пациентов и контрольной группы выявили повышенное превалирование TLR4 Asp299Gly аллеля у индивидов с CD по сравнению с контролем (7.1 vs 3.9 %, p = 0.043, odds ratio = 1.95). Пропорция индивидов с др. TLR4 полиморфизмом, Thr399Ile, была выше среди пациентов с CD, чем в контроле, но различие не достигало уровня значимости (7.9 и 5% частота аллеля соотв., p = 0.13). Не выявлено индивидов, гомозиготных ни по одному из TLR4 аллелей.

Сравнение генотипа и проявлений болезни выявило ассоциацию между поведением болезни и генотипом TLR4. Поведение болезни оценивалось согласно Vienna классификации, которая классифицирует CD как non-stricturing, nonpenetrating (B1), stricturing (B2) или penetrating (B3). Индивиды с TLR4 Asp299Gly или Thr399Ile аллелем были более склонны к stricturing фенотипу (сужению участков кишечника), чем индивиды дикого типа (34.5 и 36.7% stricturing vs 17.1 и 16.7% stricturing у пациентов с аллелями TLR4 дикого типа, p = 0.04 and 0.02). Более не выявлено ассоциаций с характеристиками болезни.

Анализ фенотипа болезни в отношении комбинированного статуса TLR4/CARD14/NOD2 выявил сцепление TLR4⁺/NOD2^- генотипа (т.e. полиморфизм по TLR4, но статус дикого типа CARD15/NOD2) с stricturing фенотипом (47.4%). Пропорция индивидов с др. генотипами и с этим фенотипом бskf много ниже (10-21%).

Три исследования сообщили об ассоциации между Asp299Gly аллелем и CD, тогда как два др. не выявили ассоциации. Одно исследование идентифицировало ассоциацию между Thr399Ile аллелем и UC, но не с CD. Это было первое исследование, исследовавшее ассоциацию с определенным фенотипом болезни (stricturing) полиморфизмов по TLR4.

The role of cytokine gene polymorphisms in determining disease susceptibility and phenotype in inflammatory bowel disease Cantor et al. (2005) Am J Gastro 100: 1134-1142

Cantor et al. сконцентрировались на второй группе генов, которые имеют хорошо охарактеризованную роль в модуляции ответа тела на воспалительные стимулы: cytokines (Fig. 1). Предыдущие исследования продемонстрировали альтерации уровней различных цитокинов у пациентов и в мышиных моделях воспалительной болезни кишечника. Генные полиморфизмы, затрагивающие уровни экспрессии ряда из этих цитокинов, также хорошо охарактеризованы. На основании этой информации Cantor et al. сконцентрировали свои исследования на полиморфизмах, затрагивающих экспрессию tumour necrosis factor (TNF)-α, transforming growth factor (TGF)β, interferon (IFN)-γ, interleukin (IL)-10 и IL-6.

В исследовании было задействовано пациента с 193 inflammatory bowel disease (IBD) и 92 здоровых человек для контроля. Все пациенты и контрольная группа были белыми. Из IBD пациентов, 138 имели CD и 55 имели UC. Фиксировалась информация о поле, возрасте во время диагноза, семейной истории, выраженности болезни, реакция на кортикостероиды, реакция на azathioprine/6-mercaptopurine и количество хирургических вмешательств у каждого пациента. Выборки ДНК генотипировались по 9 различным SNPs: SNP-1082 (G/A), SNP-819 (T/C) и SNP-592 (A/C) в IL-10 промоторе; SNP-308 (G/A) в TNF-α, codon 10 (T/C) и codon 25 (G/C) сигнальной последовательности TGF-β; +874 (T/A) интрон 1 из IFN-α и SNP-174 (C/G) в IL-6 промоторе.

первоначальный анализ не выявил достоверных отличий между частотами cytokine SNP аллеля, наблюдаемыми в контроле, при IBD, у UC или CD индивидов. Эти данные затем были проанализированы в отношении клинического фенотипа. Наблюдались достоверные отличия между местом болезни у CD пациентов с разными SNP-174 IL-6 генотипами. Индивиды с ileal CD обнаруживали большую склонность иметь GC генотип, чем nonileal CD пациенты (p = 0.0004). Индивиды с ileocolonic CD были более склонны иметь GG генотип по сравнению с nonileocolonic CD пациентами (p = 0.006). Индивиды с colonic CD были более склонны иметь генотип CC по сравнению с nonileocolonic CD пациентами (p = 0.032). Др. достоверных отличий не наблюдалось (p менее 0.01). Предыдущие исследования, которые оценивали роль этих цитокиновых генотипов на IBD фенотип дали варьирующие результаты. TGF-β и IL-6 полиморфизмы не были ассоциированы с чувствительностью к IBD; однако, др. исследования показали конфликтующие результаты с TNF-α-308A аллелем (некоторые обнаруживали увеличение или снижение у IBD пациентов, тогда как др. не обнаруживали изменений) и с IL-10-1082G аллелем (отсутствие изменений или увеличение у пациентов с IBD). Ранее не было идентифицировано взаимоотношений между SNP-174 IL-6 статусом и статусом IBD или клиническим фенотипом.

Variants of CARD15 are associated with an aggressive clinical course of Crohn's disease - an IG-IBD study Annese et al. (2005) American Journal of Gastroenterology 100: 84-92

В исследовании Annese et al. была изучена большая когорта CD и UC пациентов, которые были собраны по всей Италии в соотв. с программой IG-BID (Italian group for the inflammatory bowel disease). Эти пациенты (316 с CD и 408 с UC) белыми итальянцами, включали индивидов со спорадическими и семейными случаями inflammatory bowel disease (IBD). Также было изучено 465 здоровых первой степени родства родственников пациентов с семейной IBD patients, 194 родителей в случае спорадичных IBD и 205 здоровых не родственных людей.

Исследователи проверяли наличие полиморфизмов по гену CARD15/NOD2. Три полиморфизма наиболее четко ассоциируемых с CD были генотипированы (R702W, G908R и L1007finsC). Генотипирование производилось с использованием секвенирования.

Мутации CARD15/NOD2 обнаруживали достоверное повышение частоты у пациентов с CD по сравнению со здоровым контролем. Это было достоверным как для спорадических, так и семейных случаев CD, за исключением аллеля R207W, который наблюдался с высокой частотой только в семейных случаях. По крайней мере 1 аллель риска обнаруживался в 36% спорадических случаев CD (OR = 3.1, p = 0.000001) и в 41% семейных случаев (OR = 3.9, p = 0.000001) по сравнению с 15% в контролях. Компаундные гетерозиготы и гомозиготы имели значительно более высокий риск CD (ORs of 16 and 18, p = 0.0004 и 0.0003, соотв.). Не выявлено достоверных ассоциаций между CARD15/NOD2 мутациями и UC.

CARD15/NOD2 мутации при болезни Crohn's достоверно ассоциировали с определенными клиническими параметрами болезни. Имелся один или два аллелей риска, ассоциированных с диагностикой в раннем возрасте, ileal локализацией, стенозирующей болезнью, с предыдущей resective хирургией, присутствием anti-Saccharomyces cerevisiae антител и perianal болезнью. Большинство ассоциаций было обусловлено присутствием G908R и L1007finsC аллелей. Не выявлено достоверных корреляций между UC пациентами, несущими, по крайней мере, один аллель риска и какими-либо клиническими параметрами болезни.

Интересно, что генотипирование здоровых родственников пациентов с IBD выявило 16, которые несли по два аллеля риска (9 гомозигот, 7 компаундных гетерозигот). 15 из 16 были родственниками пациентов CD. 14 из этих индивидов затем были расспрошены по телефону относительно возможных симптомов IBD. Все были здоровы и не имели симптомов.

Как это согласуется с др. исследованиями? CARD15/NOD2 ассоциации с CD (но не с UC) хорошо известны и пропорция пациентов CD с CARD15/NOD2 полиморфизмами сходна с таковой в др. исследованиях белых. Относительный риск, связанный с полиморфизмами по одному или двум аллелям, сравним в этих исследованиях. Клинические параметры, связанные с CARD15/NOD2 полиморфизмами также исследовались и др. и сходные ассоциации были обнаружены с ileal локализацией, стенозирующей болезнью, resective хирургией и диагностикой болезни в юном возрасте. Предыдущие результаты ассоциации anti-S. cerevisiae антител с CD были противоречивыми.

Что могут извлечь клинические генетики из этих исследований? В каждом из трех исследований были изучены определенные наборы аллелей, наблюдались определенные ассоциации и не наблюдалось со статусом болезни IBD и фенотипом.

Во-первых, важно учесть низкую воспроизводимость исследований генотип:фенотип. Это хорошо известная проблема. Причины этого могут варьировать, но проблемы воспроизводимости могут возникать из-за склонности публиковать только позитивные ассоциации, из-за неадекватности размеров выборок (что не позволяет оценить первоначальные исследования - фальшивые отрицательные)и из-за неспособности оценить вероятность результата (особенно при множественных статистических тестах). Эти результаты необходимо рассматривать в этом контексте. Это особенно важно для клинической практики, где решения принимаются по реальным данным.

Тем не менее пригодная для клинических генетиков информация всё-таки может быть извлечена из этих данных. В частности, ассоциации CARD15/NOD2 полиморфизмов с CD, описанные Annese et al., теперь продемонстрированы в ряде исследований и он является без сомнения генетическим фактором. ассоциированным с CD. Обширные исследования, такие как итальянские, также важны, т.к. выявляют достоверные популяционные различия частот мутаций CARD15/NOD2. Хотя частоты мутаций CARD15/NOD2 в целом высокие вреди белых CD пациентов, их превалирование у Scandinavian, Irish и Scottish CDпациентов. по-видимому, значительно ниже. CARD15/NOD2 полиморфизмы ещё не были идентифицированы у японцев, китайцев или в популяциях американских африканцев. Роль полиморфизмов по др. генам, описанных здесь при IBD установлен не впервые. Конфликтующие сообщения связаны с ассоциацией TLR4 и чувствительностью к IBDs. Ассоциации, наблюдаемые между различными TLR4 и IL-6 полиморфизмами и фенотипом болезни интересны и могут иметь клиническое использование, но необходимы дальнейшие исследования более крупных кагорт для подтверждения этих результатов. Ассоциации между полиморфизмом CARD15/NOD2 и фенотипом болезни кажутся наиболее устойчивыми и подтверждают, что генотипирование по CARD15/NOD2 может быть пригодным для предсказания некоторых аспектов поведения болезни со склонностью в направлении стенозирующей болезни у CD пациентов.

Предполагается, что большинство вариантов IBD, ассоциированных с IBC, в конечном итоге д. быть идентифицированы и их относительное влияние на чувствительность к IBD и фенотип оценены в рамках генетических фонов. Figure 2 показывает некоторые возможные стратегии. Генотипирование д. применяться и к родственникам пациентов с IBD для идентификации риска у членов семьи. Хотя сегодня не существует стратегий

Fig. 2. Potential future strategies for managing inflammatory bowel diseases (IBDs) using genetics.

для предупреждения появления IBD, в дальнейшем может быть найдены превентивные подходы. Учитывая сильный средовой вклад в IBD, очевидно, что изменения стиля жизни и диеты смогут существенно снизить чувствительность у индивидов, подверженных риску. Генотипирование пациентов с IBD д. помочь классификации клинических подтипов IBD, что м. предопределить определенный режим терапии. Генотипирование может также идентифицировать аллели, ассоциированные с легким или тяжелым течением болезни, что может помочь принять решение о консервативном или более агрессивном лечении. Достаточно интересно, что хотя генетика чувствительности к IBD всё ещё неясна, но IBD представляет собой один из лучших примеров фармакогеномики в сегодняшней практике. IBD пациенты часто лечатся иммуномодулятором azathioprine. Варианты аллелей катаболического экнзима thiopurine methyl transferase приводят к повышенным уровням метаболитов azathioprine, что ассоциирует с токсичностью лекарств. Генетический скрининг м. идентифицировать 1 на 300 индивидов гомозиготность по варианту аллеля, предупреждающего потенциальную летальную токсичность лекарства при исследовании с помощью polymerase chain reaction.