Посещений:
ДЕФЕКТЫ НЕРВНОЙ ТРУБКИ

Генетические Основы

Toward understanding the genetic basis of neural tube defects
Kibar Z, Capra V, Gros P.
Clinical Genetics | Volume 71, Issue 4, Pages 295-310

Neural tube defects (NTDs) represent a common group of severe congenital malformations that result from failure of neural tube closure during early development. Their etiology is quite complex involving environmental and genetic factors and their underlying molecular and cellular pathogenic mechanisms remain poorly understood. Animal studies have recently demonstrated an essential role for the planar cell polarity pathway (PCP) in mediating a morphogenetic process called convergent extension during neural tube formation. Alterations in members of this pathway lead to NTDs in vertebrate models, representing novel and exciting candidates for human NTDs. Genetic studies in NTDs have focused mainly on folate-related genes based on the finding that perinatal folic acid supplementation reduces the risk of NTDs by 60–70%. A few variants in these genes have been found to be significantly associated with an increased risk for NTDs. The candidate gene approach investigating genes involved in neurulation has failed to identify major causative genes in the etiology of NTDs. Despite this history of generally negative findings, we are achieving a rapid and impressive progress in understanding the genetic basis of NTDs, based mainly on the powerful tool of animal models.

Смотри также Материал
Neural tube defects (NTDs) находятся среди наиболее распространенных врожденных уродств у человека, встречаются у 1-2 ребенка на 1000 рождений и их показатель варьирует в разных популяциях (1). Они возникают очень рано во время беременности и вызываются частичным или полным отсутствием закрытия нервной трубки во время эмбриогенеза на уровне ростро-каудальной оси (1). Наиболее распространенные формы NTDs обозначаются как открытые, когда затронутая нервная ткань оказывается экспонированной на поверхности тела. Сюда входят анэнцефалия и myelomeningocele (spina bifida), которые возникают как результат неспособности слияния краниальной или спинной области нервной трубки, соотв. Все дети с анэнцефалией являются мертворожденными или погибают вскоре после рождения, тогда как большинство детей со spina bifida теперь выживают, но остаются с тяжелой и на всю жизнь физической и онтогенетической потерей работоспособности (2). Др. открытые dysraphisms включают myeloschisis, hemimyelomeningocele и hemimyelocele и иногда ассоциируют с Chiari II уродством (3). Др. редкая открытая форма NTD это craniorachischisis, которая возникает как результат неспособности закрытия нервной трубки вдоль всей оси тела (2). Ряд закрытых (покрытых кожей) NTDs классифицируется клинически в зависимости от присутствия или отсутствия в нижнем отделе спины подкожных масс. Закрытые NTDs с массами представлены lipomyeloschisis, lipomyelomeningocele, meningocele, и myelocystocele. Закрытые NTDs без масс включают простые dysraphic состояния (интрадуральные lipomas, diastematomyelia, teratoma, dermoid, epidermoid, tight filum terminale, persistent terminal ventricle, and dermal sinus) и сложные dysraphic состояния (dorsal enteric fistula, neurenteric cysts, split cord malformations, caudal regression syndrome и spinal segmental dysgenesis) (3).
Наиболее важной эпидемиологической находкой, связанной с NTDs является защитный эффект periconceptional добавления фолиевой кислоты, которая снижает их показатель на 50-70% (4). Несмотря на это тысячи новых семей всё ещё страдают от этого разрушительного заболевания каждый год. Понимание молекулярных и клеточных патогенетических механизмов. ведущих к NTDs является критическим для разработки новых превентивных стратегий и лучшего консультирования пар о рисках. Для лучшего понимания патогенеза NTDs, коротко рассмотрим нормальный процесс нейруляции и опишем морфогенетический процесс, наз. convergent extension (CE) при закрытии нервной трубки.

Normal neurulation: A general overview


Нейруляция является фундаментальным эмбриональным процессом, который ведет к образованию нервной трубки, которая является предшественником головного и спинного мозга. образование нервной трубки чрезвычайно сложный феномен, при котором клетки д. изменять форму. мигрировать и дифференцироваться, чтобы сформировать полую трубку из плотного слоя утолщенного эпителия (нервной пластинки). Нейруляция проходит две самостоятельные фазы: первичная нейруляция (недели 3-4) , которая ведёт е образованию головного мозга и большей части спинного мозга вплоть до верхнего кресцового уровня, затем следует вторичная нейруляция (недели 5-6), которая создает самую низкую часть спинного мозга, включая большую часть кресцовой и всю копчиковую область (1, 3).

Primary neurulation


Этот процесс связан с образованием нервной пластинки, изменением формы нервной пластинки, искривлению и слиянию нервной пластинки по срединной линии (5, 6). Каждое из этих событий является автономным и контролируется с помощью самостоятельных молекулярных путей (1, 7, 8).
Образование нервной пластинки описывается как нейральная индукция, в результате которой дорсальная эктодерма срединной линии дифференцируется в нейроэпителий (5, 6). Обычно, bone morphogenetic proteins (BMPs) предупреждает эктодерму от следования по этому пути самопроизвольно и образования нейроэктодермы и вместо этого инструктирует её формировать эпидермис (9). Нейральная индукция происходит за счет супрессии этой эпидермальной судьбы, когда антагонисты BMPs, включая chordin, noggin и follistatin, испускаемые первичным узелком, открывают возможность эктодерме формировать нейроэктодерму (9-11). Др. сигнальные пути, участвующие в нейральной индукции, используют fibroblast growth factors, каноническую передачу сигналовl Wnt и insulin-like фактор роста (9-11).
Формирование нервной пластинки связано с превращением нервной пластинки в удлиненную структуру, которя является широкой в краниальной и узкой в спинальной областях. Во время формообразования основной управляющей силой является морфогенетическое событие, наз. CE. CE описывает сужение и удлинение групп клеток, которые д. стать эмбриональной осью во время гаструляции или нервной пластинкой во время закрытия нервной трубки. В этом сложном процессе клетки удлиняются медиолатерально и продуцируют поляризованные клеточные выпячивания, которые позволяют им двигаться направленно и интеркалировать вместе с др. соседними клетками. Это изменение в форме и подвижности приводит к конвергенции в направлении срединной линии и удлинению ткани вдоль передне-задней оси (Fig. 1). Конечным результатом является более длинная ось тела с более узким медиолатеральным размером, приводящая к превращению первоначально широкой и короткой нервной пластинки в более узкую и удлиненную (12, 13). CE контролируется с помощью неканонического Wnt/frizzled пути, в противовес каноническому Wnt пути, который действует посредством стабилизации β-catenin, контролирующего спецификацию клеточных судеб и это эквивалентно т. наз. пути planar cell polarity (PCP) у мух (14) (discussed in greater detail below).


Рис.1.  |  A simplified diagram of the morphogenetic process of convergent extension during gastrulation and neural tube closure. Cells become polarized, intercalate and converge together on the mediolateral axis leading to extension of the developing tissue on the anteroposterior axis.

Изгибание нервной пластинки вызывает образование нервных складок и последующее поднимание и конвергенция этих складок в направлении дорсальной срединной линии (Fig. 2) (5, 6). Это связано с образованием точек поворота с обеих сторон: median hinge point (MHP) лежат поверх хорды и идут вдоль ростро-каудальной оси, а парные dorsolateral hinge points (DLHPs) находятся на боковых сторонах складок и по преимуществу на уровнях будущего головного мозга (Fig. 2c) (15). Срединные MHP являются лишь точками изгибания на верхнем спинальном уровне, тогда как DLHP формируются на более низкой спинальной и краниальной области (1). Исследования на мутантных мышах показали, что образование этих точек изгиба контролируется с помощью передачи сигналов белка sonic hedgehog, исходящими от хорды (16-19). После образования точек изгиба нервная пластинка ротирует за счет подъема вокруг MHP и конвергирует вдоль DHLP. Основным морфогенетическим событием, которое имеет место при изгибании нервной пластинки, является процесс наз. апикальным сжатием (constriction), при котором цилиндрические клетки нервной трубки превращаются в клиновидные клетки (7). Лежащие в основе молекулярные и клеточные механизмы плохо изучены. Только два гена участвуют в обеспечении этого процесса и оба родственны актину: p190RhoGap, негативный регулятор Rho GTPase, участвующий в регуляции динами актина (20), и Shroom, который является актин-связывающим белком (21, 22).


Рис.2.  |  Schematic diagram of neural plate bending. Neural folds form at the lateral extremes of the neural plate (a, arrows), elevate (b, arrows) and converge toward the dorsal midline (c). Bending or hinge points form at two sites: the median hinge point (MHP) overlying the notochord and the paired dorsolateral hinge points (DLHP) at the lateral sides of the folds (c). nc, notochord; np, neural plate, pe, presumptive epidermis.

В конечном счете боковые складки приходят в соприкосновение по дорсальной срединной линии и слипаются др. с др., приводя к слиянию нервной пластинки. Этот процесс формирует крышу нервной трубки и приводит к образованию двух отдельных слоёв, эпидермальной эктодермы (которая вносит вклад в кожу спины эмбриона) и нейроэпителия с промежуточными мезенхимными клетками нервного гребня (1). Клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе слияния складок остаются плохо изученными. Как только нервные складки приближаются клеточные выпячивания вытягиваются от апикальных клеток и взаимно переплетаются, что сопровождается образованием постоянных клеточных контактов (1). Исследования на мышах выявили участие Ephrin-A5 и EphA7 рецепторов в этом процессе слияния в краниальном эпителии (23). Недавнее исследование на Xenopus показало, что Ephrin-B1 обеспечивает перемещения ретинальных предшественников благодаря взаимодействию с Dishevelled и др. членами неканонического Wnt/PCP пути (24). Др. гены, участвующие в слиянии нервных складок включают neural cell adhesion molecule (N-CAM) и neural (N)-cadherin, оба продуцируются нервной трубкой, и epithelial (E)-cadherin, продуцируемый покрывающей поверхностной эктодермой (25-27). Однако нулевые мутации в N-CAM и N-cadherin у мышей не оказывают эффекта на закрытие нервной трубки, что ставит под вопрос важность их роли в процессе слияния (28, 29).
Закрытие нервной трубки, как полагают, процесс двунаправленный в виде застежки молнии. Исследования на мышиных моделях демонстрируют множественные сайты инициации закрытия нервной трубки у развивающихся эмбрионах (Fig. 3) (1). Closure 1 инициируется на границе задним мозгом и шейным отделом и затем продвигается рострально в будущий головной мозг и каудально в спинальную область. Closure 2 начинается на границе передним и средним мозгом и closure 3 происходит на ростральном конце переднего мозга (1). Положение closures 1 и 3 без вариантов среди линий мышей, тогда как позиция closure 2 является полиморфной, она может быть более каудальной или ростральной (30). Интересно, что линии мышей с более ростральной closure 2 сильно предрасположены к краниальным NTDs (экзэнцефалии) (31). У людей, немногие исследования продемонстрировали закрытие нервной трубки во многих местах, но точное количество мест закрытия остается спорным. Closures 1 и 3 возникают с определенностью, а появление места самостоятельной closure 2 остается противоречивым (32-34). Было предположено, что вариабельность места closure 2 может представлять собой фактор риска NTDs у человека, это объясняет изменчивость NTDs среди разных этнических групп (1).


Рис.3.  |  Multiple and sequential initiation sites of neural tube closure in mouse. (a) shows a diagrammatic sideview of a mouse embryo with the initiation sites of neural tube closure (arrowheads). Closure 1 is initiated at the hindbrain/cervical boundary and then proceeds rostrally into the future brain and caudally into the spinal region. Closure 2 is initiated at the forebrain/midbrain boundary and closure 3 occurs at the rostral extremity of the forebrain. Failure of closure 1 leads to craniorachischisis where the neural tube remains open throughout the brain and spinal cord. Failure of the caudal spread of fusion from closure 1 results in open spina bifida or myelomeningocele. Failure of closure 2 or 3 leads to cranial NTDs or anencephaly and facial schisis (site 3). (b) shows a Looptail embryo with craniorachischisis (between arrows) while (c) shows a Splotch embryo exhibiting exencephaly (arrowhead) and spina bifida (arrow).

Неспособность закрытия нервной трубки во время первичной нейруляции на любом уровне оси тела от головного мозга до кресцовой части спинного мозга ведет к 'open' NTDs (1) (Fig. 3). Неспособность closure 1 ведет к craniorachischisis, когда нервная трубка остается открытой по всему головному и спинному мозгу. Неспособность к слиянию, распространяющемуся каудально от closure 1 ведет к открытой spina bifida или myelomeningocele. Неспособность closure 2 ведет к exencephaly, которая на поздних сроках беременности превращается в anencephaly, при которой свод черепа отсутствует и ткань головного мозга дегенерирует. Неспособность closure 3 ведет к anencephaly, ограниченной областью переднего мозга и которая часто ассоциирует с уродствами расщепления лица (1).

Secondary neurulation


Вторичная нейруляция начинается после завершения первичной нейруляции. Во время этого процесса нервная трубка продуцируется хвостовой почкой, массой стволовых клеток, представляющих собой остатки первичной полоски, которые располагаются на каудальном конце эмбриона. Эти стволовые клетки подвергаются пролиферации и конденсации, сопровождаемой кавитацией и слиянием с центральным каналом нервной трубки, образуемой при первичной нейруляции (1, 35). Недавние исследования показали, что оба способа нейруляции представляют собой непрерывную программу со сходными молекулярными и клеточными механизмами (35). Нарушения вторичной нейруляции ведут к обычно менее распространенным 'закрытым' формам NTDs, при которых развивающаяся нервная трубка неспособна отделиться от остальных тканей хвостовой почки (1).

PCP signaling and neural tube closure


PCP signaling


В последние годы получены важные данные о существенной роли передачи сигналов PCP в обеспечении CE перемещений по время закрытия нервной трубки. PCP, называется также тканевой полярностью, является процессом. с помощью которого клетки становятся поляризованными в плоскости эпителия. Эта форма поляризации хорошо изучена на эпителиальных тканях Drosophila, где она может наблюдаться по дистальной ориентации крыловых волосков, задней ориентации абдоминальных щетинок и по более сложной организации омматидий (глазных единиц) взрослых глаз (14). Генетические исследования широкого круга мутантов, затрагивающих эти организованные структуры у мух идентифицировали группу т.наз. 'стержневых' PCP генов, необходимых для передачи сигналов PCP во всех тканях, включающую: Frizzled (Fz), Dishevelled (Dsh/Dvl), Strabismus/Van Gogh (Stbm/Vang), Flamingo (Fmi), Prickle (Pk) and Diego (Dgo) (Table 1) (Fig. 4) (14, 36, 37). Эти PCP белки образуют ассоциированные с мембраной сигнальные комплексы, в которых их субклеточная локализация, количество и распределение являются критическими для нормальной передачи сигналов PCP (38). После активации PCP за счет соединения с неизвестным лигандом Fz рецептора, эти стержневые белки подвергаются асимметричному перераспределению, при котором цитоплазматические Dvl и Pk рекрутируются на плазматическую мембрану, формируя комплексы с Fz и Stbm/Vang, соотв. (39, 40). Pk и Dgo конкурируют за связывание Dsh и могут противодействовать или стимулировать передачу сигналов PCP, соотв. (41). Fmi действует ниже Fz и необходим для локализации др. белков на слипчивые соединения и, как полагают, обеспечивает межклеточные взаимодействия, которые размножают сигналы полярности для передачи сигналов межклеточной полярности (42, 43). Нижестоящие эффекторные гены этого пути включают малые GTPases из семейства RhoA, formin homology protein Daam1 и c-Jun N-терминальную киназу, которые после активации ведут к различным клеточным реакциям, включая перестройки цитоскелета (14, 36, 37) (Fig. 4).


Table 1. Planar cell polarity core genes and their role in CE


PCP gene Molecular features CE phenotype NTD phenotype References
Frizzled (Fz) Seven pass transmembrane receptor, binds Wnt ligand and recruits Dsh Yes Curly tail in Fz3 −/− mice (39, 58, 104, 105)

Failure of cephalic neural tube closure in the mixed 129/SVJ × C57BL/6 background of the Fz +/− line

Craniorachischisis in Fz3/Fz6 double homozygous embryos
Dishevelled (Dsh or Dvl) Cytoplasmic phosphoprotein containing protein–protein interaction domains (DIX, PDZ, DEP) Yes Craniorachischisis in Dvl1/Dvl2 double homozygous embryos (39, 57, 106)
Strabismus/Van Gogh (Stbm/Vang) Transmembrane protein with a PDZ-binding domain, recruits Pk to membrane Yes Craniorachischisis in Looptail Lp/Lp mouse (40, 47, 48, 107–110)
Prickle (Pk) or (prickle-spiny legs) Cytoplasmic protein with 3 LIM domains and PET domain, recruited to membrane by Stbm/Vang Yes Unknown (40, 41, 111–114)
Diego (Dgo) Cytoplasmic ankyrin repeat protein, recruited to membrane by Fz Yes Unknown (41, 114–116)
Flamingo (Fmi) or Starry night (Stan) or Celsr Atypical cadherin with seven pass transmembrane domains involved in homophilic cell adhesion Yes Craniorachischisis in Spin cycle and Crash homozygous mutants (42, 43, 56, 117)
CE, convergent extension.



Рис.4.  |  Simplified scheme of the PCP pathway with its possible link to Hedgehog signaling and ciliogenesis. PCP signaling involves a noncanonical Wnt/frizzled (Wnt/Fz) pathway where Wnt binds to the Fz receptor leading to recruitment and activation of Dishevelled (Dsh in Drosophila and Dvl in vertebrates). The identity of the substrate binding to Fz as being Wnt is still not confirmed. PCP activation requires formation of a multiprotein complex including two transmembrane proteins, Vangl (Stbm/Vang in Drosophila and Vangl in vertebrates) and Fmi/Stan/Celsr (Flamingo or Starry night in Drosophila and Celsr in vertebrates), and three cytoplasmic proteins, Dsh/Dvl, Diego (Dgo, related to Inversin in vertebrates) and Prickle (Pk). These proteins acquire an asymmetric localization at the plasma membrane that is crucial for proper PCP signaling. Scribble (Scrb) is a cytoplasmic protein involved in apical–basal polarity in the fly that binds to and genetically interacts with Vangl, suggesting a role in PCP signaling. Protein tyrosine kinase 7 (PTK7) is a conserved transmembrane protein that genetically interacts with Vangl2 in vertebrates. Downstream effectors of PCP signaling include small Rho GTPases (Rho/Rac/Daam) and the c-Jun N-terminal kinase (JNK) that act on the cytoskeleton and induce cellular polarizing events. Two transmembrane proteins, Inturned (In) and Fuzzy (Fy), act as downstream effectors of PCP signaling. In and Fy are also required for ciliogenesis where defects affect Hedgehog (HH) signaling through Gli transcription factors. In and Dvl are colocalized near the basal apparatus of cilia. These data suggest a link between PCP, ciliogenesis and HH signaling.

PCP, CE and neural tube closure


Члены PCP пути высоко консервативны у позвоночных, у которых они участвуют в контроле процессов CE во время гаструляции и нейруляции посредством неканонического Wnt/frizzled пути (44, 45). У позвоночных передача сигналов PCP также используется involved в установлении правильной ориентации сенсорных волосковых клеток в улитке внутреннего уха (44, 45). Доказательства участия PCP в CE у позвоночных обнаруживаются в исследованиях широкого круга мутантов и morpholino-oligonucleotide нокдаунов ортологов мушиных PCP генов у рыбок данио, лягушек и мышей (7, 44, 45) (Table 1). Критическое значение CE для закрытия нервной трубки впервые было продемонстрировано с помощью молекулярного нарушения CE у эмбрионов лягушек. У эмбрионов с дефектным CE, вызываемым с помощью разрушения Dsh, нервные складки образуются аберрантно сильно удаленными др. от др., что препятствует их слиянию по срединной линии (46). Мыши Looptail (Lp) были первыми мутантами, указывающими на роль PCP и CE в NTDs (47, 48). Lp гетерозиготы характеризуются 'looped' хвостом, а гомозиготы дают тяжелые NTD, напоминающие craniorachischisis у человека (49). Геном дефектным у Lp оказался Vangl2 (47, 48, 50) , это гомолог у млекопитающих гена Drosophila Stbm/Vang, который составляет часть PCP пути (51-53). Исследования на мышах идентифицировали Scribble (Scrb1) и Protein tyrosine kinase 7 (PTK7) в качестве новых членов PCP пути у позвоночных (54, 55). Мушиным ортологом Scribble является PDZ домен содержащий цитоплазматический белок, который участвует в установлении апикально-базальной полярности. Мутации Scrb1 вызывают craniorachischisis у Circletail мышей и генетически взаимодействуют с Lp (54). PTK7 кодирует трансмембранную атипичную тирозин киназу, дефекты которой вызывают craniorachischisis и он генетически взаимодействует также с Lp (55). Мутации в ортологах позвоночных др. членов PCP пути в основном Celsr1 (мышиный Fmi ортолог) (56) и комбинированные мутации в Dvl1/Dvl2 (57) и в Fz3/Fz6 (58) вызывают тяжелую форму NTD craniorachischisis, это подтверждает участие PCP в NTDs. Lp, Dvl и Celsr1 мутантные мыши дают более короткую и широкую нервную пластинку, это строго указывает на то, что тяжелые NTDs у них результат нарушений CE.

PCP signaling and cell division


Точный механизм, с помощью которого PCP путь регулирует CE остается плохо изученным. Два недавних исследования на рыбках данио исследовали этот вопрос путем изучения связи между PCP и ориентированными клеточными делениями (59, 60). Роль неслучайно ориентированных клеточных делений в формировании формы нервной пластинки хорошо задокументирована в нейруляции кур и мышей. Митотические веретена нейроэпителия ориентированы преимущественно в рострокаудальном направлении, указывая тем самым на существенную роль этих неслучайных клеточных делений в продольном удлинении нервной пластинки (61). Используя in vivo конфокальные картины митотических делений во время гаструляции рыбок данио, было установлено, что клетки дорсальной ткани преимущественно делятся вдоль animal-vegetal оси эмбриона. Это расположение тяжело нарушается у мутантов с потерей функции Wnt11 и после инъекции мутантной формы Xenopus Dsh (Xdd1), который блокирует удлинение оси у Xenopus и рыбок данио, и после morpholino, который вызывает нокдаун Strabismus. Эти данные подтверждают существенную роль передачи сигналов PCP в ориентации клеточных делений и удлинения оси. Авт. этого исследования предположили, что PCP путь регулирует как ориентацию клеточных делений, так и интеркаляцию клеток, которые сотрудничают, чтобы удлинить передне-заднюю (AP) ось у рыбок данио (59). Данные более недавнего исследования подтвердили роль передачи сигналов PCP в восстановлении клеточной полярности, которая временно теряется в делящихся клетках во время нейруляции. Во время митозов делящиеся клетки теряют свои поляризованные свойства, это угрожает общей организации развивающейся ткани. Путем анализа Vangl2/Stbm maternal-zygotic trimutants (MZtri, где все материнские и зиготические Vangl2 активности элиминированы) и использования отслеживания клеток и техники наблюдения в реальном времени, исследователи подтвердили. что неканоническая передача сигналов Wnt/PCP поляризует нейрональных предшественников вдоль AP оси; если эта полярность теряется во время митозов, то передача сигналов PCP быстро реполяризует дочерние клетки и управляет их интеграцией в нейроэпителий. Интересно. что когда клеточные деления блокируются ингибиторами синтеза ДНК, то дефекты нейруляции нормализуются у 90% MZtri эмбрионов, указывая тем самым, что PCP более не нужна для нейруляции, если клеточные деления блокированы (60). Эти важные новые находки обоих исследований ставят множество вопросов, включая (i) каков точный механизм, с помощью которого PCP регулирует неслучайную ориентацию клеточных делений или реполяризует дочерние клетки, (ii) как PCP помогает реинтегрировать нервные клетки в нейроэпителий после митоза и (iii) какие молекулы митотического веретена участвуют в этом PCP-обеспечиваемом эффекте.

PCP signaling and ciliogenesis


Путь PCP участвует и в морфогенезе ресничек. Первичные реснички являются специализированными органеллами, проецирующимися с клеточной поверхности почти каждой клетки позвоночных. Они обладают хорошо известной ролью в восприятии запахов, зрении и механовосприятии и сильно законсервированы от простейших до человека (62). Реснички оказались ключевыми элементами двух путей, критических для нормального эмбрионального развития: пути передачи сигналов hedgehog (HH) у млекопитающих и PCP (62). Передача сигналов HH действует посредством Gli-типа транскрипционных факторов, чтобы обеспечить формирование паттерна клеточных судеб и др. биологических процессов (63). Мутации у мышей в компонентах комплекса внутрижгутикового транспорта, существенного для поддержания и функции ресничек, Wimple и Polaris, ведут к фенотипам, характерным для дефектов этого пути, включая потерю вентральных типов нервных клеток (64). Кроме того, некоторые компоненты HH пути лдокализуются в ресничках для соотв. передачи сигналов (65, 66).
Доказательства действительной роли цилиогенеза в PCP получены при нокдауне белков ресничек у позвоночных и изучении возникающих фенотипов (67, 68). Разрушение генов, участвующих в Bardet-Biedl syndrome (BBS) у мышей ведет к фенотипу, общему с таковым мутантов PCP, включая NTDs (exencephaly), открытые веки и разрушение пучков стереоцилий в улитке. В том же исследовании было показано, что BBS гены взаимодействуют с Vangl2 у мышей и рыбок данио и что Vangl2, подобно BBS белкам локализуется в базальных тельцах и аксонеме ресничек (67). На молекулярном уровне, в др. исследовании было показано, что Inversin, ассоциированный с микротрубочками белок существенен для морфогенеза ресничек, и действует как переключатель между каноническим β-catenin путем и PCP путем. Inversin ингибирует канонический β-catenin путь путем деградации цитоплазматического Dsh; он физически взаимодействует и ко-локализуется с Dvl1 и является существенным для CE перемещений у эмбрионов Xenopus (68). Недавнее исследование на Xenopus продемонстрировало связь между цилиогенезом и передачей сигналов HH и PCP (69). Разрушение двух ортологов Drosophila PCP эффекторов, Inturned (In) и Fuzzy (Fy), ведет к дефектам, характерным как для HH, так и PCP путей. Мутантные эмбрионы по In и Fy обнаруживаю неспособность к цилиогенезу, как результат неправильной ориентации микротрубочек ресничек. Более того, накопление Dsh и Int вблизи базального аппарата ресничек подтверждает роль PCP белков в обеспечении процесса цилиогенеза (69) (Fig. 4). Мутации в производящем основной вклад в синдромальные NTDs у человека, Meckel syndrome, недавно идентифицированы в двух генах, MSK1 и MSK3, которые, как полагают, участвуют в формировании ресничек (70, 71). Взаимоотношения между цилиогенезом, передачей сигналов HH, PCP и NTDs были рассмотрены в недавнем обзоре, сфокусированном на возможных взаимодействиях между PCP и ресничками и на их значении для понимания механизмов NTDs у людей (72).

Etiology of NTDs


Прекращение нейруляции на любой стадии ведет к возникновению NTDs. популяционные и семейные исследования выявили сложную этиологию NTDs с вовлечением как средовых. так и генетических факторов. Средовые факторы влияют на повышение риска NTDs. включая географию, эпидемические тенденции, социоэкономические классы, возраст матери, материнский диабет и тучность, а также воздействие в основном антиэпилептическими лекарствами (73, 74). С др. стороны, строгие доказательства подтверждают генетический компонент NTDs, включающий (i) ассоциацию с известными хромосомными аномалиями (напр. trisomy 13, 18 и 21) или (ii) генетические синдромы (напр. Meckel syndrome и anal stenosis), (iii) этнические и расовые различия , влияющие на величину показателей, (iv) повышенный риск второго уродливого ребенка для пары с одним затронутым ребенком (в 3-5 раз) и для siblings от затронутых индивидов по сравнению с генеральной популяцией (10-fold) и v) появление семейных характеристик (settings) или распределений, которые не согласуются с менделевским наследованием (75, 76, 77). Паттерны наследования и риск повторения таких врожденных аномалий в семьях указывают на мультифакториальную пороговую модель, в которой существует непрерывная варьирующая 'liability' в популяции с 'онтогенетическим' пороговым значением, ниже которого индивиды оказываются затронутыми. Недавнее исследование подтвердило, что генетические факторы предрасположенности к NTDs могут передаваться преимущественно с материнской стороны в семье (78). Наследуемость NTDs подсчитана равно 60% с вовлечением множественных чувствительных генов; однако количество, качественные особенности и относительный вклад таких генов в NTDs остаются неизвестными (76).

Studies of gene identification in NTDs


Для идентификации генов предрасположенности к NTDs у людей использование позиционного клонирования затруднено из-за сложной этиологии и бедности крупных семей с множественными затронутыми членами. Недавно скрининг сцеплений по всему геному для NTDs идентифицировал интересные немногие хромосомные регионы; , однако результаты этих исследований следует интерпретировать с осторожностью, т.к. они осложнены за счет возможной генетической гетерогенности и варьирующей пенетрантности (79, 80). Идентификация генов для NTDs в основном использует подход выявления генов кандидатов и фокусируется на генах пути фолиевой кислоты и на генах кандидатах из исследований на животных.

Folate-related genes and NTDs


Генетический анализ связанных с фолатами генов при NTDs был приведен в движение находкой, что periconceptional применение фолиевой кислоты снижает показатель NTDs почти на 60-70% (4). Фолиевая кислота является неактивным водорастворимым витамином B, который абсорбируется в проксимальной части тонкого кишечника за счет механизма, обеспечиваемого носителями и использующего reduced folate carrier (RFC). Однажды попав в кровоток фолат транспортируется в клетки в основном посредством фолатных рецепторов (FR-α, -β и -γ) и посредством RFC (4) (Fig. 5). Внутриклеточное потребление фолата с помощью FR-α является очень важным для эмбриогенеза, как продемонстрировано на мышах с функциональным нокаутом folate-binding protein 1 (Folp1, ортолог FR-α), ведущем к экзэнцефалии и эмбриональной летальности (81). Недавнее исследование показало, что некоторые матери с NTD беременностью продуцируют антитела, которые связывают фолатные рецепторы на плацентной мембране и тем самым блокируют связывание фолиевой кислоты. Авт. указывают на то, что добавление фолатов д. использовать альтернативу клеточного введения фолатов или д. увеличивать конкурентоспособность с аутоантителами, связывающими фолатные рецепторы, чтобы восстановить гомеостаз фолатов (82). Очень небольшие изменения FR-α и FR-β были идентифицированы и ни одно не обнаруживало связи с повышением риска NTD (83-85). С др. стороны, превалирующий полиморфизм (80A&aarr;G) в RFC-1 был продемонстрирован в качестве фактора генетического риска для NTDs, особенно, если материнский статус фолатов низок (86, 87).


Рис.5.  | Simplified overview of folate and homocysteine metabolic cycles. AdoHcy, S-adenosylhomocysteine; AdoMet, S-adenosylmethionine; BHMT, betaine-homocysteine methyltransferase; CBS, cystathionine ?-synthase; FR, folate receptor; MTHFD, methylenetetrahydrofolate dehydrogenase; MTHFR, methylenetetrahydrofolate reductase; MTR, methionine synthase; MTRR, methionine synthase reductase; RFC, reduced folate carrier; SHMT, serine hydroxymethyltransferase; THF, tetrahydrofolate.

Будучи введенным в клетку фолат действует как метильный донор для синтеза methionine путем реметилирования homocysteine (Hcy). Метионин является одним из наиболее важных доноров methyl для метилирования ДНК и тРНК. Фолат также действует как донор одно-углеродных групп для синтеза тимидина и пуринов, строительных блоков ДНК (Fig. 5). Folate и Hcy метаболические циклы тесно связаны и вовлекают более 25 белков, большинство из которых было исследовано в отношении ассоциации с повышенным риском NTD (4). Данный обзор может представить только данные по немногим ключевым энзимам, участвующим в метаболизме фолата и Hcy, это 5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase (MTHFR), trifunctional enzyme methyleneTHF dehydrogenase/formylTHF synthase/methenylTHF cyclohydrolase (MTHFD), methionine synthase (MTR) и methionine synthase reductase (MTRR). Детальный обзор по др. членам этих метаболических путей представлен в др. работах (4, 88, 89).
Ген MTHFR является особенно важным, т.к. он регулирует доступность фолата для Hcy реметилирования (Fig. 5) и изучался наиболее интенсивно в качестве потенциального фактора риска для NTDs (4). Обычный single-nucleotide polymorphism (SNP) в этом гене, 677C→T, ассоциирует в пониженными уровнями ферментативной активности, повышенными уровнями Hcy в плазме и повышенным риском NTD risk в некоторых популяциях [reviewed by Van der Linden et al. (4) and Blom et al. (89)]. Два Meta-analysis исследования строго продемонстрировали MTHFR 677TT генотип как фактор риска для NTDs у матерей и затронутых детей (90, 91). Вторая мутация в гене MTHFR, 1298A→C, была идентифицирована и была обнаружена в ассоциации с пониженным уровнем ферментативной активности (но не столь тяжелым как при 677C→T) и повышенным риском NTDs, но не обнаруживала эффекта в отношении уровней Hcy в плазме (91, 92). Трифункциональный энзим MTHFD играет центральную роль в метаболизме фолата, т.к. он участвует в большинстве реакций конверсии субстратов, используемых в синтезе пурина и тимидина (Fig. 5). Идентифицирован один ДНК вариант MTHFD, 1958G→A, и обнаружена его ассоциация с повышенным риском NTD для матерей, имеющих ребенка с NTD (93-95).
MTR катализирует перенос метильной группы с 5-methylTHF на Hcy, используя витамин B12 (cobalamin, cbl) в качестве кофактора (4) (Fig. 5). Анализ последовательностей кодирующей области MTR идентифицировал одну SNP, 2756A→G, в спирали, участвующей в связывании кофактора (96). Исследование ассоциаций между этим SNP и уровнем Hcy в плазме и уровнями фолата и увеличенным риском NTD дали противоречивые результаты (4, 89). Активный комплекс MTR соединяется с cbl, и наз. cbl(1)MTR, он может соединяться в метильной группой 5-methylTHF, чтобы сформировать cbl(III)MTR, который переносит метильную группу на Hcy. Cbl(1)MTR может быть окислен в неактивный cbl(II)MTR, который может быть реактивирован с помощью энзима MTRR (4). Идентифицирован один вариант в гене MTRR, 66A→G, который может рассматриваться как материнский фактор риска для NTD (4, 89). Исследование с помощью meta-analysis показало, что материнский MTRR 66GG генотип является фактором риска развития NTDs (4).
Исследование ассоциаций, проведенное при NTDs показало, что вариации в генах, связанных с фолатом, могут увеличивать риск NTDs посредством межгенных и ген-средовых взаимодействий и посредством или материнского или эмбрионального генотипа. MTHFR 677C→T связан со снижением активности MTHFR, низким уровнем фолата в плазме и высоким уровнем в плазме и обнаруживает варьирующую пенетрантность, зависимую от приема с пищей и добавляемого фолата (89, 97). RFC-1 80A→G вариант может взаимодействовать с низким статусом фолата в эритроцитах, а мутации MTHFR с повышенным риском NTDs (98). Необходимы дальнейшие исследования для выявления роли вариантов генов фолатового пути и их взаимодействия со средой в увеличении риска NTDs.

Candidate genes from animal studies


Исследования на животных, проведенные в основном на модельных мышах, представляют собой мощный инструмент для идентификации генов, участвующих в нормальной и аномальной нейруляции. Кстати, описано не менее 190 естественно возникших или экспериментально индуцированных мутантных линий мышей с NTDs (99). Идентификация и характеристика измененных генов у этих мутантов д. предоставить наиболее вероятных кандидатов, которые вносят вклад в болезни у человека. В таблице 2 представлено большинство генов кандидатов, выявленных в исследованиях на животных, которые были исследованы и при NTDs у людей. Эти гены включают широкий круг функций на всех ступенях нейруляции от нейральной индукции до закрытия нервной трубки, а некоторые участвуют в важных клеточных функциях, таких как геномная стабильность и репарация ДНК.

Table 2. Candidate genes derived from animal studies that were investigated in NTDs

Gene Function in neurulation Summarized results of analysis in NTDs References
ALDH1A2 Aldehyde dehydrogenase required for synthesis of retinoic acid during patterning of the neural tube Significant association with three SNPs (118)
BMP4 (bone morphogenic protein 4) Secreted extracellular ligand with a key role in neural induction and patterning Four missense mutations, not disease-specific and with no evidence for allelic association (119)
BRCA1 (breast cancer antigen 1) E3 ubiquitin ligase important for maintenance of genome stability No evidence for association with two SNPs (120)
Cited2 cAMP-reponsive element binding protein/p300 interacting transcriptional regulator required for neural crest and neural tube development No evidence for association with three SNPs (121)
CRAB Cellular proteins that bind to retinoic acid during patterning of the neural tube CRABP1 and CRAPB2: no evidence for association with SNPs in either gene (118)
CSK (cytoplasmic tyrosine kinase) A negative regulator of the Src family of tyrosine kinases involved in organization of the cytoskeleton Three silent mutations, not disease-specific (122)
CYP26 Cytochrome P450 enzymes involved in metabolism of retinoic acid during patterning of the neural tube CYP26A1 and CYP26B: no evidence for association with SNPs in either gene (118)

CYP26A1: one frameshift mutation, disease-specific; one silent mutation, disease-specific (123)
DNA repair genes DNA repair Six SNPs identified in XRCC, APE1, XRCC3, hOGG1 and XPD of three distinct repair pathways with no evidence for association (124)
DVL3 (Dishevelled 3) Core gene of the planar cell polarity pathway regulating convergent extension during neural tube shaping Eight novel SNPs with no evidence for association (100)
HOX Transcription factors involved in anteroposterior patterning of the neural tube HOXA, HOXB, HOXC and HOXD: no evidence for association with polymorphic markers close to or within each gene (125)
Jumonji Putative transcription factor One silent and one intronic mutations, disease-specific; six SNPs with no evidence for association (126)
MAB21 Homologs of Caenorhabditis elegans mab 21 genes, downstream targets of transforming growth factor beta signaling MAB21L1: no disease-specific mutation; two SNPs with no evidence for association MAB21L2: no disease-specific mutation (127)
MACS and MLP (MARCKS-like protein) Myristoylated alanine-rich protein kinase C substrates regulating actin cytoskeleton during bending of the neural plate No mutation identified (122)

No evidence for association with flanking markers (128)
MSX2 (muscle segment homeobox 2) Transcription factor induced by retinoic acid during neurulation One exonic deletion, disease-specific; three SNPs identified with no evidence for association (129)
NAP1L2 (nucleosome assembly protein 1-like 2) A histone chaperone required for proper cell cycle regulation of developing neuronal cells A number of SNPs identified in the 5' CpG island with no evidence for association (130)
NCAM1 Neural cell adhesion molecule implicated in fusion of the neural tube Significant association with an intronic SNP (131)
Noggin BMP antagonist required for growth and patterning of neural tube One missense mutation, not disease-specific (119)

One missense mutation present in one affected case and her unaffected father and sister (132)
PAX Transcription factors important for specification of neural crest-derived structures during patterning of the neural tube PAX1: one missense mutation, disease-specific (133)

Significant association with a flanking marker (134)

PAX3: no evidence for association with SNPs (133)

Five base pairs deletion leading to frameshift mutation, disease-specific (135)

Absence of linkage with a polymorphic marker (136)

No evidence for association with polymorphic markers (137)

One haplotype associated with an increased risk for NTD (138)

PAX7: no sequence variant identified in paired domain (133)

Significant association with an intragenic marker (134)

PAX8: significant association with an intragenic marker (134)

PAX9: no sequence variant identified in paired domain (133)
PDGFRA (platelet-derived growth factor receptor alpha) Receptor for PDGF, a potent mitogen regulating cell growth and survival and involved in cell morphology and migration Specific combinations of promoter haplotypes with inconsistent evidence for association (139–141)
PRKACA and PRKACB Catalytic subunits of protein kinase A, a downregulator of SHH signaling important for bending and patterning of the neural tube PRKACA: one missense mutation, disease-specific; three SNPs with no evidence for association PRKACB: three SNPs with no evidence for association (142)
SHH Secreted signaling protein critical for proper patterning and bending of the neural tube One silent mutation, disease-specific and present in two affected cases (143)

One intronic SNP with no evidence for association (144)
SLUG Zinc finger transcription factor of the Snail family, implicated in dorsalization of the neural tube One missense mutation in one affected case and unaffected father (145)
T box (Brachyury) Transcription factor essential for mesoderm formation and axial development One variant in intron 7: inconsistent evidence for association (120, 137, 146–148)

No disease-specific mutation, six SNPs with no evidence for association (148)
TERC (telomerase RNA component) RNA component of telomerase required for telomere maintenance and extension Two SNPs identified with no evidence for association (149)
TFAP2A (transcription factor activator protein 2 alpha) Transcription factor that is induced by retinoic acid during neurulation Three SNPs with no evidence for association (122)

Two silent mutations, disease-specific; four SNPs identifed with no evidence for association (129)
VANGL VANGL2: core gene of the planar cell polarity pathway mediating convergent extension movements during neural tube shaping Two silent mutations, disease-specific; one intronic duplication, disease-specific; three silent mutations, not disease-specific (101)

VANGL1: homolog of VANGL2, most likely with similar biochemical activities One SNP with no evidence for allelic association; two silent mutations, not disease-specific (101)
ZIC Zinc finger transcriptional regulators of SHH activity in neural tube bending and patterning ZIC1: no mutation found (150)

ZIC2: one alanine deletion from the amino terminal alanine stretch, disease-specific; one SNP with no evidence for association (150)

No mutation identified; histidine tract polymorphism with inconsistent evidence for association (151, 152)

ZIC3: one silent mutation, disease-specific (150)

No mutations identified in two studies (152, 153)
SHH, sonic hedgehog; SNP, single-nucleotide polymorphism.


Несмотря на большой список генов кандидатов, изученных при NTDs у человека, лишь немногие дают позитивные результаты при отсутствии идентификации основного причинного гена. Это может быть обусловлено типом проведенных исследований или относительным вкладом гена в NTD фенотип или обоими. Исследования ассоциаций, проведенные при NTDs как и любой сложный признак часто обладают пониженной мощностью из-за небольших размеров выборок, что ведет к слабости и противоречивости результатов. Совместные усилия крупных кагорт или подходы meta-analysis необходимы для выявления достоверных ассоциаций. Исследования по секвенированию приводят к заключению, что NTDs в большинстве своем не включают промотрные или интронные регионы, которые могли бы содержать регуляторные элементы. важные для транскрипции и сплайсинга, соотв. Благодаря анализу этих регионов можно было бы открыть дополнительные функциональные полиморфизмы, которые предрасполагают к NTDs. Наиболее вероятно. что варианты последовательностей, идентифицированные при NTDs у человека взаимодействуют с др. вариантами, чтобы вносить вклад в генетическую основу этих уродств, делая относительный вклад каждого варианта слишком маленьким и трудно обнаружимым при использовали традиционных генетических подходов.
Новые гены кандидаты от модельных животных продолжают обнаруживать. Гены PCP пути, участвующие в CE и в образовании нервной трубки представляют собой прекрасных кандидатов на роль NTDs у человека. Два исследования изучали VANGL1, VANGL2 и DVL3 в этиологии NTDs и не нашли специфичных для болезни мутаций или достоверные ассоциации с болезненным фенотипом, это указывает, что ни один из этих генов не играет существенной роль в развитии NTD (100, 101). Однако необходимы дополнительные исследования на более крупных выборках с включением дополнительных PCP генов.

Animal models: Investigating preventive measures for NTDs


Клеточные превентивные механизмы, ассоциированные с фолиевой кислотой при NTDs изучены плохо. Мышиные NTD мутанты представляют собой ценный инструмент для выяснения этих механизмов и тех, связанных с др. внегенными агентами, включая inositol и methionine. Лишь немногие мутанты мышей были протестированы в отношении предупреждения NTDs с помощью этих агентов (102). Одна группа является фолат чувствительной и связана с мутантными белками, участвующими в регуляции транскрипции (Cart1, Cited2 и Pax3), folate transport into cells (Folp1) и канонической передачей сигналов Wnt (low-density lipoprotein receptor-related protein, Lrp6, у Crooked tail). Индуцированные тератогенами мутанты с помощью антиэпилептических лекарств, таких как valproic acid также являются чувствительными к фолату (102). Эта группа мутантов представляет собой ценный инструмент для понимания защитного эффекта добавления фолата при NTDs у человека, который в основном остается неизвестным. Др. группа мутантов является folate резистентной и включает curly tail (Ct), axial defects (Axd) и Eph-A5 нокаутов (102). Спинальные NTDs у Ct мышей возникают в результате нарушения пролиферации клеток задней кишки, что приводит к избыточному вентральному изгибу каудальной области эмбриона и предупреждению закрытия нервных складок (103). Член grainyhead-подобного семейства транскрипционных факторов, Grhl3, как полагают является дефектным геном у Ct мутантов; однако причинная мутация до сих пор не идентифицирована (103). интересно, что NTDs у Ct мышей могут быть предупреждены приемом инозитола. Мыши Axd имеют спинальный NTD и различные аномалии хвоста (curly tails) с неизвестным генетическим повреждением. Подкормка матерей methionine приводит к 41% снижению показателя NTD у таких мышей (102). Дальнейшие исследования этой группы folate-резистентных мутаций необходимо, чтобы выявить связь между inositol и methionine, и нормальным закрытием нервной трубки, что может помочь открытию новых превентивных воздействий для снижения NTDs у людей.

Conclusion


NTDs represent a complex trait in all meanings of the word. Many genes interact with each other and with environmental factors to modulate the risk for developing the phenotype. These risk factors are still largely unknown, keeping the underlying pathogenic mechanisms a challenging mystery. Progress has been made, however, and we are getting closer to deciphering the complex etiology of this devastating group of birth defects, owing largely to concerted efforts of dedicated research groups and to the instrumental tool of animal models.
Сайт создан в системе uCoz