Генетические дефекты в энзимах, ответственных за post-squalene биосинтез cholesterol, недавно возникли как важная причина врожденных dysmorphology синдромов. Идентификация генетических дефектов при синдроме Smith-Lemli-Opitz (SLOS, MIM270400) (1-3) привела к открытию, что др. сходные dysmorphology синдромы вызываются врожденными ошибками в биосинтезе холестерола у человека и мыши: desmosterolosis (4), lathosterolosis (5), CHILD syndrome (6, 7), CDPX2 (a form of chondrodysplasia punctata) и hydropsectopic calcification-moth-eaten skeletal (HEM, известна также как Greenberg) dysplasia (8-11). Все эти синдромы были связаны с недостаточностью специфических энзимов, необходимых для продукции холестерола из lanosterol, как это суммировано в Table 1. Пациенты с этими нарушениями характеризуются сложными пороками, затрагивающими разные органы и системы. Эти нарушения привели к новому признанию существенной роли, которую холестерол играет в развитии. Учитывая множественные и критические роли, которые играют стеролы, не стало неожиданным, что мутации генов, кодирующих энзимы биосинтеза стеролов могут оказывать драматические эффекты на развитие эукариот. Antley-Bixler syndrome (ABS) ранее был классифицирован, как нарушение синтеза стерола. Однако, недавние крупные обследования пациентов с ABS показали, что индивиды с ABS-подобным фенотипом и нормальный steroidogenesis обусловлены мутациями fibroblast growth factor receptor (FGFR), тогда как пациенты с двухсмысленными (ambiguous) гениталиями являются результатом генетических дефектов P450 oxidoreductase (POR), которая ответственна за steroidogenesis (12, 13). Следовательно, ABS с POR мутациями принадлежат к нарушениям, связанным со стероидным метаболизмом вместо стероидного синтеза (14). Детальные описания этих malformation синдромов даны в нескольких обзорах (15-17).

SLOS является аутосомно рецессивным нарушением; мутации потери функции в обеих копиях DHCR7 на хромосоме 11q13 необходимы для возникновения болезни. И мужчины и женщины одинаково подвержены этому заболеванию. DHCR7 редуцирует C7-C8 двойные связи в B кольце стерола, чтобы сформировать холестерол или desmosterol в зависимости от предшественника. Desmosterol может быть превращен в cholesterol с помощью 3b-hydroxysterol-D24 reductase (DHCR24). Поэтому SLOS пациенты имеют обычно низкие уровни холестерола в плазме и всегда повышенные уровни предшественников холестерола 7-dehydrocholesterol (и его спонтанного изомера 8-dehydrocholesterol) и у них отсутствует desmosterol. SLOS сегодня считается как одно из наиболее распространенных аутосомно рецессивно наследуемых заболеваний после cystic fibrosis и phenylketonuria в популяции белых Сев. Америки. Исходя из повышенных уровней 7DHC показатели SLOS были определены в пределах от 1/10,000 до 1/60,000 живых новорожденных в зависимости от региона. SLOS, по-видимому, наиболее превалирует среди людей Caucasian происхождения, но не часто сообщается о нем и у людей Азиатского и Африканского происхождения. В США показатель SLOS определен примерно в 1/50,000 (18, 19). Современная пренатальная диагностика в США с использованием материнской сыворотки на unconjugated стерол в качестве прогноза SLOS, дает показатель в 1/60,000 родов (20). Др. 3-летнее наблюдение за проспективной популяцией, проведенное в Канаде, дало минимальный показатель в 1/70,358 живых новорожденных с минимальной распространенностью в ~ 1/950,000 (21). Существует, однако, расхождение между показателем SLOS и более высокой распространенностью статуса носителя мутантного аллеля DHCR7. Популяционный скрининг на мутантные аллели DHCR7 указывает на частоту носительства в 3-4% в популяциях белых, что д. давать гипотетический показатель рождения примерно 1/2500-1/4500, если не учитывать потерю плодов (17, 22, 23). Это двухкратное расхождение указывает на то, что настоящий показатель может быть выше из-за нераспознанных выкидышей или неправильных диагнозов у индивидов со слабыми проявлениями (напр., едва различимые физические stigmata, минимальные поведенческие и умственные проблемы). Более легкие формы SLOS теперь описаны благодаря повышенной осведомленности и доступности диагностических тестов (24-27). Тяжелые мутации, такие как гомозиготность по нулевым аллелям, могут приводить к внутриматочной и перинатальной смертности (28-30). Пренатальная смертность в наиболее тяжелых случаях SLOS может достигать 80% (22). Случаи, где женщины страдают от ранних спонтанных абортов, но которые в последствие рожают нормальных детей (которые могут быть дикого типа или гетерозиготами по мутантному DHRC7 аллелю), изучены недостаточно. Т.к. ранние спонтанные аборты не редки, то вообще-то этот паттерн может маскировать настоящие показатели SLOS.

Correa-Cerro and Porter недавно суммировали 105 различных мутантных аллелей рассмотрев 559 опубликованных DHCR7 мутаций (17). 16 новых дополнительных missense мутаций были описаны после этого (31-33). Спектр мутаций при SLOS, по-видимому, согласуется с таковым для большинства др. аутосомно рецессивных нарушений, с миссенс мутациями, объясняющими огромное большинство мутаций и с менее частыми нулевыми мутациями (т.е. frameshift, nonsense или splice-site мутациями). Ряд SLOS случаев (7 опубликованных случаев и 2 случая из неопубликованых данных) был идентифицирован только с одиночной мутацией (1, 3, 34), выявлено с помощью двунаправленного секвенирования PCR amplified кодирующих экзонов и соседних интронных последовательностей. Кстати, всего идентифицирована 121 мутация (685 аллелей) в DHCR7 (Fig. 1). Мутации распределены по всей кодирующей области (экзоны 3-9), включая 105 missense, 5 nonsense, 3 splice-site и 8 нуклеотидных инсерций или делеций. Миссенс мутации составляют ~ 87.6% от общего спектра. 50% missense мутаций располагаются в одном из 9 предсказанных трансмембранных доменов. В нисходящей последовательности наиболее распространенными DHCR7 мутациями, с относительными частотами свыше 4%, является IVS8-1G>C (27.3%), T93M (10.4%), W151X (5.7%), V326L (4.8%) и R404C (4.5%). Эти 5 мутаций приходятся на 50-60% описанных мутантных аллелей. Менее распространенные мутации (показаны красным в typescript, Fig. 1) включают R352W (2.8%), E448K (2.8%), G410S (1.9%), R242C (1.6%), S169L (1.6%) и F302 (1.5%).

Классическая парадигма для патогенеза врожденных ошибок метаболизма включает накопление токсических предшественников и/или дефицит важного продукта, как результат нехватки энзима. В случае SLOS, накопление стероловых предшественников, таких как 7DHC (7DHC имеет 2 conjugated Δ5,7 двойные связи в B-кольце, а cholesterol имеет уникальную Δ5 двойную связь), может быть потенциально токсичным (но это не было продемонстрировано) (35, 36), a дефицит cholesterol почти всегда вреден (37,38), но как дефицит холестерола ведет к дисморфологии еще неясно. Ряд потенциальных популярных механизмов был предложен, таких как нарушение передачи сигналов sonic hedgehog, но ни один из них не привел к какому-либо механистическому пониманию.

Хотя тяжесть фенотипа коррелирует обратным образом с уровнями холестерола в крови и с предсказываемой или измеренной активностью DHCR7, существует значительная фенотипическая гетерогенность у пациентов с идентичными мутациями DHCR7 (34,39-41). Спектр фенотипов SLOS широк и изменчив, от ранней эмбриональной нежизнеспособности до варьирующих уровней тяжести после рождения, включая отличительное лицевое проявление, задержка роста и умственного развития, аутистическое поведение, гипотонию, неспособность к приему пищи, снижение продолжительности жизни и различные структурные аномалии сердца, легких, головного мозга, ЖКТ и почек. Др. факторы в дополнение к генотипу и уровням холестерола и/или 7DHC на момент диагноза также рассматриваются как влияющие на тяжесть клинического проявления. Этими факторами могут быть материнские факторы, которые могут увеличивать снабжение холестеролом развивающегося плода, количество холестерола. которое накапливается в нервной ткани прежде, чем сформируется гематоцефалический барьер, и вообще скорость, с котрой потенциальные токсические предшественники могут накапливаться или удаляться из тканей плода, и еще др. неустановленные генетические и эпигенетические факторы (42-44). Недавно материнский apolipoprotein E (ApoE) генотип оказался участвующим в фенотипической гетерогенности (45). Материнский ApoE2 генотип оказался ассоциированным с тяжелым SLOS фенотипом, тогда как ApoE генотип без E2 аллеля находился в ассоциации с легким фенотипом (45). Однако, т.к. количество матерей с ApoE2/ApoE2 генотипами мало, то некоторые предостережения д. быть высказаны.

Очевидно, что несмотря на кажущийся ограниченный транспорт холестерола мать-плод, тяжело затронутые SLOS пациенты с гомозиготными 'null' мутациями имели обнаружимые уровни холестерола и не всегда имели тяжелый фенотип (40, 46). Недавнее исследование, что DHCR7 транскрипционный сигнал обнаружим в культивируемых фибробластах от пациентов с 'null' мутациями (W151X/IVS8-1G>C) указывает на то, что IVS8-1G>C splice мутация может быть 'leaky' (46,47), феномен, описанный и для др. генетических нарушений (48). Теоретически возможно, что др. энзим может быть способен редуцировать двойную связь C7-8 стеролового предшественника, хотя и на более низком уровне. Имеются существенные аминокислотные гомологичные последовательности между DHCR7 и др. энзимами синтеза стерола или последовательности, которые одинаковы с предполагаемым reductase доменом в таких как sterol D8 isomerase, sterol C14 reductase, lamin B receptor и TM7SR2. Такими reductase мотивами в DHCR7 являются sterol reductase motif 1, SR1, аминокислоты 213-228, GNFFYNYMMGIEFNPR в петле между 4-м и 5-м трансмембранным регионами, sterol reductase 2, SR2, аминокислоты 439-462, LLTHRCLRDEHRCASKYGRDWERY на carboxy terminus (CT) и в 12 аминокислот sterol reductase signature motif, SRSM, аминокислоты 394-405, LLXSGWWGXXRH в 4-й петле, которая содержит сайт связывания для NADPH. Эти мотивы еще д. быть подтверждены экспериментально, но многие из missense

Fig. 1. Mutational spectrum in SLOS. A total of 121 mutations have been reported in DHCR7 in SLOS patients as of June 2005. Missense mutations are found in all coding exons as shown in the upper panel of the figure. The red dots represent mutations in predicted transmembrane domains (TMD) and blue dots for those outside of these regions. Mutations that cause frameshift or premature chain termination are shown below the gene structure. Boxes indicate the most frequent mutations (менее 4%), and those whose frequencies are 1-4% are shown in red typescript. All others have frequencies of менее 1%.

мутаций картируются в этих мотивах - Q224K и R228W располагаются в SR1; R443H, R443C, C444Y, E448K, E448Q, R450L и Y462H в SR2; S397L, R404S и H405Y в SRSM.

Генетически созданы мышиные модели, которые воспроизводят биохимические и фенотипические признаки SLOS. Целенаправленное разрушение Dhcr7 приводит к ранней постнатальной гибели с тяжелыми изменениями метаболизма стерола и радом онтогенетических аномалий (49-51), подтверждающих необходимость в синтезе de novo cholesterol для нормального эмбриогенеза млекопитающих. Хотя ряд нейрофизиологических аномалий, с вовлечением glutamate и serotonin путей, был описан у Dhcr7^-/- мышей (50, 52), остается неясным, вносят ли существенный вклад дефекты нейрального развития в гибель новорожденных Dhcr7 нулевых мышей (49, 50). Чтобы исследовать следствия дефицита холестерола в развивающейся постнатальной ЦНС, мы создали трансгенных мышей, экспрессирующих DHCR7 человека под контролем специфичного для ЦНС промотора nestin. Минимально экспрессируемый трансген на Dhcr7 нулевом фоне вызывает стохастически частичное устранение (12%) гибели новорожденных. Восстановленные Dhcr7^-/- мыши (TgRKO)выживают в течение 3-17 дней после рождения, обнаруживая тяжелую задержку роста и нарушения движений, указывающие на нейрологические дисфункции (53). TgRKO мыши характеризуются выраженным дефицитом холестерола в головном мозге и менее тяжелым в периферических тканях, указывая тем самым, что пищевой холестерол недоступен головному мозгу восстановленных мышей. Дефекты ЦНС, наблюдаемые у TgRKO мышей, включают дилятированную вентрикулярную систему iи ряд структурных дефектов. Хотя общий уровень стерола не снижается в постнатальном головном мозге восстановленных мышей (составляя приблизительно 10% cholesterol и примерно 90% др. предшественников стеролов), но задержка постнатальной миэлинизации и дефектный нейрогенез четко обнаруживаются у TgRKO мышей. В этом контексте условный нокаут squalene synthase (предетерминированная ступень синтеза холестерола) в нейронах или олигодендроцитах вызывает или раннюю постнатальную гибель, обусловленную аномальным нейрогенезом, или преждевременную гибель в результате hypomyelination, это указывает на то. что в нормальной ЦНС синтез cholesterol являет ся критическим для постнатального выживания (54, 55). Установлено, что дефекты ЦНС, связанные с аномальной миэлинизацией и нейрогенезом, вносят существенный вклад в раннюю постнатальную летальность Dhcr7^-/- мышей и может быть важной для тяжести SLOS у людей. Др. заключение в том, что даже небольшие и легкие изменения в метаболизме стеролов головного мозга достаточны для частичного восстановления, это говорит о том, что механизм(ы), участвующие в дисфункции ЦНС могут затрагивать иные механизмы, чем массовая потребность в холестероле в мембранах. Одним таким путем может быть разрушение критического синтеза neurosteroid в ЦНС, путь, подчеркиваемый предварительными исследованиями Shackleton и др. (56).

Др. интересной разработкой является создание гипоморфных мышей, Dhcr7T93M. Мыши, гомозиготные по Dhcr7T93M или гетерозиготные по компаундным мутациям (Dhcr7T93M/null) жизнеспособны, фертильны и обнаруживают нормальный рост. Фенотипически Dhcr7T93M/T93M и Dhcr7T93M/null мыши имеют легкое расширение третьего и латеральных желудочков, а T93M/null мыши имеют синдактилию 2-3 пальцев (57). Жизнеспособность этих мышей позволяет исследовать терапевтические подходы для лечения SLOS.

Сегодня патофизиологические механизмы, связанные с SLOS до конца не выяснены. Наиболее популярная теория, что затронут ключевой морфоген Sonic hedgehog (и родственные ему белки Indian и Desert hedgehog), т.к. этот белок нуждается в ковалентном прикреплении холестерола для регулируемых коротко- и дально-действующих сигнальных процессов (58-61). Shh пост-трансляционный аутопроцессинг (51, 62) и экспрессия в ЦНС и легких не нарушены у Dhcr7^-/- эмбрионов (51), это подкрепляет предыдущие заключения, что предшественники стеролов участвуют столь же эффективно, что и cholesterol в реакции процессинга Shh (58) и могут также замещать cholesterol для структурных потребностей, таких как составные элементы двухслойных мембран (63). С учетом последнего cholesterol является известным важным компонентом липидных платформ мембраны и любые легкие дефекты в формировании платформ должны предположительно изменять сигнальные пути (64, 65). Соотв. композиция холестерола в клеточных мембранах является критической для энзиматической активности, транспорта ионов и метаболитов или общения (channelling), межбелковых и белок-липидных взаимодействий и сигнальной трансдукции. Патогенетические механизмы дефицита холестерола, обусловленные аномальным биосинтезом холестерола, распространяются за пределы нарушения морфогенетических путей. Напр., роль холестерола в нормальном синаптогенезе не зависит от Shh пути (66).

Пренатальная диагностика SLOS, использует повышенный уровень 7DHC, она осуществляется при многих беременностях (67, 68). Увеличение соотношения 7DHC/cholesterol в тканях плода или амниотической жидкости (AF) является диагностическим для SLOS, и описано взятие chorionic villus (CV) на 11-12 неделе беременности (69). Прямая корреляция между уровнем 7DHC в AF и клинической тяжестью SLOS продемонстрирована при 20 беременностях, в конечном итоге, закончившихся SLOS (70). Интересно, что уровни холестерола в AF от плодов с SLOS не существенно отличались от контроля (71), это подтверждает концепцию, что некоторая патофизиология может быть связана с молекулами предшественников холестерола и/или их метаболитов.

Уровни в материнской сыворотке или моче unconjugated estriol (µE3) для скрининга SLOS у плодов беременных - это новый не инвазивный метод ранней диагностики (20). Синтез µE3, связанного с беременностью steroid гормона, зависит от холестерола, продуцируемого тканями плода для синтеза с помощью плаценты. Низкие или не обнаружимые уровни µE3 наблюдаются в моче, амниотической жидкости и сыворотке беременных женщин, несущих плод с SLOS. При беременностях с SLO уровень µE3 в сыворотке матери аномально низкий. Кроме того, использование предшественников стеролов в надпочечниках и гонадах плодов ведет к синтезу аномальных equine-type oestrogens, которые проникают в материнскую плазму и мочу. Эти компоненты обнаружимы при использовании gas chromatography-mass spectrometry (72), хотя этот тест не доступен для рутинного клинического использования. Возможно также. что этот тест может отличать между затронутыми и незатронутыми плодами уже на 12 неделе беременности, когда продукция плодных стероидов резко увеличивается.

Диагностика SLOS с помощью только sonographic обследования плодов не реальна за исключением возможных случаев с тяжелыми уродствами и предыдущей историей о затронутых членах в семье.

Пренатальная диагностика SLOS с помощью молекулярного анализа ДНК, экстрагированной из выборок CV в семьях с известным генотипом была описана (73, 74), хотя высокий риск спонтанных абортов ограничивает её широкое использование.

Не известно случаев излечения SLOS. Хирургическое восстановление физических аномалий, таких как врожденные пороки сердца, расщепление нёба, аномалии гениталий, черепно-лицевые, желудочно-кишечные дефекты и дефекты конечностей. В основном лечение является поддерживающим. Неспособность синтезировать холестерол ведет к предсказуемой недостаточности синтеза стероидов надпочечниками и может требоваться замещение стероидов. Т.к. желчные кислоты также синтезируются из холестерола, то их недостаток ведет к неспособности абсорбировать пищевой холестерол и к дефициту жиро-растворимых витаминов. Добавление холестерола в пищу восстанавливает недостаточность надпочечников и желчных солей. Как только достаточные количества cholesterol превращаются в желчные соли с помощью печени, восстанавливается абсорбция пищевого холестерола. Сбалансированная диета д. гарантировать относительно нормальное снабжение холестеролом эндокринных органов для соотв. синтеза стероидных гормонов. Т.к. надпочечники при SLOS зависят от lipoprotein-поставляемого средства для синтеза cortisol synthesis, то недостаточность надпочечников д. учитываться, когда ребенок обнаруживает длительную болезненность. Внутривенная терапия плазмой описана для случаев, диагностированных antenatally, хотя неясно необходимо ли это и эффективно ли для снижения болезненности и смертности (75). Терапевтические стратегии дачи холестерола с пищей сфокусированы на добавлении экзогенного crystalline cholesterol с помощью различных устройств (т.e. масляной или водной суспензии) в попытке увеличения уровней холестерола в теле и для снижения уровней 7DHC/8DHC, посредством ингибирования петли обратной связи HMG-CoA reductase. Прием пищевого холестерола стал рутинным, хотя не существует контрольных исследований по оценке эффективности и этот вопрос остается нерешенным. Не все дети обнаруживают позитивную реакцию на прием холестерола (76). Реакция на терапию варьирует между пациентами и протоколами. Merkens et al. (77) сообщили, что общий уровень стеролов в плазме, LDL и HDL увеличивается при даче холестерола с пищей. LDL и HDL cholesterol увеличиваются существенно, тогда как концентрации 7DHC или 8DHC в LDL не меняются. Т.к. уровни плазменного холестерола и отношение холестерола к общим стеролам повышается, то достоверное снижение 7DHC не наблюдается. Достоверная негативная корреляция отмечена между уровнями холестерола и 7DHC. Данные показывают, что при наилучшей реакции на пищевой холестерол в терминах уровней холестерола, являются также наинизшие уровни 7DHC, это подтверждается современной практикой добавления холестерола в качестве способа воздействия на SLOS в терминах улучшения биохимического фенотипа и для создания пула холестерола для тарнспорта в ткани.

Др. новой терапией является использование 'statin' лекарств, simvastatin, ингибитора HMG-CoA reductase, с целью блокирования пути синтеза холестерола, чтобы избежать образования больших количеств предшественников стеролов, таких как 7DHC/8DHC, и тем самым ограничить воздействие потенциально токсических метаболитов. Simvastatin может также пересекать гематоэнцефалический барьер и может служить средством для лечения биохимических дефектов в ЦНС пациентов с SLOS (78). Главный эффект statin терапии заключается в усилении транскрипционной активности генов, контролируемых с помощью транскрипционного фактора SREBP, одним из которых является DHCR7. Т.о., если какая-нибудь остаточная активность присутствует в мутантном DHCR7, то усиление его активности может усиливать синтез внутриклеточного холестерола. Использование Simvastatin у SLOS пациентов приводит к парадоксальному увеличению уровней холестерола в сыворотке и цереброспинальной жидкости (79). Обработка мутантных и контрольных фибробластов simvastatin достоверно увеличивает экспрессию DHCR7, независимо от того культивировались клетки в стерол-содержащей или стерол-дефицитрной среде (41). Кстати, сообщения о statin терапии при SLOS ограничены описанием случаев и необходимы дальнейшие тщательно сконструированные испытания на большой серии случаев. Определение остаточной DHCR7 ферментативной активности м. помочь в выборе пациентов SLOS по успешной реакции на статины, т.к. такое лечение теоретически может быть вредным для субъектов с небольшой или отсутствием активности DHCR7 (33, 80).

Наконец, мы предлагаем ещё один способ терапии, непосредственное введение холестерола в ЦНС с помощью инфузии через катетр под низким давлением для лечения одного из клинических проявлений SLOS, которые не поддается прямому воздействию. Умственная отсталость, нарушения поведения и нарушения движения являются главной причиной болезненности. Терапия, нацеленная специфически на этот орган скорее всего будет иметь значительный успех, чем на нормализацию биохимических параметров вне ЦНС. Восстановление адекватных хранилищ холестерола с помощью прямого введения вполне осуществимо, т.к. оборот холестерола в ЦНС очень медленный и его эффект может сохраняться месяцами и даже годами, прежде чем потребуется повторное введение. Токсичность избыточной дозы холестерола д. быть ограничена, т.к. существуют нормальные ЦНС механизмы, регулирующие выход стеролов, остаются интактными в головном мозге. Кроме того, легкая передозировка холестерола может приводить к супрессии пути синтеза стеролов и это делает возможным очистку от предшественников. Наконец, пресыщение cholesterol в головном мозге может позволить ремодирование головного мозга и его нормальное развитие, особенно если это осуществляется как можно раньше после постановки диагноза.