Нормальное функционирование глаз зависит от разнообразных высоко специализированных структур в переднем сегменте глаз. Сюда входят роговица и хрусталик, которые необходимы для рефракции света; радужка. которая защищает сетчатку от избытка света; цилиарное тело и глазные дренирующие структуры, которые предоставляют жидкую влагу, необходимую для питания роговицы и хрусталика и для регуляции внутриглазного давления (Figure 1a-e). Развитие этих тканей требует скоординированных взаимодействий между поверхностной и нейральной эктодермой и периокулярной мезенхимой, которая происходит из neural crest (NC). Неспособность к таким взаимодействиям приводит к многочисленным глазным нарушениям, которые могут быть представлены маленькими глазами (microphthalmia), гипоплазией радужки, polycoria (iris tears) и аномальным паттерном углов камер между роговицей и радужкой; она ассоциирует также с высокими показателями глаукомы [1].

Развитие переднего сегмента глаза зависит собственно от функции двух транскрипционных факторов в периокулярной мезенхиме, forkhead/winged-helix factor FOXC1 и paired-подобного гомеодоменового фактора PITX2. У людей гипоморфные и избыточно активные мутации в любом из генов ведут к Axenfeld-Rieger's аномалии [1], a мутации или Foxc1 или Pitx2 у мышей ведут к дефектному образованию переднего глазного сегмента, сходного с тем, что у людей с Axenfeld-Rieger's аномалиями [2-4]. В то время как нижестоящие мишени FOXC1, экспрессируемые в глазу, предположительно участвуют в модуляции внутриглазного давления и развитии глаз [5], то гены мишени для PITX2 ассоциируют с синтезом внеклеточного матрикса и стабильностью [6]. Напротив, вышестоящие регуляторы и FOXC1 и PITX2 ещё предстоит определить. Более того, качественные особенности клеток, экспрессирующих FOXC1 и PITX2 во время формирования паттерна передней части глаза не ясны.

Возможно, что аберрантное развитие мезенхимных NC вносит вклад в пороки при Axenfeld-Rieger's anomaly. В самом деле, части переднего сегмента глаза, включая эндотелиальные клетки роговицы, collagen-синтезирующие кератиноциты и меланоциты радужки, как полагают, происходят из NC [7-9]. Определенный вклад NC, однако остается спорным. т.к., большинство данных получено на моделях птиц, у которых развитие глаз, по-видимому, слегка отличается от такового у млекопитающих [10]. Более того, механизмы, контролирующие миграцию и дифференцировку глазных NC еще предстоит выяснить. Transforming growth factor β (TGFβ) является кандидатом на роль фактора для контроля за развитием глазных NC-клеток. Передача сигналов TGFβ необходима для генерации многочисленных не-нейральных производных NC [11]. Интересно, что передача сигналов TGFβво время развития глаз является критической, т.к. инактивация лиганда или избыточная экспрессия ведет к дефектам развития глаз у мышей [12,13]. В обоих случаях затрагивается развитие переднего сегмента глаз, возможно в результате нарушения миграции и/или дифференцировки NC. В частности, фенотип после разрушения гена Tgfβ2 рекапитулирует определенные признаки, наблюдаемые у Foxc1 и Pitx2 мутантных мышей. Клеточная роль передачи сигналов TGFβ в развитии глазных NC не известна, однако, и связь между передачей сигналов TGFβ и активацией транскрипционных факторов FoxC1 и Pitx2 в развитии глаз ещё не установлена [12].

Исследование продемонстрировало, что целанаправленная инактивация передачи сигналов TGFβ в NC стволовых клетках нарушает собственно развитие структур, производных NC в глазу, приводя к порокам, сходным с теми, что найдены у людей при Axenfeld-Rieger's anomaly, и к персистенции гиперпластического первичного стекловидного тела (vitreous). Важность индуктивных сигналов от хрусталика для правильного развития переднего глазного сегмента, а также для формирования паттерна сетчатки, предполагалась ещё раньше [21,24]. Мутации в генах, вызывающих аномалии хрусталика и последующее аномальное образование глаз, подтвердили эту гипотезу [25,26]. Мы полагали, что одной из ключевых сигнальных молекул, участвующих в этом процессе, является TGFβ2, которая экспрессируется на высоком уровне в хрусталике на ранних стадиях развития глаз. Среди сигнал-воспринимающих типов клеток, NC-производные клетки играют главную роль в развитии глаз. Согласно ранним исследованиям на модельных птицах, NC клетки вносят вклад в развивающийся передний сегмент глаз [27]. Используя картирование судеб in vivo NC клеток, мы расширили эти находки и для модельных млекопитающих, показав, что NC-производные клетки вносят вклад в формирование глаз уже со стадии глазного пузырька. Позднее, эпителий роговицы, стромальные кератоциты и структуры угла камеры, все они возникают из NC. Кроме того, мы установили вклад NC в первичное стекловидное тело, которое обычно состоит из временной сети сосудов, которые поддерживают внутреннюю часть глаз во время развития. Интересно. что все эти NC-производные ткани не способны собственно развиваться в отсутствие передачи сигналов TGFβ, хотя миграция NC-клеток в формирующийся глаз не нарушена (Figure 9). Более того, мы показали, что транскрипционные факторы, участвующие в развитии передней части глаза являются мишенями для сигналов TGFβ. Очевидно, что глазные аномалии у мутантных мышей обусловлены отсутствием пост-миграторной реакции NC-производных клеток на глазной TGFβ.

Первичное стекловидное тело располагается непосредственно позади хрусталика и содержит hyaloid сосудистую систему ниже NC-производных клеток. Обычно первичное стекловидное тело регрессирует во время созревания постнатальных глаз благодаря тканевому ремоделированию посредством апоптоза и фагоцитоза, в результате формируется безсосудистое, прозрачное вторичное стекловидное тело [17]. У пациентов. страдающих от персистенции гиперпластичного первичного стекловидного тела, сохраняется плотная клеточная мембрана между хрусталиком и сетчаткой. Это врожденное нарушение часто сопровождается катарактами, вторичной глаукомой и разной степени микрофталмией [18,28]. Сходным образом. первичное стекловидное тело в глазах Tgfbr2-мутантных мышей появляется в виде плотной клеточной мембраны, а мутантные глаза меньше, чем у контрольных мышей. Как и у людей в гиперпластичном первичном стекловидном теле [19], персистирует масса из retrolental клеток у Tgfbr2-мутантных мышей, содержащая фибробласт-подобные клетки. пигментированные клетки и сосуды из hyaloid сосудистой системы и пролиферирующих клеток.

Др. мутантные мыши имеют фенотип, сходный с сохранением гиперпластического первичного стекловидного тела, включают мутантов по Arf1, Bmp4 или p53 генам [29-31]. В этой модели, обычная постнатальная регрессия первичного стекловидного тела не происходит и в результате возникают разной степени аномалии, напоминающие сохранение гиперпластического первичного стекловидного тела. Сходным образом, обнаруживается также плотная клеточная масса в задней части глаза, что обнаруживалось также у Tgfb2 нулевых мышей, но это в дальнейшем не было проанализировано [12]. Воздействие на беременных мышей ретиноевой кислотой, которая, как известно, мешает передаче сигналов TGFβ [32], вызывает аномалии, сходные с персистенцией гиперпластического первичного стекловидного тела у потомства [33]. Т.о., мы приходим к выводу, что передача сигналов TGFβ в NC-производных клетках, имеющая место в первичном стекловидном теле важны для тканевого морфогенеза.

В заднем сегменте глаз, развитие сетчатки также нарушается при устранении Tgfbr2 из NC клеток, отдельно от персистенции гиперпластичного первичного стекловидного тела. В частности, мы наблюдали увеличение апоптоза в сетчатке на ст. E15 и нарушение формирования паттерна сетчатки, как видно при гистологическом исследовании и по экспрессии слой-специфических тканевых маркеров (Figure 5f-h). Т.к. нет вклада NC в сетчатку, то этот фенотип возможно обусловлен вторичными, не-клеточно-автономными эффектами. Сохранение плотного первичного стекловидного тела у Tgfbr2-мутантных мышей м. ограничивать передачу инструктивных сигналов от хрусталика к сетчатке, но эти предполагаемые сигналы еще не выявлены.

Помимо дефектов, напоминающих сохранение гиперпластического первичного стекловидного тела все Tgfbr2-мутантные мыши имеют несколько дефектов развития в передней части глаз. Передняя камера глаза отсутствует у мутантов т.к. роговица и хрусталик не смогли разделиться. Более того, нормальное образование цилиарного тела и угла камеры с трабекулярной сетью нуждается в передаче сигналов TGFβ, т.к. эти структуры дефектны у мутантных мышей. Аномалии, присутствующие у Tgfbr2-мутантных мышей характерны для нарушений, обнаруживаемых у пациентов с Axenfeld-Rieger's anomaly [10]. При этом нарушении дисгенез переднего сегмента нарушает регуляцию внутриглазного давления, что часто ведет к развитию глаукомы.

Др. мутантные мыши также м. рассматриваться как модели нарушений развития переднего сегмента глаз. Мыши, гомозиготные по инактивирующим мутациям Pax6, гена кандидата для Peter's anomaly у людей , отсутствие глаз [7]. Гетерозиготные Pax6^+/- мыши имеют дефекты в переднем сегменте глаз, хотя и менее тяжелые, чем те, что найдены у Tgfbr2-мутантных мышей [34,35]. Экспрессия Pax6 в глазах Tgfbr2-мутантных мышей не изменена, однако, (data not shown) предполагается, что их дефекты не зависят от Pax6 модуляции. У людей с Axenfeld-Rieger's anomaly, мутации были обнаружены в генах, кодирующих транскрипционные факторы FOXC1 и PITX2 [1]. Делеция любого Foxc1 или Pitx2 у мышей [2,3] ведет к нарушениям в переднем сегменте глаз, очень сходных с теми. что описаны у мутантов Tgfbr2 в этом исследовании. В глазах Foxc1 экспрессируется в строме и эндотелии формирующейся роговицы и на более поздних стадиях в структурах проспективной трабекулярной сети (meshwork) [2]. Интересно, что эти структуры, экспрессируют Foxc1 зависимым от сигналов TGFβ способом, a Tgfbr2-мутантантные проспективные клетки эндотелия и трабекулярной сети роговицы подвергаются апоптозу, чего не наблюдается в контрольных глазах. Более того, TGFβ усиливает экспрессию Foxc1 в фибробластах и культивируемых глазных тканях, что согласуется с сообщениями о Foxc1 как гене мишени для TGFβ в линиях раковых клеток людей [36]. T. о. имеющиеся данные подтверждают, что исходящие из хрусталика TGFβ сигналы, контролируют жизнеспособность и развитие NC-производной периокулярной мезенхимы, что позволяет возникать эндотелию и трабекулярной сети роговицы путем регуляции экспрессии Foxc1 в этих клетках (Figure 9).

Pitx2 экспрессируется преимущественно в NC-производных клетках стромы роговицы, которые становятся коллаген-синтезирующими кератоцитами. У Tgfbr2-мутантных мышей, однако, клетки стромы роговицы не экспрессируют Pitx2 и , следовательно, не способны развиваться в коллаген-синтезирующие кератоциты. Мутации в гене TGFBR2 человека, как оказалось, вызывают синдром Marfan's, нарушение ассоциированное также с дефектным синтезом внеклеточного матрикса [37]. Следовательно, роговичные NC-производные клетки д. обладать TGFβ-зависимой экспрессией Pitx2 и дифференцироваться в стромальные кератоциты, которые продуцируют коллагеновый матрикс (Figure 9). В подтверждение этой гипотезы, Pitx2 экспрессия строго индуцируется в фибробластах и глазной ткани после активации TGFβ сигнала.

У пациентов с Axenfeld-Rieger's anomaly, которые имели связанные с болезнью мутации в гене PITX2, глазные аномалии сопровождаются дополнительными дефектами, включающими аномалии зубов, избыточностью околопупочной кожи и пороками сердца (всё это обозначается как Rieger's syndrome) [1]. Помимо своей экспрессии в NC-производных клетках формирующихся глаз, Pitx2 экспрессируется и в некоторых др. тканях во время развития, включая зубы, пупок и сердце [23]. В противоположность паттерну мезенхимной экспрессии в глазах, в др. органах экспрессия Pitx2 ограничивается структурами, которые не происходят из NC, но эти структуры и особенно зачатки зубов, окружены или находятся в тесном контакте с производными NC клетками [14]. Несмотря на это, Tgfbr2-мутантные эмбрионы не обнаруживают дефектов зачатков зубов или пупка на ст. E18 (data not shown). Следовательно, зависимые от Pitx2 аномалии у Tgfbr2-мутантных мышей, по-видимому, ограничены глазами, хотя из-за эмбриональной летальности мы не можем установить, имеются ли дополнительные Pitx2-зависимые дефекты на ст. развития позднее, чем E19.

Мы недавно сообщали, что инактивация передачи сигналов TGFβ в NC стволовых клетках также ведет к кардиальным и черепно-лицевым дефектам и аномалиями паращитовидной и тимусной желез, напоминающих синдром DiGeorge у человека [11]. Более того, в зависимости от клеточного контекста, TGFβ способствует приобретению не-нейральной клеточной судьбы в культивируемых NC клетках [38,39]. Всё это служит хорошим доказательством того, что TGFβ является ключевым модулятором не-нейральной дифференцировки пост-миграторных NC клеток во время развития множественных тканей, включая и глаза.

We have shown an extensive contribution of the NC to the developing anterior eye segment and to the primary vitreous. Moreover, proper differentiation of NC-derived ocular cells is TGFβ-dependent (Figure 9). Specifically, we have shown that TGFβ is involved in growth restriction of the primary vitreous and consequently that Tgfbr2-mutant mice suffer from persistent hyperplastic primary vitreous. In the anterior eye segment, anomalies in Tgfbr2-mutant mice are reminiscent of human Axenfeld-Rieger's anomaly. Ocular expression of Pitx2 and Foxc1, which when mutated can cause Axenfeld-Rieger's anomaly, is TGFβ-dependent, suggesting that both transcription factors are involved in mediating TGFβ signaling in ocular cells during development. Interestingly, a report of a family suffering from both Axenfeld-Rieger's anomaly and persistent hyperplastic primary vitreous suggested a common linkage between genes for Axenfeld-Rieger's anomaly and persistent hyperplastic primary vitreous [40]. Thus, our findings may lead to further understanding of the pathophysiology of Axenfeld-Rieger's anomaly and persistent hyperplastic primary vitreous.