Walker-Warburg syndrome (WWS; MIM 236670) назван в честь Walker, который описал первого пациента с lissencephaly (гладким головным мозгом) в 1942 (1), и в честь Warburg, которые предположил его аутосоно рецессивное наследование (2, 3). Пациенты с этим редким нарушением развития имеют продолжительность жизни меньшую от ожидаемой на 3 года (в среднем на 0.8 года). Описаны многочисленные врожденные аномалии, но большинство из них с нарушениями трех структур: мышц, глаз и головного мозга. Такая триада распределения онтогенетических дефектов обнаруживается также при muscle-eye-brain disease (MEB; MIM 253280) и Fukuyama congenital muscular dystrophy (FCMD; MIM 253800), которые вместе с WWS представляют собой группу cobblestone lissencephalies. Клинические признаки WWS наиболее тяжелые, особенно в отношении фенотипа головного мозга, которые диагностируются пренатально (4). Типичные аномалии головного мозга включают гидроцефалию, избыточную миграцию нейронов, приводящую к гладкой (cobblestone) коре, lissencephaly, агенезу corpus callosum, слиянию полушарий, дилятации четвертого желудочка, гипоплазии мозжечка и иногда к occipital encephalocele (Fig. 1) (5). В дополнение к этому пациенты обладают рядом врожденных аномалий глаз, таких как катаракта. микрофталмия, buphthalmus, персистенция гиперпластического первичного стекловидного тела и Peters anomaly. WWS пациенты обладают слабой моторной активностью из-за тяжелой врожденной мышечной дистрофии (2-4). Уровни сывороточной creatine kinase обычно занчительно выше 1000 U/l. Дифференциация между WWS, MEB и FCMD возможна с помощью проверки архитектуры головного мозга с использованием imaging техники, подобной MRI и CT-scanning или путем посмертного исследования (Fig. 1). Структурные дефекты глаз у FCMD пациентов обычно легкие, если присутствуют вообще, это отличает этих пациентов от пациентов с WWS и MEB (5, 6). На базе встречаемости в семье первоначально было предположено, что WWS и FCMD являются аллельными нарушениями (7), но последующий генетический анализ отверг эту гипотезу (5). Было продемонстрировано, что три типа cobblestone lissencephaly отличаются по генетическим причинам, т.к. ряд из

 | Phenotypes of Walker - Warburg syndrome (WWS), muscleeye-brain di sease (MEB) and Fukuyama congenital muscular dystrophy (FCMD). Please note that the severity of the shared characteristics may vary among the three syndromes, usually from severe in WWS to moderate and less severe in MEB and FCMD patients.

WWS семей не был картирован в известных локусах для FCMD в 9q31 и для MEB в 1p34-p33 (8, 9). Ирония, но теперь, когда мы знаем больше о причинных генах cobblestone lissencephaly, стало доказанным, что аллелизм между этими тремя синдромами имеет место, хотя и редко.

Это обычно для редких аутосомно рецессивных нарушений, что большинство случаев возникает в популяциях с высокой долей кровного родства. Ясно одно из попыток картирования гомозиготности для WWS , что это заболевание является генетически гетерогенным (10). Это указывает на то, что WWS является результатом нарушения функции молекулярных комплексов или путей, а не результатом нарушения одиночного гена. Гетерогенность мешает идентификации WWS генов с помощью стратегии позиционного клонирования. По этой причине, функциональный подход к гену кандидату, комбинируемый с направленным картированием сцепления, кажется единственной альтернативой для идентификации генов WWS. Клиническое сходство с MEB, и мнение, что ген POMGnT1 кодирует энзим glycosylation, привело к идентификации первого причинного гена для WWS (10), гена POMT1 на хромосоме 9q34.

Мутации в этом гене объясняют 6/30 WWS пациентов (20%). Дальнейшие доказательства генетической гетерогенности WWS получены благодаря идентификации мутаций в двух др. генах. Гомозиготные nonsense мутации были идентифицированы в гене fukutin в двух неродственных турецких семьях (11, 12). Ген fukutin тестировался в этих семьях, т.к. он является причинным геном FCMD. Огромное большинство FCMD пациентов гомозиготны по легкой founder мутации в японской популяции, которая возникла примерно 3000 тому назад (13, 14). Напротив, WWS fukutin мутации, по-видимому, более тяжелые. Fukutin мутации, по-видимому, вносят очень небольшой вклад в распространение WWS. В нашей серии, только в 3 из 30 consanguineous WWS семьей был картирован этот локус и мутация fukutin идентифицирована только в одной из них (12).

Третий известный WWS ген - это FKRP, который кодирует родственный fukutin белок. Мутации в FKRP были также обнаружены при ряде врожденных мышечных дистрофий с варьирующей тяжестью (15-17). Клинический спектр ассоциированных с FKRP мутаций расширился с открытием гомозиготных missense мутаций у WWS пациентов, выходцев из Пакистана (18). Пациент с типичными признаками WWS ранее был включен в клинический обзор MEB и WWS Cormand et al. (5). И снова мутации в гене FKRP объясняют только маргинальное количество WWS пациентов, т.к. только 2 из 29 consanguineous пациентов в нашей серии обнаруживало гомозиготность по FKRP локусу и мутации были найдены только у одного из них (18).

По нашему опыту причинные мутации трех известных WWS генов обнаружены у 8 из 40 (20%) пациентов (10, 12, 18) (van Reeuwijk, unpublished data). Исследования сцепления по всему геному в необъясненных семьях сейчас проводятся, но количество оставшихся локусов остается неясным. Учитывая отсутствие перекрывания интервалов сцепления между индивидуальными семьями вполне возможно, что три или более генов ещё будут идентифицированы для WWS (van Reeuwijk, unpublished data).

Клинический спектр, возникающий из мутаций генов, участвующих в cobblestone lissencephaly, значительно шире, чем предполагалось ранее. Имеются, по крайней мере, несколько факторов, которые могут объяснить это: (i) функция или ступень O-сцепленного гликозилирования, которое катализируется соотв. белком; (ii) присутствие комплементарных генов; (iii) тяжесть мутаций. Информация о первых двух возможностях будет предоставлена в следующем разделе; здесь же мы рассмотрим третью возможность на примере генотип-фенотипических корреляций.

Наиболее четкие генотип-фенотипические корреляции видны для мутаций в гене fukutin. Японская founder мутация является инсерцией ретротранспозона в 3-kb в 3' UTR, которая снижает уровни мРНК fukutin, но всё ещё способная продуцировать нормальный белок (19). Пациенты, которые гомозиготны по retrotransposon мутации имеют типичный FCMD фенотип. Фенотип значительно более тяжелый в компаундных гетерозиготах, несущих инсерцию в комбинации с nonsense или missense мутацией в др. аллеле (13, 19, 20). WWS является наиболее тяжелым концом фенотипического спектра и вызывается гомозиготными nonsense мутациями в гене fukutin (11, 12).

Более широкий фенотипический спектр наблюдается для мутаций в гене FKRP. Мутации в FKRP впервые были описаны Brockington и др. у пациентов с тяжелой формой врожденной мышечной дистрофии, обозначенной MDC1C (15), и со значительно более легкой limb girdle muscular dystrophy type 2I (LGMD2I) (16). Клиническое проявление мышечной дистрофии у LGMD2I пациентов довольно изменчиво, гомозиготные носители мутации FKRP могут быть безсимптомны в старческом возрасте (21). Клиническая вариабельность обнаруживается также на тяжелом конце спектра. Были описаны пациенты с тяжелой врожденной мышечной дистрофией и умственной отсталостью, кистами в мозжечке и др. аномалиями мозжечка (17). Постепенно мутации FKRP были идентифицированы при более тяжелых MEB и WWS фенотипах. Генотип-фенотипические корреляции не очевидны для FKRP мутаций, которые были найдены при разных нарушениях. Большинство FKRP мутаций связано с аминокислотными заменами и их функциональные последствия трудно предсказуемы из-за отсутствия знания о функции FKRP белка. В некоторых примерах эффекты missense мутаций могут быть выведены из ассоциированных фенотипов. Напр., гомозиготные мутация в FKRP (Tyr307Asn), которая обнаружена у MEB пациента, была ранее обнаружена в гетерозиготном состоянии у пациентов, страдающих от LGMD2I. Менее тяжелая мутация во втором аллеле, Leu276Ile, является широко распространенной мутацией у пациентов с LGMD2I и часто обнаруживается в гомозиготном состоянии, вызывая у них относительно легкую форму LGMD2I. Напротив, пациент с компаундной гетерозиготностью по мутациям Tyr307Asn и Leu276Ile страдал очень тяжелой LGMD2I и помер в позднем подростковом возрасте, это указывает на то, что Tyr307Asn мутация наиболее вредна для функции FKRP, чем Leu276Ile (18).

Финальный пример фенотип-генотипических корреляций связан с мутациями в гене POMGnT1. MEB наиболее распространена в финской популяции из-за founder мутации в гене POMGnT1 (22). Недавно, Toda и др. сообщили о довольно широком клиническом спектре, ассоциированном с мутациями гена POMGnT1, которые были идентифицированы у пациентов со всего мира. Мутантный POMGnT1 фенотип варьирует от тяжелой FCMD до MEB и до WWS-подобного фенотипа, который менее тяжелый, чем классический WWS. Легкая корреляция наблюдается между клинической тяжестью фенотипа головного мозга и локализацией мутаций в этом гене. Мутации вблизи 5'-конца POMGnT1 - кодирующей области имеют тенденцию обнаруживать более тяжелые аномалии головного мозга, включая гидроцефалию, по сравнению с пациентами с мутациями более нижестоящими, они не имели гидроцефалии (Fig. 3). Не обнаружено различий для скелетных мышц, в которых (in bothca ses) окрашивание α-dystroglycan (α-DG) сильно редуцировано (23). Как мы видели, мутации в трех генах, участвующих в cobblestone lissencephaly, дают широкий фенотипический спектр с или без четких генотип-фенотипических корреляций (Figs 2 and 3). Мы полагаем, что легкие мутации в POMT1 могут давать клинически более легкие нарушения, такие как MEB или FCMD. В самом деле, всё ещё имеются некоторые пациенты без мутаций в генах POMGnT1, fukutin или FKRP. Клиническую вариабельность предстоит еще изучить

 | Fig. 2. Overview of the genotype-phenotype correlation seen in the cobblestone lissencephalies. The mutations in the genes resulting in the different disorders are depicted by ю (rare) and юю (common). The Largemyd mouse phenotype resembles a muscle-eye-brain disease (MEB)/Fukuyama congenital muscular dystrophy (FCMD) phenotype in humans represented by an asterisk (*). POMGnT1 mutations have been found in patients diagnosed as mild Walker-Warburg syndrome (WWS) and severe FCMD, because their phenotypic characteristics precluded an unequivocal classification into either of these categories.

для мутаций LARGE гена. Компаундные гетерозиготные мутации у людей по гену LARGE были идентифицированы у одного пациента с новым типом врожденной мышечной дистрофии (MDC1D) и тяжелой умственной отсталости (24). Интересно, Large^myd мыши, которые несут внутригенную делецию экзонов 4-7 в гене LARGE, имеют фенотип, который очень сходен с фенотипами FCMD, MEB и WWS у людей (25-27).

Ген POMT1 выбран в качестве функционального кандидата для WWS, из-за его ожидаемой роли

 | Fig. 3. Schematic representation of the proteins involved in cobblestone lissencephalies. The type and position of the mutations found for each of the disorders is indicated: the colours represent the different disorders and the symbols represent the different kind of mutations following the code given in the box at the right. Compound heterozygosity (ch) is only indicated when associated with an intermediate phenotype. Note that the same missense mutation in POMGnT1 (E223K) in combination witha truncating mutation at the 5 0 end (F149fs) gives rise to a more severe phenotype than in combination with a truncating mutation at the 3 0 end (IVS17ю1G>T/A). Protein domains are: PMT, protein mannosyl transferase domain; GnT-1, N-acetylglucosaminyltransferase domain; MIR, mannosyltransferase-IP3R-RyR domain; SS, signal sequence; TM, transmembrane domain; DxD, Asp, Xaa, Asp motif.

в пост-трансляционном O-linked glycosylation α-DG (10). Сегодня имеется достаточно доказательств, которые показывают, что отсутствие O-сцепленного гликозилирования α-DG является ключевым дефектом при WWS и др. первая линия доказательств - это генетика. POMT1 как полагают катализирует первую ступень в O-сцепленном mannosylation белка, переносе mannosyl остатка с dolichyl phosphate mannose на сериновый или треониновый остаток в белке мишени (34, 35). POMGnT1 обеспечивает вторую ступень путем добавления N-acetylglucosamine остатка к предсуществующей в белке O-linked mannose (36). Белок α-DG является единственным известным субстратом для этого типа glycosylation у млекопитающих. Вторая линия доказательств получена с помощью иммуногистохимического и функционального анализа α-DG в материале, полученном от пациентов и модельных животных. Имеется множество сообщений о сильной редукции или отсутствии гликозилирования α-DG в материале от пациентов с WWS, MEB, FCMD и родственными врожденными мышечными дистрофиями (10,15-17, 24, 27, 37-42). Кроме того, было продемонстрировано, что специфичная для головного мозга делеция α-DG вызывает множество нарушений головного мозга, которые встречаются также при WWS, включая дизорганизацию кортикальных слоёв, слияние полушарий головного мозга, непрерывную pial поверхность и аномальную миграцию пост-митотических нейронов (26). Наконец, также Large^myd мыши обнаруживают изменения гликозилирования α-DG (25, 27, 43).

DG играет ключевую роль в образовании мостиков между цитоскелетом клеток и белками extracellular matrix (ECM). DG состоит из двух субъединиц, α-DG и β-DG, которые получаются в результате протеолитического расщепления белка предшественника, кодируемого одним геном, DAG1. DG соединяет цитоскелет с ECM в ряде тканей. В мышцах dystrophin соединен с актиновым цитоскелетом и связывает трансмембранный β-DG. Внеклеточный домен β-DG соединяется с ECM путем соединения с α-DG, который в свою очередь, соединяется с Laminin-2 (44)(Fig. 4). Гипогликозилирование α-DG в мышцах приводит к потере взаимодействия этого белка с белком ECM laminin-2 и тем самым нарушается связь между сарколеммой мышцы и ECM (45-47). Предсказываемый мол. вес α-DG белка примерно 72kDa. Однако, на immunoblots белок α-DG protein мигрирует в виде диффузной полосы из 150-200 kDa, что отражает обширные пост-трансляционные модификации белка. Увеличение мол. веса в основном объясняется экстенсивным гликозилированием. Происходит N-сцепленное и O-сцепленное гликозилирование. Уровни и типы гликозилирования скорее всего зависят от типа ткани, на что указывают разные мол. веса. Общая структура glycan - Sialyla2,3Galb1,4GlcNAcb1,2Mana-O-Ser/Thr- представляет центральную mucin область α-DG, происходящую из разных источников (48-50). Sialyla2,3-Galb1,4GlcNAc часть цепочки сахара необходима для соединения α-DG c laminin (49, 51, 52).

 | Fig. 4. Schematic representation of the crucial role of dystroglycan (DG) in connecting the cytoskeleton of muscle cells with the extracellular matrix. This binding is disrupted by defects in the post-translational modification of α-DG, causing congenital muscular dystrophy. The O-mannosylation is represented by small orange spheres. The composition of these carbohydrate side chains and the enzymes that catalyze the addition of these sugar groups are shown in the right panel. Disrupted O-mannosylation of α-DG is seen in Walker-Warburg syndrome (WWS) and muscle-eye-brain disease (MEB) patients withmutations in the POMT1 and POMGnT1 genes, respectively, which encode the enzymes for the first two steps which cause MEB and WWS when malfunctioning. Similar glycosylation defects are seen in patients withmutations in the Fukutin, FKRP and LARGE gene, but the role of the corresponding proteins is not known.

Используя антитела, которые распознают углеводный эпитоп, было продемонстрировано, что пациенты с cobblestone lissencephaly разных типов (WWS, MEB и FCMD) имеют не обнаружимые уровни нормально гликозилированного α-DG в скелетных мышцах. Напротив антитела против стержневого пептида могут выявить остаточные количества α-DG белка.

Этот очевидный дефект гликозилирования α-DG очень сходне в разных синдромах. Мышечный α-DG обнаруживает снижение примерно до 50 kDa у FCMD и MEB пациентов, а также у Large^myd мышей. Возможно, неспособность к гликозилированию на любом уровне оказывает один и тот же глобальный эффект на общее гликозилирование α-DG. В согласии с этим и находка, что у дрожжей O-mannosylation м.б. предварительным условием прежде, чем произойдет N-гликозилирование (53).

Недавние исследования продемонстрировали, что избыточная экспрессия эндогенного LARGE у Large^myd мышей уменьшает мышечную дистрофию путем восстановления гипогликозилирования α-DG. Кроме того, избыточная экспрессия LARGE в клетках от пациентов с MEB, FCMD и WWS также ведет к нормализации функционально гликозилированного α-DG, указывая тем самым, что LARGE м. компенсировать генетически отличающиеся дефекты в этих клетках. Эти данные показывают возможную регуляторную роль LARGE в гликозилировании α-DG (54). Установлено, что молекулярное взаимодействие LARGE и N-терминального домена α-DG является критическим для O-сцепленного гликозилирования α-DG mucin домена (55). Однако, ещё неясно, как избыточная экспрессия LARGE м. функционально компенсировать генетические дефекты в клетках от MEB, FCMD and WWS пациентов (54).

Наш анализ сцепления по всему геному на 15 consanguineous WWS семьях подчеркнул существование, по крайней мере, трех дополнительных локусов WWS (10)(van Reeuwijk, unpublished data). Нашими первичными целями явились др. компоненты пути O-mannosylation и гены, как известно, вызывающие гипогликозилирование α-DG. Прекрасным кандидатом является ген LARGE. Как обсуждалось выше Large^myd мыши имеют измененное гликозилирование α-DG и фенотип, который очень сходен с таковым у людей с MEB и WWS (25-27, 43). POMT2 является др. возможным геном кандидатом, обладая 36% идентичными аминокислотами с POMT1. Оба гена экспрессируются в большинстве тканей человека, но POMT1 экспрессируется в основном в головном мозге скелетных мышцах и тестисах плодов, тогда как POMT2 обнаруживает наивысшую экспрессию в тестисах (34, 56). У Drosophila melanogaster, ортологи человеческих генов POMT1 и POMT2 обусловливают фенотипы rt (rotated abdomen) и tw (twisted). Эти мутанты мух обнаруживают сходный фенотип с ротацией почти на 90% абдомена в результате дефектов развития мышц. Кроме того мутантные мыши обнаруживают понижение плодовитости и жизнеспособности (57, 58). Др. аргументом за возможную роль POMT2 в WWS является то, что ко-экспрессия обоих POMT1 и POMT2 необходима для достижения ферментативной активности POMT (59). Этот результат указывает на то. что формируется гетерокомплекс между двумя белками во время их синтеза, сходный с тем. что наблюдается для гомологичных PMT1 и PMT2 белков (60, 61). Несмотря на эти теоретические рассуждения, не было идентифицировано мутаций POMT2 среди 30 неродственных WWS семей (10). Геном человека содержит два др. гена с некоторой гомологией с POMT1: SDF2 и SDF2L1. Подобно POMT1/2, эти два гена кодируют MIR домен типичных mannosyltransferases, но не каталитический mannosyltransferase домен.

Первые две ступени O-mannosyl glycan синтеза α-DG, как известно, нарушаются при cobblestone lissencephalies с помощью мутаций в генах POMT1 и POMGnT1. Вполне возможно, что нарушения др. ступеней этого процесса гликозилирования будут двать сходный фенотип. Добавление β1,4-galactosyl (ступень 3) и добавление α2,3-sialyl (step 4) обеспечиваются энзимами β1,4-galactosyltransferase (β4GalT) и α2,3-sialyltransferase (ST3Gal), соотв. Мутации сдвига рамки считывания в β4GalT1 участвуют во врожденных нарушениях гликозилирования типа IId (CDGIId; MIM 607091). Такие пациенты имеют микроцефалию, обусловленную Dandy-Walker malformation, гипотонию, coagulopathy, миопатию с повышенной creatine kinase, легкую задержку развития, моторную задержку и аномальный сывороточный transferrin, из которого потеряны остатки sialic acid и galactose (62). Энзим GNE, как известно, катализирует скорость-ограничивающую ступень биосинтеза sialic acid, а его дефекты вызывают несоотвествующее sialylation гликопротеинов (63). Недавно GNE мутации удалось связать с гипогликозилированием α-DG у пациентов с наследственной inclusion body myopathy (MIM 600737), аутосомно рецессивным нейромышечным нарушением, характеризующимся прогрессирующей мышечной слабостью (64, 65). Хотя необходимо дальнейшее подтверждение этому, но оно указывает, что все энзимы, вовлеченные в O-гликозилирование α-DG являются кандидатами на вовлечение в нейромышечные нарушения.

Белки мишени для O-mannosylation д. также рассматриваться на предмет участия в cobblestone lissencephalies. Сегодня единственным известным O-mannosylated белком является α-DG. Мы секвенировали всю кодирующую область α-DG у 11 связанных WWS пациентов но не нашли мутаций (van Reeuwijk, unpublished data). Др. белки мишени для O-mannosylation могут существовать, но их трудно обнаружить, т.к. нет распознаваемого мотива в белках, которые являются мишенями для O-mannosylation у дрожжей. Др. белки из DGC комплекса (Fig. 4), связанные с или присутствующие в ECM мышц, ЦНС и нейромышечных соединений являются возможными кандидатами на роль генов WWS. Важным лигандом для α-DG в ECM мышц является Laminin-2 (merosin), мутации которого вызывают MDC1A (MIM 607855), широко распространенную форму CMD и клинически сходную с FCMD.

In the past few years, hypoglycosylation of α-DG has been found to be the mechanism linking several neuromuscular diseases. This list includes WWS, MEB, FCMD, MDC1C, MDC1D, LGMD2I and some intermediate phenotypes (Fig. 2). Of these, WWS shows the most severe clinical features including CMD, severe brain and eye involvement. It has been shown that mutations in POMT1, fukutin and FKRP may each give rise to WWS. Knowing that mutations in most of the genes involved in WWS and related disorders show a wide clinical range, mutations in POMGnT1 and LARGE should also be sought in WWS patients. In view of the genotype–phenotype correlation, we also hypothesize that mild mutations in POMT1 might cause MEB or even FCMD. It has been shown that POMT1 and POMGnT1 are responsible for the addition of an O-linked mannose and a GlcNAcb1,2 residue, respectively, to α-DG (36, 59). Elucidation of the exact function of fukutin, FKRP and LARGE in O-mannosyl glycan synthesis could lead to further candidate genes for WWS. For this, a better understanding of the post-translational modification of α-DG will be crucial. Genomewide homozygosity mapping in consanguineous WWS families may lead to the identification of further genes involved in these disorders. The genetic heterogeneity in WWS and related disorders imposes some difficulties for diagnostic studies and genetics counselling. Presently, mutation analysis for POMT1 and POMGnT1 is available in a diagnostic setting (http://www. dnadiagnostieknijmegen.nl), and we emphasize to include the other cobblestone lissencephaly genes in the future. Recently, enzymatic assays have been described to test the activity of POMT1 and POMGnT1 and to diagnose for the founder mutation in FCMD (59, 66, 67). These tests in combination withmutation analysis of the known cobblestone lissencephaly genes should allow prenatal diagnosis in selected families.