Щелевые соединения, формируемые коннексинами (Cx), являются трансмембранными каналами, делающими возможным обмен малыми молекулами (M_r ~ 1000 Da), такими как метаболиты, ионы и вторичные мессенджеры между контактирующими клетками. Такого типа межклеточные сообщения являются критическими для поддержания нормальных клеточных и тканевых функций (Goodenough et aL, 1996). Щелевые соединения формируются семейством белков, наз. коннексинами из ~ 20 разных членов у человека (Willеске et al, 2002). Мутации генов коннексинов сцеплены со многими болезнями человека, включая болезни с дефектом миэлинизации, такие как Charcot-Mane-Tooth болезнь (Cx32) (Ressot and Bruzzone, 2000), Pelizaeus-Merzbacher-like disease (Cx47) (Orthmann-Murphy et aL, 2007), врожденная сенсоронейральная потеря слуха (Cx26, Сх30, Сх30.3) (Petit et aL, 2001) и oculodentodigital dysplasia (ODDD) (Cx43) (Paznekas et aL, 2003).

Глазные хрусталики, свисающие с ciliary тел, содержат популяцию стволовых клеток, которая продолжает пролиферировать и дифференцироваться в течение всей жизни организма (Berry et aL, 1999; Mathias et aL, 1997). Волокна в центре хрусталика купированы с клетками хрусталиковой поверхности посредством посредством хорошо развитой обеспечиваемой щелевыми соединениями сети межклеточных сообщений. Эта хорошо развитая сеть жизненно важна, поскольку она облегчает обмен ионами и метаболитами по всему безсосудистому хрусталику, поддерживает осмотический и метаболический гомеостаз и в конечном счете прозрачность хрусталика (Goodenough, 1992). Три коннексина были идентифицированы в хрусталиках млекопитающих, Cx43, Cx46 and Cx50, из которых Cx43 специфичен для эпителия хрусталика, тогда как Cx46 и Cx5O преимущественно ко-локализуются в хрусталиковых волокнах и формируют гетеромерные коннексоны (Jiang and Goodenough, 1996). Физиологическое значение хрусталиковых щелевых соединений было установлено благодаря идентификации мутаций коннексинов, сцепленных с врожденной катарактой хрусталика у человека и фенотипическими отклонениями хрусталликов у connexin-дефицитных мышиных моделей. Множественные мутации Cx46 и Cx5O были идентифицированы, которые непосредственно связаны с аутосомными врожденными катарактами человека (rev. Gerido and White, 2004). Среди этих мутаций, Cx5O missense мутация E48K в первом внеклеточном петлевом домене впервые была картирована с помощью анализа сцепления в трех поколениях семейства из Пакистана с аутосомно доминантными катарактами (Berry et aL, 1999). Функциональные свойства Cx5O E48K, которые могут вносить вклад в катаракты хрусталиков, не были охарактеризованы.

В моделях генного нокаута мыши, лишенные любого из специфичных для волокон коннексинов, Cx46 или Cx50, дают катаракты хрусталиков (Gong et aL, 1997; Rong et aL, 2002; White et al, 1998). Однако только Cx50-дефицитные мыши формируют маленькие глазки, определяемые как микрофталмия (Rong et aL, 2002; White et aL. 1998). и обнаруживают задержку созревания хрусталиковых волокон (Rong et aL, 2002). Ранее нами было показано, что только куриный (ch) Cx5O стимулирует дифференцировку хрусталиковых волокон из эпителиальных клеток и экспрессию основных маркеров дифференцировки. Два др. типа хрусталиковых коннексинов не делают этого (Gu et aL, 2003). Этот стимулирующий эффект, по-видимому, не зависит от межклеточных связей (Banks et aL, 2007). Эти исследования предоставили убедительные доказательства, что Cx5O функционально участвует в развитии хрусталика и дифференцировке его волокон.

Будучи экспрессированным в ооцитах (Beahm and Hail, 2002; Srinivas et aL, 2005; Srinivas et al, 2006) и клетках HeLa(Valiunas and Weingart, 2000), Cx50 не только формирует щелевые соединения, но и также полуканалы, несопоставленные половинки щелевых соединений, которые формируют крупные поры во внеклеточную среду. Морфологические исследования также подтвердили возможное существование полуканалов в хрусталиковых волокна in situ (Zampighi, 2003). Cx46 полуканалы являются механочувствительными и как полагают способствуют аккомодации хрусталика, предоставляя путь для объемного потока при изменении хрусталиком формы(Bao et aL, 2005).

Здесь мы охарактеризовали функциональные свойства Cx50 E48K, мутации, сцепленной с врожденной катарактой у человека. Мы показали, что у мутантов Cx50 E48K не образуется функциональных щелевых соединений, но возникает доминантный негативный эффект, когда он ко-экспресируется или спаривается с дикого типа Cx50, но не Cx46. Более того, эта мутантная форма экспрессируется на клеточной поверхности и формирует функциональные полуканалы, сходные с таковыми дикого типа Cx50. Кроме того, chCx5O E48EC способствует дифференцировке способом, сравнимым с таковым у chCx50 дикого типа. Эти результаты указывают на то, что Cx50 E48K остаток в первом внеклеточном петлевом домене участвует в формировании щелевого соединения, но не функционировании полуканала. Нарушение клеток хрусталика связано с доминантно негативной функцией E48K, это, скорее всего. и лежит в основе механизма развития катаракты.

Cx50 E48K полуканалы формируются на клеточной поверхности и ведут себя как дикого типа Cx50. Их функция сходна с таковой полуканалов дикого типа. Кроме connexins, pannexins также могут формировать полуканалы (Scemes et al., 2007). Мы не смогли исключить возможности, что pannexin-формируемые полуканалы активируются за счет экспрессии Cx50. Однако функциональные полуканалы сами по себе недостаточны для поддержания прозрачности хрусталика, независимо от того, формируются они connexins или pannexins. Вызывающий катаракту мутант, N63S по Cx46, обнаруживал пониженную способность формировать функциональные полуканалы, когда экспрессировался в в ооцитах Xenopus (Ebihara et al., 2003; Pal et al., 2000). Эта мутация давала полуканалы с повышенной чувствительностью к magnesium по сравнению с дикого типа Cx46 (Ebihara et al., 2003). Напротив N63Q мутант по Cx46 был неспособен продуцировать функциональные полуканалы. Кроме того, мутация сдвига рамки считывания S380Qft по Cx46 вызывала неспособность формирования полуканалов в ооцитах Xenopus(Pal et al., 2000). Однако во всех приведенных выше исследованиях тип нарушения (щелевое соединение или полуканал), который вносит вклад в формирование катаракты не был выявлен.Наши результаты демонстрируют, что дефицит щелевых соединений может вызывать образование катаракт, тогда как присутствие функциональных полуканалов не достаточно для поддержания прозрачности хрусталлика. Т.к. чувствительность к кальцию и проницаемость для краски полуканалов, по-видимому, оставались неизменными при мутациях, мы не можем исключить др. свойств, которые могут быть изменены, такие как чувствительность к эндогенным модуляторам или проницаемость для цитоплазматичеких молекул. Эти изменения могут вносить вклад в развитие катаракты. Остаток E48K высоко консервативен в Cx50 среди видов животных, это указывает на то, что этот остаток в коннексине играет важную роль в установке и формировании функциональных гомотипических Cx50 каналов щелевых соединений.

Предложено несколько линий доказательств тесных функциональных взаимоотношений между Cx46 и Cx50. Knockin по локусу Cx46 устраняет Cx50 тяжелую катаракту, вызванную мутацией G22R в Cx50 (Xia et al., 2006b). Хотя мутанты Cx50(G22R) неспособны обеспечивать коммуникации с помощью щелевых соединений, но ко-экспрессия с Cx46 частично восстанавливает проведение через соединения, это подтверждает гипотезу, что мутантный G22R взаимодействует с дикого типа Cx46, чтобы сформировать функциональные каналы и устранить дефекты хрусталика. Дефекты хрусталика, вызываемые S50P мутацией в Cx50 корректируются у Cx50^S50P/-Cx46^+/+ мышей, которые лишены Cx50 дикого типа (Xia et al., 2006a). Смешанная экспрессия Cx50^S50P мутанта или с дикого типа Cx50 или с Cx46 дает функциональные гетеромерные каналы щелевых соединений и полуканалы (DeRosa et al., 2007). Эти исследования иллюстрируют тесные функциональные взаимоотношения между Cx46 и Cx50 в хрусталиках. В противовес предыдущим наблюдениям, что мутация Cx50^E48K функционирует только доминантно негативным способом с Cx50 дикого типа, но не с Cx46, когда ко-экспрессируется в той же самой клетке (heteromerically), или оппозитных клетках (heterotypically). Это делает E48 уникальным остатком, ответственным за избирательное соединение Cx50 полуканалов.

Cx50E48K мутантный белок обладает сравнимой способностью способствовать дифференцировке клеток хрусталика как и белок дикого типа Cx50. Это согласуется с нашими предыдущими находками, что мутанты, которые неспособны формировать функциональные щелевые соединения стимулируют дифференцировку клеток хрусталика сходным образом, что и дикий тип (Banks et al., 2007). Это подтверждает гипотезу, что поверхностная экспрессия Cx50, и его C-терминального домена является сигнальной платформой дифференцировки в отсутствие образования щелевых соединений. В терминах этиологии катаракт хрусталика было предположено, что отводится важная роль щелевым соединениям в создании `путей микроциркуляции' для питательных веществ и отходов для безсосудистого хрусталика (Donaldson et al., 2001; Mathias et al., 1997). Однако др. модели предполагают роль клеток хрусталиковых волокон и ток материалов через мембрану. Нет определенных доказательств для различия между этими моделями. Однако тот факт, что мутация Cx50 неспособна формировать щелевые соединения, но всё ещё способна давать полуканады, которые неотличимы в отношении пропускной способности и проницаемости по сравнению с каналами дикого типа, строго подтверждает, что функция полуканалов недостаточна, чтобы предупредить образование катаракты. Т.о., полученные результаты строго подтверждают роль межклеточных коммуникаций посредством щелевых соединений для поддержания прозрачности хрусталика.